強磁場NMRのタンパク質・固体材料への適用

(1)

強磁場NMRの

タンパク質・固体材料への適用

九州・西日本支部 2006年度総会・講演会 2006年4月28日

九州大学ベンチャービジネスラボラトリー

木吉司

物質・材料研究機構

強磁場共用ステーション

(2)

１． NMR （核磁気共鳴）

原理

強磁場化のメリットと重要性

２． NMR マグネットの特徴

磁場の均一化・安定化強磁場化の問題点

３． NMR のタンパク質・固体材料への適用

タンパク質固体材料

４．まとめ

(3)

１． NMR （核磁気共鳴）

原理

２． NMR マグネットの特徴

３． NMR のタンパク質・固体材料への適用

４．まとめ

(4)

磁気モーメントを持つ原子核が対象

Δ E は磁場（B）に比例して増加するため、共鳴周波数ν ^{も磁場に比例}

B = 2.35 Tの時、ν = 100 MHz （¹H原子核の場合）

原子核の磁気モーメントの方向はランダム

磁気モーメントの方向は磁場に平行と反平行磁場に反平行

磁場に平行

外部磁場なし外部磁場あり

γ B h ν

ΔE = = h

磁化 M = 0 磁化 M

外部磁場あり

共鳴磁気緩和

磁場に反平行

磁場に平行 RFパルス照射

共鳴周波数ν

磁化 M が瞬時に変化

外部磁場あり

磁場に平行

熱平衡状態へ磁化 M が時間的遅れをもって変化照射終了

NMR (Nuclear Magnetic Resonance, 核磁気共鳴)

周波数フーリエ変換

(5)

原子核の磁気モーメント

核種スピン 1T での共鳴周波数

(MHz)

相対感度絶対感度

（相対感度×天然存在比）

1H 1/2 42.58 1 1

2H 1 6.39 9.65×10^-3 1.45×10^-6

3H 1/2 45.43 1.21 0

13C 1/2 10.71 1.59×10^-2 1.76×10^-4

14N 1 3.08 1.01×10^-3 1.01×10^-3

15N 1/2 4.31 1.04×10^-3 3.85×10^-6

17O 5/2 5.77 2.91×10^-2 1.08×10^-5

19F 1/2 40.05 8.33×10^-1 8.33×10^-1

31P 1/2 17.24 6.63×10^-2 6.63×10^-2

1H原子核のNMRが最も普及

NMRスペクトロメータの発生磁場を

1H原子核の共鳴周波数で表現（1 GHz = 23.487 T）

(6)

NMRとノーベル賞

核磁気共鳴法の開発とそれによる諸発見 ( 物理学賞 ) (1952, F. Bloch, E. M. Purcell)

高分解能の核磁気共鳴分光法 ( 化学賞 ) (1991, R. R. Ernst)

溶液中の生体高分子の立体構造決定のための核磁気共鳴分光法の開発 ( 化学賞 )

(2002, K. Wüthrich)

核磁気共鳴画像法の発見 ( 生理学・医学賞 )

(2003, P. C. Lauterber, P. Mansfield)

(7)

超伝導マグネット＋プローブプリアンプ

コンソールワークステーション

NMRを利用した代表的機器

東芝メディカルシステムズEXCELART

核磁気共鳴イメージ（MRI）磁場を空間内で意図的に傾斜

それぞれの場所での原子核の空間的分布

NMRスペクトロメータ磁場は空間内で均一分子内の結合の情報

周波数

シグナル

国内での稼働台数：> 5000 台

国内出荷台数：> 3000 台

(8)

NMRによる構造解析

CH₃CH₂OH

（エチルアルコール）

C C

Hα O Hγ

Hα

Hα Hβ

Hβ

化学シフト

化学的環境による原子核での磁場の差

外部磁場に比例

信号

信号の周波数 ^Hz

Hγ

Hβ Hα

シグナルの分裂（スピン結合）

隣のスピンが平行か反平行か

外部磁場に依存しない

(9)

