プロダクト イノベーション
微生物を用いたフェノール系 化学品の生産
株式会社ジナリス
西 達也，貫井憲之，齋藤静司，岩崎卓己，西澤明人，矢尾真樹
筆者らは2004年夏より微生物を用いたフェノール系 化学品の生産研究に着手したが，かずさDNA研究所，
早稲田大学および株式会社プロテイン・エクスプレスの 3機関と連携して「水酸化酵素発現ライブラリーの構 築」の研究開発を行ったことがきっかけであった．この 研究開発の目的は，水酸基付加のバイオプロセス技術の 確立を目指し，ゲノム解析技術とメタボローム解析技術 を駆使して目的の水酸化酵素を迅速に同定する手法を開 発することであった．また，化学プロセスによる酸化反 応では多大なエネルギーが必要とされるうえ，フェノー ル系化学品の価格が比較的高いことも，酵素を用いたプ ロセス研究を行う動機となった．このように，以前のバ イオテクノロジーを用いた物質生産は，省エネルギーや 危険な廃棄物排出の回避という「グリーンケミスト リー」の思想から，微生物や酵素の利用や土壌中で分解 されやすい生分解性プラスチックの開発が主流であっ た．
一般に環境問題というと，低炭素や省エネルギーに関 心が向けられる．有機化学品生産の場合，原料となる化 石資源が枯渇すると工業生産ができなくなる．有機化学 品の「炭素」に着目すると，土壌への廃棄または焼却に よる炭酸ガスの放出により，炭素資源が一方向に移動 し，拡散していくことが最大の問題であることがわか る．この問題を解決するには，光合成などにより炭酸ガ スを固定し，またバイオマスから化学品を製造する必要 がある．別の解決策は，廃棄プラスチック（廃プラ）な どの廃棄物を再利用し，炭素資源を循環させることであ る．この観点から，上述の研究開発を終えた後，廃プラ やバイオマスのような持続可能な資源を有機化学品製造 の原料とすることに焦点を当てた新たな研究開発を推進 することにした．
当時は，バイオマスを原料としてエタノールなどのバ イオ燃料を生産する研究が世界的に活発化していた．そ
こで，脂肪族系化学品の製造事業は競争が激しくなると 考え，芳香族系化学品をターゲットとして選んだ．日本 では，1995年に容器包装リサイクル法が成立し，2000 年代に入るとPETボトルや塩化ビニール製品などのリ サイクル事業が推進されていた．筆者らは，日本らしさ や独自性を重視して，リサイクル活動によって収集され る廃プラを原料として芳香族系化学品を生産することを 企画した．なお，バイオマスより廃プラを優先させたの は，日本で発酵生産原料として使えるバイオマス資源を 安価かつ安定的に得ることが難しく，また物流面でも問 題点があったことによる．
ところで，最近シェールガス革命がバイオ燃料やバイ オ化学品の製造事業に対して負の影響を与えつつある．
シェールガスからの脂肪族系化学品の生産量が増加する と，石油からの化学品生産のバランスが崩れるために，
芳香族化学品の価格が高くなると予想される．このよう に，予期せぬことにシェールガス革命は芳香族化学品の バイオプロセス生産に対しては有利な影響を与えつつあ る．
具体的な研究テーマとしては，PETなどのポリエス テル系樹脂の多くがテレフタル酸（TPA）を含んでい ることから，樹脂の解重合により得られるTPAを原料 として利用し，水酸化酵素反応によりプロトカテク酸
（PCA）や没食子酸（GAL）などのポリフェノール類を 製造することを目指した（図
1
）．特にGALはその価格
が2,000 〜 3,000円/kgであり，世界の年間需要量も約 8,000トンであったことから，事業性の観点でも魅力が あった．PCAをターゲットとした理由は，医薬合成原 料などとして需要があるうえ，ポリマーの原料となる可 能性を秘めているからである．さらに，PCAはバイオ マス由来の糖類やリグニン分解物を原料としても生産で きうることから，必要に応じて原料転換を行えるという 点も魅力的であった．このように付加価値が高いGALとPCAをターゲット として開発を進めることにしたが，図1の製造経路に示 すように，市場規模の大きいナイロンやポリアミドの原 料となるアジピン酸とヘキサエチレンジアミンを製造で きる可能性があることも，この研究を推進する大きな動 機となった．また，代謝経路の途中産物であるカテコー ルも大きな需要がある製品であり，ムコン酸も新しいポ リマー素材として期待されている化合物なので，この研 究開発の期待値も大きいと考えた．
