本稿では，水溶液中でタンパク質の安定化や濃縮ができる新 しい方法を紹介する．タンパク質溶液に高分子電解質を混合 することで複合体にして沈殿させる．沈殿した状態は物理化 学的なストレスに強く，水溶液中でタンパク質が安定化され た状態である．上清を取り除いて少量の塩溶液を加えること で，複合体が解離してタンパク質がフリーになり，活性があ る状態に戻る．加える塩溶液を調整すれば濃縮もできる．こ の方法は，タンパク質医薬品の濃縮法や保存法になると考え ている．
はじめに
遺伝子組換え技術の進歩により，1980年代以降，さま ざまなタンパク質医薬品が開発されてきた．特に，分子 標的薬として知られている抗体の進歩は目覚ましく，こ れまでに治療が困難だったがんや関節リウマチなどの難 病治療に貢献してきた(1〜4)．タンパク質医薬品の経口投 与は，低分子化合物の医薬品とは異なり困難なので，注 射によって体内に投与されることが多い．なかでも皮下
注射は痛みも少なく，簡便で自己投与も可能なので，新し い投与法として期待されている．しかし，皮下注射は投 与量が1.5 mL以下に制限されるため，通常，100 mg/mL 以上の高濃度のタンパク質溶液を調製する必要がある(5, 6)．
タンパク質医薬品の高濃度化には，粉末製剤を再溶解 する方法が広く用いられている．凍結乾燥されたタンパ ク質の粉末を少量の溶液で溶かすだけだが，現実には難 しい点がいくつかある．まず，タンパク質が不安定であ ることを考慮しなければならない．粉末状態のタンパク 質を溶解させると，せん断応力や表面張力などの物理化 学的ストレスがかかり，不可逆に変性することがある．
さらに，変性タンパク質の凝集は，調製するタンパク質 溶液が高濃度ほど起こりやすい．凝集体はタンパク質医 薬品の有効性を低下させるだけでなく，好ましくない免 疫反応を引き起こすなどの安全面にも悪影響を及ぼす．
このようなタンパク質の不安定性のほかに，溶解に要す る時間も現実的な課題になっている．高濃度の塩溶液を 調製するような場合には，スターラーやボルテックスで 撹拌すれば溶かすことが可能だが，タンパク質は不安定 なので，変性させないよう慎重に取り扱う必要がある．
実際の製剤では，バイアル中の粉末製剤に生理食塩水な
タンパク質沈殿‒再溶解法による 高濃度タンパク質医薬品の調製
栗之丸隆章，白木賢太郎
High Concentration Protein Formulation by Protein‒Poly(amino acid) Complex Precipitation
Takaaki KURINOMARU, Kentaro SHIRAKI, 筑波大学数理物質 系物理工学域
【解説】
どの溶媒を加えたあと，バイアルを泡立てないようゆっ くり振ることで溶解させる．そのため，タンパク質のす べての粉末を溶解させるために，数十分間から数時間か かってしまうこともある．
ほかのアプローチとして，タンパク質の濃縮がある．
すなわち，低濃度のタンパク質溶液から溶媒を選択的に 取り除き，溶媒量を減らして高濃度のタンパク質溶液を 調製する方法である．代表的な濃縮法には限外ろ過やク ロマトグラフィー，エバポレーション，凍結乾燥，スプ レードライ法などが挙げられる(5, 7, 8)．しかし，操作工 程が増えるので，設備や時間のコストが課題として残さ れる．近年では，液‒液相分離(9)やゲル化(10)，結晶化(11) など，装置が不要な新しい濃縮法の開発も進んでいる が，処理に伴うタンパク質の不可逆な変性などの課題は 残されてしまう．このように，高濃度のタンパク質溶液 を得るために，1）タンパク質を変性させずに，2）簡便 で迅速な工程で，3）装置などの投資が不要な方法の開 発が期待されている．さらに，今後もタンパク質医薬品 の種類が増えることを考えると，抗体や酵素やホルモン などによらず，4）多様なタンパク質に利用できる汎用 的な方法であることが望ましい．