強磁場にする効果

分解能向上

個々の線幅は磁場に依存しない

スペクトル全体の幅は磁場とともに拡大

→信号の分離が容易

信号の高さ

300 MHz (7.0 T)

信号の高さ

周波数 750 MHz

(17.6 T)

1 GHz…?

(23.5 T)

感度向上

得られる信号強度は磁場の約1.5乗に比例

→測定時間短縮微量試料の測定

分子量の増加

（構造生物学）

測定核種の増加

（固体NMR）

(10)

磁場の空間的均一性・時間的安定性

化学シフト：¹Hの場合20 ppm以下シグナルの分裂：～0.5 Hz

⇒ 0.5 ppb !!（1 GHz）

試料空間内で極めて高い磁場の均一度が必要

微弱な信号

多数回の積算によるS/N比の向上

極めて高い磁場の時間的安定度が必要

(11)

１． NMR （核磁気共鳴）

原理

３． NMR のタンパク質・固体材料への適用

４．まとめ

(12)

NMRマグネットの特徴

磁場均一度・安定度の条件強磁場ほど厳しくなる高分解能NMRスペクトロメータ

磁場均一度：0.5 Hzのスペクトル分解能磁場安定度：0.1 Hz/h以下

10 mm

20 mm

1 Hz = 2.35×10^-8 T (¹H)

NMRマグネット

磁場均一度： < 100 Hz / 試料空間磁場安定度： < 10 Hz / h

長時間運転

～ 10 年間

長期間信頼性冷却システム

プローブ

コンソールワークステーション

NMRスペクトロメータの構成

超伝導マグネット

（外部磁場を発生）

試料

(13)

磁場均一度・安定度向上の仕組み

超伝導マグネット主コイル：軸長長く

補正コイル：z², z⁴, z⁶ …→ 0 電流逆向きの場合

シムコイル：軸、径方向微調整 z¹, z², x, y, zx, zy, x²-y²,xy…

すべて永久電流モードで運転主コイルはすべて直列接続

z

均一度： < 100 Hz / 試料空間安定度： < 10 Hz/h

室温シム

均一度最終調整 z⁰, z¹, z², z³, z⁴, x, y, x²-y²,xy…

NMRロック

NMRシグナル（²H）で磁場を補正

(14)

磁場均一度

0.4 0.5 0.6 0.7 0.8

0.80 0.85 0.90 0.95 1.00

ファブリのF 係数

コイル長 (m)

-250 -200 -150 -100 -50 0

at z = ±0.01 m

a₁ = 0.0375 m

a₂ = 0.065 m 2 z項による磁場変化 (ppm)

-0.5 0.0 0.5

-0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8

(m) (T)

(m)

1520 mm

実績：平角線のレアー巻きがベスト

パンケーキ巻線：スタック時のずれ？

渡り（接続）部？

ダブルパンケーキ巻線

レアー巻線超伝導線材の形状を制約

?

(15)

シムコイル

アキシャルシムコイルラディアルシムコイル

Z0 Z1

Z2

X Y

ZX ZY

X2-Y2 XY

(16)

永久電流モード

×

接続部

接続抵抗 < 10^-11Ω

（半田～10^-9Ω）

低磁場領域に設置線材自体の抵抗に注意永久磁石よりも遙かに優れた磁場の時間的安定性が得られる

減少

(17)

磁場安定度

920 MHz NMRマグネットの場合インダクタンス： 1123 H

磁場安定度： 10^-8 /h 回路抵抗： 3 nΩ 接続数： 142

Nb3Sn-NbTi: 64 NbTi-NbTi: 78

接続部許容抵抗： < 0.01 nΩ

主コイル総線材長： 150 km

通電電流： 243 A J/J_c~ 0.6 (回路抵抗： 3 nΩ) n = 30

Ec = 0.1 μV/cm J/J_c= 0.51 ~ 0.58

0.1 μV/cm×150 km = 1.5 Ω 臨界電流の基準

(18)