また，TPAを原料とする生産研究に加えて，フタル 酸（PTH）を原料としたフェノール系化学品の生産研 究も進めた．その理由は，PTHおよびその誘導体が，
ガラス繊維強化不飽和ポリエステル樹脂や塩化ビニール などに大量に含まれていることから，PETと同様に樹 脂廃棄物を収集することにより原料として用いることが できると考えられたからである．
TPAやPTHなどのフタル酸類を微生物による生産の 原料とする利点としては，フタル酸類はそのアルカリ金 属塩の水溶性が優れていることに加えて，揮発性や粉塵 爆発性もなく安全であり，微生物に対して毒性が少な く，しかも価格も安価であることが挙げられる．フェ ノール系化学品の生産に用いる微生物として組換え DNA技術を適用しやすい K-12（大腸 菌）を選んだ．
TPAをPCAに転換する酵素としては，TPAをTPA- 1,2-ジヒドロジオールに転換するTPA 1,2-ジオキシゲ ナーゼ（3つのコンポーネントからなる酵素）とTPA- 1,2-ジヒドロジオールをPCAに転換するTPA 1,2-ジヒド ロジオールデヒドロゲナーゼを利用した（図1）
．これ
ら酵素の遺伝子を土壌から分離した72W2株からクローニングし， -トルイル酸で誘導 がかかる プロモーターの制御下にオペロンを形成さ せて，PCA生産プラスミドを構築した（1）
．なお，PCA
やGALなどのフェノール系化合物が大腸菌に対して毒 性を有し，さらに酸化されやすいという問題があった．これらの問題を回避するために， プロモーターを利 用して時期特異的に目的化合物を生産させることを狙っ た．PCA生産プラスミドをもつ大腸菌を培養したとこ ろ，PCAの生産量が低かった．野生型大腸菌はTPA輸 送能が悪いと考え，2種のTPAトランスポーターを発 現させたところ， RHA1のトランス ポーターを発現させた菌株において効率の良いPCA生 産性が認められた（1）
．本菌株を用いたジャーファーメン
ター培養により，培地成分（完全合成培地），pH，温
度，通気量，撹拌などの条件を最適化した結果，約0.3 MのTPAが本培養開始後36時間以内に99％以上の効率 でPCAに転換することが観察された．次に，GAL生産菌の育種について述べる．GAL合成
酵素の知見としては， PAO1
の -ヒドロキシ安息香酸-3-ヒドロキシラーゼ（ HBAヒ ドロキシラーゼ）の変異体がPCAからGALへの微弱な 転換能を有することが報告されているだけであった（2）
．
そこで， HBAヒドロキシラーゼへの変異導入により GAL合成活性を向上させることを検討するために，12 種の野生型 HBAヒドロキシラーゼを単離し，活性を 調べた．その結果，10種類がPCAからのGAL合成活性 を有することが判明した（3）．本酵素の立体構造モデルを
もとに，基質となるPCAのドッキングシミュレーショ ンを行った後，本活性が強かった PAO，KT2440および
テレフタル酸 (TPA)
没食子酸（GAL）
プロトカテク酸（PCA）
ピロガロール カテコール
COOH
OH OH HO
COOH
COOH
COOH
OH OH
OH OH OH OH HO
COOH
HOOC OHOHH テレフタル酸- 1,2-ジヒドロジオール
HOOC COOH
cis, cis-ムコン酸
アジピン酸 ヘキサメチレンジアミン TPA 1,2-
ジオキシゲナーゼ
p HBA ヒドロキシラーゼ
二重変異体 TPA 1,2-
ジヒドロジオール デヒドロゲナーゼ
PCA脱炭酸酵素 脱炭酸反応