筆者らは，溶液中のタンパク質の安定化や機能制御を 実現するために，高分子電解質が有力であることを報告 してきた．高分子電解質とは，正または負の電荷を帯び た官能基が複数個ある高分子化合物であり，反対の電荷 をもつタンパク質と主に静電相互作用を介して複合体を 形成する．この性質を応用すれば，正電荷と負電荷の高 分子電解質を順番に添加すると，タンパク質の活性を可 逆にON‒OFFに切り替えることが可能である(12〜14)．さ らに，電荷をもつ基質に対して反対の電荷をもつ高分子 電解質を加えるだけで，酵素活性が1桁以上増加する 酵素超活性化 が起こる(15)．最近では，ポリエチレン グリコール（PEG）と高分子電解質のブロック型高分子 電解質（PEG化高分子電解質）をタンパク質溶液に加え ると，プロテアーゼへの耐性が増加し，加熱や振とうな どのストレスによる劣化も防ぐことを見いだした(16, 17)． これらの手法は，高分子電解質をタンパク質溶液に加え るだけで実現できる簡単な方法であるために，タンパク 質医薬品への応用はもちろん，幅広い分野への応用が期 待できる．
本稿では，タンパク質の濃縮法として高分子電解質を 用いるタンパク質沈殿‒再溶解法を紹介する(18〜26)．手順 は次のとおりである．まず，タンパク質溶液に高分子電 解質を加えてタンパク質を共沈殿させる．上清を取り除 いた沈殿体が濃縮状態に相当する．この状態でタンパク
質は，高分子電解質と複合体を形成しているので安定化 されている．ここに生理食塩水を加えると，タンパク質 が高分子電解質から解離して，本来の働きを担うことが できる．
タンパク質沈殿‒再溶解法
タンパク質の沈殿は，タンパク質の精製に広く用いら れてきた手法である．沈殿剤には，硫酸アンモニウム
（硫安）のほか，アセトンやエタノールなどの有機溶媒，
ポリエチレングリコール（PEG）やデキストランなどの 水溶性ポリマーなども用いられる．これらの沈殿剤は，
ある濃度以上を加えるとタンパク質を沈殿させる性質が ある（図1A）．臨界濃度に近い濃度で沈殿させたタンパ ク質は，緩衝液などで沈殿剤の濃度を下げることで再溶 解させることができる．この方法を，タンパク質沈殿‒
再溶解法と呼ぶ．実際にMatheusらは，硫安やPEGを 沈殿剤として用いたタンパク質沈殿‒再溶解法で，高濃 度の抗体溶液を調製できることを報告している(27)．再 溶解後の抗体は，天然状態と同じ二次構造と機能をもっ ていることが多いが，高濃度の沈殿剤が必要であり，粘 性の増加も懸念される．
一方，高分子電解質は沈殿剤としても利用できる（図 1B）．高分子電解質とタンパク質からなる複合体は，温 度やpH, 分子量，イオン強度，混合比などのパラメータ を調整することで，タンパク質に高分子電解質が非共有 結合で弱く会合したような水溶性の高い状態から，100 ナノメートル以上ある白濁したコロイド状態まで，さま ざまな形態を作り分けることができる(28)．この複合体 をまとめて，タンパク質‒高分子電解質複合体（Protein‒
Polyelectrolyte Complex; PPC）と呼ぶ．溶液条件をう まくデザインすれば，タンパク質を変性させずに沈殿し たPPC状態を作らせることも可能である．沈殿性の PPCは，一つの高分子電解質に2つ以上のタンパク質が 吸着し，それらが架橋して生じると考えられる．事実，
高分子電解質は低濃度ほどタンパク質を沈殿させやす く，高濃度になると沈殿させにくい性質がある．さら に，PPC沈殿はイオン強度に依存して生じる．すなわ ち，PPCは静電相互作用を駆動力として形成している ので，イオン強度が増えると静電遮蔽によって容易に解
離する(29, 30)．このようなPPCの沈殿性と塩溶解性は，
塩やアルコール，PEGなどの高分子による沈殿物には ない性質である．この性質を生かせば，タンパク質の凝 集や沈殿，再溶解を制御できる．
PPCを利用した沈殿‒再溶解法
PPCによるタンパク質沈殿‒再溶解法の手順を以下に 示す（図2）．まず，電荷をもつタンパク質の原液に
（Step 1），反対の電荷をもつ高分子電解質を加え，沈殿 性のPPCを形成させる（Step 2）．次に，このPPCを遠 心分離して沈殿させ（Step 3），沈殿から上清を取り除 く（Step 4）．このあと，塩を含む緩衝液を加えて再溶 解させると（Step 5），元のネイティブ状態のタンパク