超伝導線材の n 値

Ec: 1 or 0.1 μV/cm E = V / l

E = Ec ( I / Ic) n

超伝導線材

I

l V

n 値

超伝導線材の種類、製造法で異なる

温度、磁場で変化

0 20 40 60 80 100 120

0.00 0.05 0.10 0.15

Ⅰop

Ec

Ⅰc

n = 30

n = 20 n = 10

n = 5 n = 2

Electric Field (μV/cm)

Current (A)

Iop = Icでの永久電流モード磁場の減衰極めて大

n値を考慮してIopを決定

(19)

NMRマグネットの発生磁場の推移

強磁場発生用

超伝導マグネット漸増

NMRマグネット着実な増加から漸増の傾向

NMRスペクトロメータに対する強い期待今後の強磁場化は材料開発が不可避

1975 1980 1985 1990 1995 2000 20058 10

12 14 16 18 20 22 24 26

950 930 +Bi-2212

920 900

800 750

600 500

発生磁場(T)

西歴（年）

400

+Nb3Al

強磁場超伝導マグネット

高分解能NMRマグネット

2005年

950 MHz (22.3 T)

Oxford Instruments

(20)

発生磁場向上の技術的要因

1975 1980 1985 1990 1995 2000 20055 10

15 20 25

920 MHz930 MHz 950 MHz 900 MHz

800 MHz 750 MHz

600 MHz 500 MHz

最高磁場 (T)

西暦（年）

400 MHz Nb₃Sn

超流動ヘリウム冷却

15 wt.%Sn濃度Nb₃Sn

16 wt.%Sn濃度Nb₃Sn RRP法Nb₃Sn

最内層コイルの線材特性が

発生磁場を決定

(21)

54

3619

920 MHz, 930 MHz ＮＭＲマグネット

液体ヘリウム

加圧超流動ヘリウム超流動ヘリウム

冷却器

NbTi

超伝導接続 Nb3Sn

超伝導接続

シムコイル

軸方向：Z0, Z1, Z2

径方向：X, Y, ZX, ZY, XY, X2-Y2

1.55 K

物質・材料研究機構強磁場共用ステーション

(22)

920 MHz ・ 930 MHz マグネットの運用

タンパク3000プロジェクトに貢献

（理化学研究所ゲノム研究総合センター）

1V5T 1V5L 1V89

バイオサイエンスへの適用

鉄鋼スラグ

「新機能材料開発に資する強磁場固体NMR」振興調整費（2004-2006)

ゼオライト肥料ナノサイエンスへの適用

リサイクル

建築土木資材

(23)

１． NMR （核磁気共鳴）

原理

３． NMR のタンパク質・固体材料への適用

４．まとめ

(24)

タンパク質構造決定

スラグセラミックス

ガラス

触媒 STMとの融合(MRFM)

ゴムポリマー生体中カルシウム

新ナノ物質

-

-((CFCF22CF)CF)xx--(CF(CF22CFCF22))yy--

｜

O(CFO(CF22CFO)CFO)pp(CF(CF22))qqSOSO33HH

｜

｜ CFCF33

-

｜

｜ CFCF33

-

｜

｜ CFCF33

燃料電池量子計算機

鉄鋼、化学、薬品、医薬、繊維、電器、ゴム等多岐の産業に渡る応用鉄鋼、化学、薬品、医薬、繊維、電器、ゴム等多岐の産業に渡る応用

NMRの応用

NMR 非破壊計測

三次元秩序が存在しない物質も計測可能非晶質、表面・界面領域、末端・分岐部物理的な位置だけでなく、化学結合に関する情報も取得可能

強磁場化に伴い、計測可能な核種が増加

X線、電子顕微鏡周期構造に敏感

原理・結果が分かり易い

(25)

タンパク質

(26)

タンパク質の構造・機能解明

タンパク質の立体構造解明

巨視的構造Ｘ線回折

良質な結晶が必要

微視的構造ＮＭＲ

溶液

磁場の増加

解析可能な分子量増加

TROSY （1.04 GHzで線幅最小）

タンパク質の機能解明ヒト・ゲノム情報の解読新薬の創製

タンパク質と候補薬剤の相互作用の検出

強磁場ＮＭＲ

強磁場NMRスペクトロメータ世界各国で開発が進行中

基本構造約10000 タンパク3000（日）

3000/5年 NIH（米）

10000/10年

1V5L

(27)