カテコール1,2- ジオキシゲナーゼ
多種のナイロン・ポリアミド ナイロン66
酵素反応
化学反応 図1■テレフタル酸からのフェノー ル系化学品とナイロンの生産経路
ATCC13032の酵素に対して，酵素活性の向上が期待で きるアミノ酸を置換した変異酵素を多数創製した．これ ら変異酵素の活性を比較した結果， の二 重変異体L199V-Y385Fと の二重変異体 L200V-Y385FのGAL合成活性がそれぞれ野生型酵素に 対して29.7倍，25.0倍向上することを見いだした．最終 的には後者の二重変異体をGAL生産用に選択した．1カ 所のみに変異を有する酵素L200VとY385Fはそれぞれ 0.7倍，5.0倍しか活性が上昇しなかったので，2個の変 異の相乗効果により活性が大きく向上したことがわかっ た（4）
．
HBAヒドロキシラーゼの二重変異体をコードする遺 伝子を上述のPCA生産用酵素遺伝子オペロン内に翻訳 カップリングが起きるように組み込んだプラスミドを構 築し，GAL生産大腸菌を作製した（4）
．
この大腸菌を ジャーファーメンター培養により試験した結果，約0.3 MのTPAが本培養開始後36時間以内に99％以上の効率 でGALに転換することが観察された．つづいて，廃プラを原料とするGAL生産の研究開発 の概要を紹介する．研究開始時には廃棄PETボトルを 原料とすることを想定した．しかし，廃棄PETボトル の中国などへの輸出により原料価格が高くなり，事業採 算性が悪くなるという事態が発生した．そこで，廃棄 PET樹脂の再資源化事業を行っている企業と連携し，
再資源化の過程で排出される廃棄PET樹脂由来の副生 物を利用することにした（図
2
）．
廃棄PETからTPAを得る方法は多数あるが，KOH を含むエチレングリコール（EG）溶媒中での加熱処理
（160℃，30 〜60分）により生成するTPAカリウム塩を 回収し，次のバイオプロセスの原料とした（1）
．ただし，
このようにして得たTPAカリウム塩には溶媒とPET樹 脂から由来するEGとイソフタル酸（IPA）が含まれる
（図2）
．そこで，EGを代謝するために大腸菌のラクト
アルデヒド・レダクターゼとアルデヒド・デヒドロゲ ナーゼAを高発現させた大腸菌株を作製したところ，本菌株は72 mMのEGを完全に分解することが判明し た（1）
．また，IPAを分解する大腸菌の育種も試みた．上
述の 72W2株がIPAを唯一炭素源として生 育できることがわかったので，既知の配列情報をもとに IPA代謝酵素群（IPA 3,4-ジオキシゲナーゼとIPA 3,4- ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ）をコードする遺伝 子を単離した．これらの酵素群を発現させた大腸菌株は IPAの代謝能が低かったので， 72W2株がも つイソフタル酸トランスポーター遺伝子を単離し，この 遺伝子の発現を追加することによりIPA代謝能が向上 した．なお，この大腸菌はIPAを単に分解するのでは なく，目的物であるGALに転換できる．廃棄PET樹脂からバイオプロセス用の原料となる TPAを得るには，バイオマスリファイナリーと同様に，
精製工程が必要であるので，この化学プロセスを「廃プ ラリファイナリー」と名づけた（図2）
．このプロセス
ではできるだけ安価にTPAを部分精製することが求め られる．次のプロセスは，微生物を利用して高付加価値 化学品を製造することから，バイオテクノロジーを利用 したアップグレード型リサイクルすなわち「バイオアッ プサイクル」と名づけた（図2）．廃棄PET樹脂やその
解重合で生成する化合物の中には，微生物の培養排液の 活性汚泥処理により分解しがたい不純物が存在する場合 もある．このような場合には，廃プラリファイナリーに おける不純物の分離，不純物の分解能を化学品製造微生 図2■廃プラリファイナリーとバイオアップサイクル物に付与する育種，あるいは目的化学品の精製工程にお ける不純物の分離が必要となる．