質を得られる．この段階で加える溶液の量を減らせば，
タンパク質溶液を濃縮できる．
具体的な条件として，塩の終濃度は，生理食塩水と同 等の150 mMに設定した．モデルタンパク質として，現 在市販されているタンパク質医薬品から10種類を選ん だ（表1）．分子量や等電点などの物性が異なる酵素や 抗体，ホルモンなどが含まれている．高分子電解質に は，生体適合性が期待できるポリアミノ酸を用いた．カ チオン性のタンパク質にはアニオン性のポリグルタミン 図1■各種沈殿剤によるタンパク質沈殿の比 較
図2■ポリアミノ酸によるタンパク質沈殿‒再溶 解法の手順
文献23を参考に作成．
表1■使用したタンパク質医薬品一覧
一般名 分類 主な適応疾患 等電点 pH（電荷） ポリアミノ酸（電荷）
ヒト免疫グロブリンG 抗体 7.3 5.0（＋） ポリグルタミン酸（−）
アダリムマブ 抗体 関節リウマチ 8.7 6.5（＋） ポリグルタミン酸（−）
インフリキシマブ 抗体 関節リウマチ 8.7 6.5（＋） ポリグルタミン酸（−）
エタネルセプト 抗体 関節リウマチ 8.0 8.7（−） ポリリジン（＋）
オマリズマブ 抗体 気管支喘息 7.6 5.5（＋） ポリグルタミン酸（−）
パニツムマブ 抗体 結腸・直腸がん 6.9 8.7（−） ポリリジン（＋）
リツキシマブ 抗体 B細胞性非ホジキンリンパ腫 8.7 6.5（＋） ポリグルタミン酸（−）
カルペリチド ホルモン 急性心不全 10.5 7.0（＋） ポリグルタミン酸（−）
サイログロブリン ホルモン バセドウ病 5.5 8.0（−） ポリリジン（＋）
L-アスパラギナーゼ 酵素 急性白血病 4.7 7.0（−） ポリリジン（＋）
酸（polyE）を，アニオン性のタンパク質にはカチオン 性のポリリジン（polyK）を用いた．
まず，緩衝液のpHと，ポリアミノ酸の分子量，混合比 を変えて，タンパク質を完全に沈殿させて再溶解させる ことができるかを調べた．ここではStep 2とStep 5の 溶液量を統一し，終濃度が等しくなるようにした．その 結果，表1のいずれのタンパク質もほぼ100％沈殿させ，
100％再溶解させることができた(23)．たとえば，白血病 の治療薬として知られているL-アスパラギナーゼの場合，
カチオン性のpolyKを0.05倍加えたときに，ほぼ100％
の収率を得ることができた．興味深いことに，タンパク 質の等電点（p ）から2.0程度離れたpH条件で，高い収 率を示す傾向があった．これは，新規のタンパク質医薬 品の溶液条件をスクリーニングするときの目安になるだ ろう．たとえば，タンパク質のp さえ求まれば，溶媒の pHをスクリーニングする手間が省けるかもしれない．
次に，再溶解後のタンパク質の物性を評価した．遠紫 外CDスペクトルを測定した結果，再溶解後のタンパク 質はネイティブ構造と同じ二次構造を保持していること がわかった．さらに，酵素活性や免疫活性を評価した結 果，再溶解後のタンパク質は元の機能を保持しているこ とがわかった．したがって，濃縮後のタンパク質の機能 は，濃縮前の原液と同等であることがわかった．また，
再溶解後の凝集をサイズ排除クロマトグラフィーで評価 したが，沈殿‒再溶解の工程で不可逆なタンパク質凝集 は形成されていなかった．タンパク質を沈殿‒再溶解さ せてもタンパク質の品質は劣化せず，実際の製剤として 利用できるレベルにあると考えられる．
PPCによる沈殿‒再溶解法の応用の可能性
このようにして確立した沈殿‒再溶解法を用いて，実際 に高濃度のタンパク質製剤を調製できるかを調べた．モ デルタンパク質には皮下注射剤として実用化されている
オマリズマブとアダリムマブの2種類の抗体製剤を使用 した．実験手順は先ほどと同様であるが，再溶解で加え る溶媒量を変更した．今回は，原液（200 µL）から再溶 解溶液（40 µL）へと体積が1/5になるよう実験系を設定 した（図3）．この系を実際に試したところ，30 mg/mL の原液から，150 mg/mLの抗体溶液を得ることに成功 した(24)．さらに，再溶解後の抗体の物性や品質は原液 と同等であることが確認できた(24)．マウスを用いた単 回投与毒性試験や薬物動態試験でも問題がないことがわ かった(24)．