ゲノム（ DNA, 遺伝子）：１次元情報

リボソーム

タンパク質：

３次元情報転写

Ser

翻訳

Asp Gly

ｔRNA ｍRNA

RNAポリメラーゼ

ヒトゲノム完全解読 2003年4月

コドン

ｸﾞﾘｼﾝ

アスパラギン酸

セリン

ﾌｪﾆﾙｱﾗﾆﾝ

ﾘｼﾝ

ｱﾙｷﾞﾆﾝ

ゲノムからタンパク質へ

^{理研・提供}

(28)

αへリックス

βシート

タンパク質の分子機能は、立体構造に基づいて実現されるタンパク質の分子機能は、立体構造に基づいて実現される

リプレッサー Cro

溶菌防止タンパク合成を阻害

タンパク質の立体構造

理研・提供

(29)

期間：期間： 2002 2002 年～年～ 2006 2006 年年

予算：予算：５０～５０～１００億円／年１００億円／年

内容：内容：

- - 網羅的解析プログラム網羅的解析プログラム理研理研

２５００構造２５００構造

- - 個別的解析プログラム個別的解析プログラム７中核的拠点７中核的拠点

５００構造５００構造

■成果 ■ 成果

- - 疾病の原因究明疾病の原因究明 - - ｹﾞﾉﾑ創薬の実現ｹﾞﾉﾑ創薬の実現 - - 特許取得特許取得

医学・生物学的に重要なタンパク質、創薬などの産業応用に重要なタンパク質について、大量かつ迅速な手法で網羅的に５年間で３０００以上の構造・機能解析の実施を行う

タンパク３０００プロジェクト（文科省）

理研・提供

(30)

①発生・分化とＤＮＡの複製・修復 ⑤細胞内シグナル伝達

②転写・翻訳 ⑥脳・神経系

③翻訳後修飾と輸送 ⑦代謝系

④タンパク質高次構造形成と機能発現

②北海道大学大学院理学研究科

⑤北海道大学大学院薬学研究科

③高エネルギー加速器研究機構物質構造研究所

②横浜市立大学大学院

⑥大阪大学蛋白質研究所生体分子解析センター

⑦大阪大学大学院理学系研究科

①東京大学大学院農学生命科学研究科

④京都大学大学院理学系研究科

RSGI RSGI

個別的解析プログラム

^{理研・提供}

(31)

タンパク質の結晶化 X 線による回折密度分布

回折密度から電子密度を計算立体構造の決定（リボンモデル）

Ｘ線による構造解析

理研・提供

(32)

■X ■ X- -線結晶構造解析法による構造解析線結晶構造解析法による構造解析

・利点：・利点：分子量限界がほとんど分子量限界がほとんどない（３ない（３ MDa MDa ））

・欠点：・欠点：高品位の結晶生成が必要高品位の結晶生成が必要

・標識：・標識：セレノメチオニン（セレノメチオニン（ SeMet SeMet ）置換タンパク）置換タンパク質の調整質の調整

SPring-8

理研・提供

(33)

X 線による解析実績

理研・提供

(34)

プローブ

yＲＦ波の照射と信号 y３重共鳴プローブ

１H、^１３C、^１５N コンソール

・ＲＦ波生成

•信号処理

高分解能 NMR による解析

超伝導マグネット

・サンプルを強磁場で磁化

理研・提供

(35)

■ ■ NMR NMR による構造解析による構造解析

・利点：・利点：溶液で計測可能溶液で計測可能

・欠点：・欠点：分子量限界分子量限界 3 3 ０ｋ０ｋ Da Da

・計測：・計測： 3 3 重共鳴多次元重共鳴多次元 NMR NMR

・・標識：標識：安安定同位体標識定同位体標識

１３１３

C( C(

¹²¹²

C) C) 、、

^１５^１５

N N （（

¹⁴¹⁴

Ｎ）Ｎ）

機能ドメインを解析

理研・横浜研究所の NMR 施設

600 MHz × 17 700 MHz × 6 800 MHz × 14 900 MHz × 3 40台

理研・提供

(36)