PCAとGALを含めて20種類以上のフェノール系化学 品を生産する微生物を創製してきたが，ここでフタル酸 を原料として9種類のフェノール系化合物を生産する大 腸菌の育種について述べる．9種類のフェノール系化合 物とは，2,3-ジヒドロキシ安息香酸A，サリチル酸B，
3,4-ジヒドロキシフタル酸C，プロトカテク酸D，3-ヒド ロキシフタル酸E，4,5-ジヒドロキシフタル酸F，4-ヒド ロキシフタル酸G，3-ヒドロキシ安息香酸Hおよびゲン チ ジ ン 酸Iで あ り，こ れ ら の 合 成 経 路 は図
3
に 示 し た（5, 6）．特にPTHから2,3-ジヒドロキシ安息香酸
Aへの 代謝にかかわる遺伝子群を解明したのは筆者らが初めてであるが，自然界から単離した
PTH10の全ゲノム解析により新しいフタル酸代謝経路 を同定した（5）
．この代謝経路の一部と
属 細菌のフタル酸トランスポーターを大腸菌に導入するこ とにより，2,3-ジヒドロキシ安息香酸Aを効率良く生産 する大腸菌を育種した（5）．この代謝経路内のPTH-2,3-ジ
オキシゲナーゼを用いると，PTHから2,3-ジヒドロジ オール体Jが得られる．さらに80℃以上で加熱すると脱 水反応が起こり，効率良くサリチル酸Bが生成するこ とを見いだした（5）（図3）．なお，大腸菌はPTHの取込み
能を有していないので，PTHを原料とする化学品の生 産菌はいずれもフタル酸トランスポーターの発現は化学 品の高効率生産には必須であった．以上のように，数多くのフェノール系化学品を生産す
る大腸菌の育種について紹介したが，代謝経路の人工的 再構成，時期特異的遺伝子発現，酵素発現量の調整およ び基質の輸送能の付与を含めて，多数の遺伝子を調和さ せて発現させる「合成生物学的手法」の活用は，いずれ の菌の育種でも必須であった．さらに廃プラを利用する には，得られた原料に多種類の不純物が混入するので，
これら不純物の分解能を大腸菌株に付与する必要があっ た．
筆者らは，経済産業省の低炭素型産業の成長を支援す る「革新的低炭素技術集約型産業国内立地推進事業」の 助成のもと，廃プラからフェノール系化学品を生産する プラントを2014年3月末に完成させた．廃プラのリサイ クル事業の採算性が悪化していることを考えると，廃プ ラの再生工程で発生する副生物，すなわち「廃棄物の廃 棄物」を利用することが事業採算性の観点から重要と思 われる．遺伝子組換え微生物を用いて開放系で環境汚染 物質を浄化することは現状困難であるが，本稿の廃プラ 中の不純物の処理例のように，発酵タンク内で遺伝子組 換え微生物を用いて化学品を生産すると同時に，環境汚 染物質や不純物を分解することも積極的に取り入れるべ き手法であると考える．さらに，図2に示したように，
アミノ酸発酵事業と同様に「発酵廃棄物からの肥料の生 産」を実現できれば，「廃プラの再資源化」
，
「高付加価 値化学品の製造」および「環境汚染物質や不純物の分 解」を合わせると「一石四鳥」となり，本稿で紹介した アプローチは環境問題の解決と事業採算性の両面で優れ たものになることが期待される．COOH OH
COOH OH OH COOH
COOH OH OH H
COOH COOH OH OH
H H
COOH COOH
HO HO H
H
COOH COOH
OH HO
COOH COOH
OH COOH OH
COOH OH
COOH
OH
COOH
OH HO
COOH
OH OH
COOH COOH
OH
A
B
C
D E
F
G H I
J COOH
COOH
PTH
COOH COOH
PTH
COOH COOH
PTH
図3■フタル酸を原料とする9種類 のフェノール系化学品の生産経路
文献
1） 貫井憲之ほか：公開国際出願，WO/2013/111332 2） B. Entsch, B. A. Palfey, D. P. Ballou & V. Massey :
, 266, 17341 （1991）.