ここで，産業利用の可能性を想定し，これまでに広く 用いられる濃縮法（凍結乾燥‒再溶解法，蒸発‒再溶解 法，限外ろ過法）と沈殿‒再溶解法との濃縮収率と所要 時間を比較した(24)（表2）．従来の濃縮法では，容器や ろ過膜への吸着によってタンパク質のロスが生じやす く，想定した高濃度化が困難であった．一方，沈殿‒再 溶解法はそのようなロスが生じにくく，ほぼ100％の収 率が得られた．さらに，沈殿‒再溶解法の所要時間は約 2時間であり，凍結乾燥や蒸発乾燥に比べると短時間で 済む．以上より，沈殿‒再溶解法は，これまでの濃縮法 と比べて，より素早く簡便に，高い収率で高濃度タンパ ク質溶液を調製できることが示された．
沈殿‒再溶解法は操作が単純で特別な容器・装置を必 要としないので，スケールアップも簡単であるという利 点もある．実際に，400 µLの系を1.0 Lの系に2,500倍に スケールアップしたが，問題なく沈殿‒再溶解させるこ とができた(24)．おそらく，製剤の現場で用いられる大
図3■沈殿‒再溶解法による抗体製剤の高濃 度化
文献24を参考に作成．
表2■タンパク質濃縮法の比較
濃縮法 収率 所要時間
沈殿‒再溶解法 ≈100％ 2時間
凍結乾燥‒再溶解法 57〜91％ 18時間
蒸発‒再溶解法 64〜88％ 5時間
限外ろ過法 49〜87％ 2時間
型デカンタに応用しても問題が起らないだろう．なお，
1.0 Lの系では400 µLの系と比べて上清を取り除くこと も容易で，0.98 Lを取り除いて50倍に濃縮できた．しか も，1.0 Lの系ではPPCの沈殿が自発的に進んだので，
遠心分離が不要であったことも追記したい．このよう に，タンパク質沈殿‒再溶解法は，ポリアミノ酸と塩を 加えるだけで実現する簡便で迅速なタンパク質濃縮法な ので，これから広く用いられていくと考えている．
沈殿‒再溶解法によるタンパク質の安定化
タンパク質は熱や振とうなどの物理化学的なストレス で容易に劣化してしまう．この不安定さはタンパク質製 剤の品質を左右するので，通常，塩や糖質アミノ酸など を添加することが多いが，高分子電解質もタンパク質の 安定化に効果がある(16, 17)．PPCを形成することで，気 液界面での変性を抑制できるほか，溶液中の溶質やタン パク質分子間の好ましくない相互作用も抑制できる．特 にPPCを遠心して沈殿させた状態では，60 Cでの加熱 加速試験や，輸送を想定した500 rpmの激しい振とう，
0.1％の過酸化水素溶液中での強い酸化に対しても耐性 があることが予備実験的に確認できた(18〜22, 25, 26)．加熱 による凝集抑制はアルギニンやトレハロースなどの添加 剤でも見られるが，振とう耐性を示す添加剤は非常に少 ない．もし，PPC沈殿は物理化学的なストレスにも優 れた耐性があれば，保存法として沈殿‒再溶解法を使う こともできるだろう．たとえば，凍結乾燥に不向きなタ ンパク質を水溶液中で安定化したいときや，短期間のタ ンパク質の保存に使うことができる．
おわりに
本稿では，高分子電解質を利用したタンパク質医薬品 の沈殿‒再溶解法を紹介した．この方法を用いれば，迅 速かつ簡便にタンパク質溶液を高濃度化できる．さら に，PPC沈殿は通常の溶液状態よりも安定である．こ れまでの医療現場では，タンパク質の凝集体や沈殿物は 嫌われる存在であり，製剤として取り扱う可能性は検討 されてこなかった．しかし，本稿で示したように，制御 した凝集や沈殿は，タンパク質の濃縮や安定化にも使う ことができる．近い将来，「沈殿製剤」という新しいタ イプの製剤が生まれることを期待している．
謝辞：本稿の内容の多くは，テルモ株式会社と筑波大学との共同研究の 成果です．伊崎峻介氏，木本知明氏，繁田賢治氏，丸山卓也氏をはじめ，
関係者に感謝申し上げます．
文献
1) J. M. Reichert, C. J. Rosensweig, L. B. Faden & M. C. De-
witz: , 23, 1073 (2005).