600 MHz (14.1T) NMR

17 台

理研・提供

(37)

700 MHz (16.5T) NMR

6 台

理研・提供

(38)

低温プローブ

14 台 800 MHz (18.8T) NMR

理研・提供

(39)

3 台 900 MHz (21.1 T) NMR

理研・提供

(40)

ランダム構造

初期構造立体構造計算途中最終構造

２次構造配置の探索３次構造

※ ＮＯＥスペクトルから得られた^１Ｈ間距離情報を満たすタンパク質の立体構造を、制限つき分子動力学計算により決定

NMR による立体構造解析

理研・提供

(41)

NMR による解析実績

理研・提供

(42)

固体材料

(43)

90% の元素が NMR 分析可能（ I ≠ 0 ）

従来技術は３核種（HCN）

75% の四極子核は強磁場によってのみ分析可能

機能性材料には四極子核が多い（ Na, Ca, Al, Ti, Cu, O, Cl, .. ）

強磁場固体 NMR

(44)

1 GHz 500 MHz

10² 10³ 10⁴ 10⁵

10^-12 10^-10 10^-8 10^-6 10^-4 10^-2 10⁰

Mg ⁴⁷Ti

Relative Signal Intensity (a.u.)

2nd-Order Quadrupole Coupling Constant (a.u.)

7Li ¹¹B Al Na I

115In

17O

Mn

Cu Br As

10B Be ³⁵Cl Rb ¹¹³InSb

37Cl ¹⁴N Ba

49Ti Xe K Nd Kr Sr

Sm Ge Zn S

Ca

Mo

四極子核の感度と分解能

Pines, et al., 1989

透輝石の¹⁷Oスペクトル

（計算値）

(45)

試料管 (ZrO

₂

,Si

₃

N

₄

)

魔法角回転（ MAS ） 20 － 30 kHz 固体 NMR プローブ

54.7°

(46)

固体 NMR プローブヘッド

固体 NMR プローブの装着

(47)

ゼオライトの²⁷Al-NMR ５種類の配位状態を識別スラグの²⁷Al-NMR

１１種類の配位状態を発見

K. Saitoh, et.al., 2003.

①

②

③

④

⑤

⑥

⑦

⑧

⑩ ⑨

⑪

・EPMA----特定領域の組成のみ

・XRD ---長周期構造のみ

いずれも局所構造が不明

スラグ、ゼオライト等の局所化学構造

(48)

人口ゼオライトは天然物よりも３倍高機能 NMR 情報を元に物質設計している

４配位５配位

６配位

ゼオライトの

²⁷

Al-NMR スペクトル

ゼオライト

(49)

ポーラスアルミナの粉末試料のアルミ核のスペクトルと決定された構造

AlO

₆

AlO

₅

AlO

₄

ポーラスアルミナの測定例

(50)

強磁場NMRスペクトロメータの用途

現状

タンパク質構造・機能解析タンパク質溶液の立体構造

タンパク質と候補薬剤の反応

新薬創製

膜タンパクの構造・機能解析

強磁場固体高分解能NMR

無機材料の構造・機能解析

固体触媒

固体電解質（酸素分離膜）

難溶性

(51)

NMRは超伝導マグネットの持つ優れた性質

・強磁場を経済的に発生できる

・空間的均一度と時間的安定度を得やすい

を利用した計測機器として市場に普及してきた。

タンパク質の構造・機能解明を中心とする

バイオサイエンス分野の強い期待から強磁場化が進められてきた。

強磁場化によってナノ・材料等一層の対象範囲の

拡大が期待できる。

(52)

ご静聴ありがとうございました

強磁場NMRの タンパク質・固体材料への適用