3） 岩崎卓己ほか：特許公報，特許第5140848号 4） 齋藤静司ほか：特許公報，特許第5142268号 5） 岩崎卓己ほか：公開国際出願，WO/2012/081084 6） 岩崎卓己ほか：公開国際出願，WO/2013/021503 プロフィル
西 達 也（Tatsunari NISHI）
＜略歴＞1978年東京大学農学部農芸化学 科卒業／1980年同大学大学院農学系研究 科修士課程修了／同年協和発酵キリン株 式会社入社／1989年東京大学博士（農学）
取 得 ／同 年UCLA医 学 部 客 員 研 究 員／
2001年 協 和 発 酵 キ リ ン 株 式 会 社 退 社／
2002年 有 限 会 社 ジ ナ リ ス 取 締 役 社 長／
2004年早稲田大学理工学術院客員教授／
同年株式会社ジナリス代表取締役社長／
2005年東京大学大学院農学生命科学研究 科特任教授，現在に至る＜研究テーマと抱 負＞廃プラや未利用バイオマスからの化学 品製造，ゲノム診断＜趣味＞音楽・映画鑑 賞，下手な料理
貫井 憲之（Noriyuki NUKUI）
＜略歴＞2004年3月東北大学大学院博士課 程農学研究科環境修復生物工学専攻修了
（博士（農学））／同年日本大学生物資源科学 部21世紀COE博士研究員／2007年より株 式会社ジナリス研究員，2011年より同社 バイオ開発センター長，現在に至る＜研究 テーマと抱負＞自社発酵法の開発、工業化 スケールアップおよび研究開発マネジメン トを行っています。最近の興味は「研究開 発におけるプロジェクト管理」の可能性で す＜趣味＞最近の趣味はプレゼン技術を磨 くこと，およびマンションのローン繰り上 げ返済です
齋藤 静司（Seiji SAITO）
＜略歴＞1993年名古屋大学理学部物理学 科卒業／1998年同大学大学院人間情報学 研究科博士課程（後期課程）修了／同年株 式会社富士通研究所／2005年株式会社ジ ナリス／2011年北海道情報大学，現在に 至る＜研究テーマと抱負＞タンパク質の立 体構造解析，ゲノム解析
岩崎 卓己（Takumi IWASAKI）
＜略歴＞1998年岡山理科大学工学部応用 化学科卒業／2001年長岡技術科学大学大学 院工学研究科博士前期課程修了／2007年同 大学大学院工学研究科博士後期課程修了／
2006年株式会社ジナリス入社，現在に至る
＜研究テーマと抱負＞微生物を用いた芳香 族化合物の変換．環境中の有用微生物の探 索および育種＜趣味＞スキー（競技），読 書，音楽鑑賞
西澤 明人（Akito NISHIZAWA）
＜略歴＞2004年茨城大学大学院資源生物 科学専攻修士課程修了／2007年東京農工 大学大学院連合農学研究科生物工学専攻博 士課程修了／同年茨城大学産学官連携イノ ベーション創生機構ベンチャービジネスラ ボラトリ非常勤研究員／2010年株式会社 ジナリス入社，現在に至る＜研究テーマと 抱負＞バイオプロセス法を用いたフェノー ル系化合物の大量製造技術の開発＜趣味＞
サッカー観戦，登山 矢尾 真樹（Maki YAO）
＜略歴＞2008年奈良先端科学技術大学院 大学バイオサイエンス研究科博士後期課程 単位認定退学／同年バイオサイエンス博士 号取得．同年より化学会社にて電子材料の 研究開発に従事後，2011年ジナリス入社，
現在に至る＜研究テーマと抱負＞ポリエス テル系樹脂分解プロセスおよび微生物生産 物精製プロセスの開発＜趣味＞料理