2) A. C. Chan & P. J. Carter: , 10, 301 (2010).
3) L. M. Weiner, R. Surana & S. Wang: , 10, 317 (2010).
4) M. X. Sliwkowski & I. Mellman: , 341, 1192 (2013).
5) S. J. Shire, Z. Shahrokh & J. Liu: , 93, 1390 (2004).
6) R. J. Harris, S. J. Shire & C. Winter: , 61, 137 (2004).
7) B. Dani, R. Platz & S. T. Tzannis: , 96, 1504 (2007).
8) M. Bowen, N. Armstrong & Y. F. Maa: , 101, 4433 (2012).
9) H. Nishi, M. Miyajima, H. Nakagami, M. Noda, S. Uchi- yama & K. Fukui: , 27, 1348 (2010).
10) H. R. Johnson & A. M. Lenhoff: , 10, 3582 (2013).
11) M. X. Yang, B. Shenoy, M. Disttler, R. Patel, M. McGrath, S. Pechenov & A. L. Margolin:
, 100, 6934 (2003).
12) S. Tomita, L. Ito, H. Yamaguchi, G. Konishi, Y. Nagasaki &
K. Shiraki: , 6, 5320 (2010).
13) S. Tomita & K. Shiraki: ,
49, 3835 (2011).
14) T. Kurinomaru, S. Tomita, S. Kudo, S. Ganguli, Y. Naga- saki & K. Shiraki: , 28, 4334 (2012).
15) T. Kurinomaru, S. Tomita, Y. Hagihara & K. Shiraki:
, 30, 3826 (2014).
16) S. Ganguli, K. Yoshimoto, S. Tomita, H. Sakuma, T.
Matsu oka, K. Shiraki & Y. Nagasaki: , 131, 6549 (2009).
17) T. Kurinomaru & K. Shiraki: , 2, 587 (2015).
18) 特願2013-223775 19) 特願2013-223775 20) 特願2013-223778 21) 特願2013-223779 22) 特願2013-223780
23) T. Kurinomaru, T. Maruyama, S. Izaki, K. Handa, T. Ki- moto & K. Shiraki: , 8, 2248 (2014).
24) S. Izaki, T. Kurinomaru, T. Maruyama, T. Uchida, K.
Handa, T. Kimoto, K. Shiraki: , in press.
25) T. Maruyama, S. Izaki, T. Kurinomaru, K. Handa, T. Ki-
moto, K. Shiraki: , in press.
26) S. Izaki, T. Kurinomaru, K. Handa, T. Kimoto, K. Shiraki:
submitted.
27) S. Matheus, W. Friess, D. Schwartz & H. C. Mahler:
, 98, 3043 (2009).
28) A. B. Kayitmazer, D. Seeman, B. B. Minsky, P. L. Dubin &
Y. Xu: , 9, 2553 (2013).
29) F. Carlsson, M. Malmsten & P. Linse: , 125, 3140 (2003).
30) R. Ni, D. Cao & W. Wang: , 112, 4393 (2008).
プロフィル
栗之丸 隆章（Takaaki KURINOMARU）
＜略歴＞2011年筑波大学応用理工学類卒 業／2015年同大学大学院数理物質科学研 究科博士課程修了／同年日本学術振興会博 士研究員＜研究テーマと抱負＞高分子を用 いたタンパク質の機能制御＜趣味＞ランニ ング
白木 賢太郎（Kentaro SHIRAKI）
＜略歴＞1994年大阪大学理学部生物学科 卒業／1999年同大学大学院理学研究科博 士 課 程 修 了／ 同 年CREST博 士 研 究 員／
2004年JAIST助手／同年筑波大学物理工 学系助教授／2007年同大学数理物質系准 教授＜研究テーマと抱負＞タンパク質の溶 液学，日常の科学＜趣味＞ラーメン Copyright © 2015 公益社団法人日本農芸化学会
