【解説】
植物資源からの燃料や化成品生産を実現するためには，セル ロースの効率的な分解が必須であると考えられているが，セ ルラーゼによるセルロースの加水分解速度は非常に遅く，セ ルロース系バイオマス変換プロセスのボトルネックとなって いる．そこで筆者らは，プロセッシブなセルラーゼによる結 晶性セルロースの分解メカニズムを明らかにするために，1 秒未満の時間分解能およびナノメートルの空間分解能を有す る 高 速 原 子 間 力 顕 微 鏡 を 用 い た セ ル ラ ー ゼ の 単 分 子 観 察 を 行ったところ，トリコデルマ菌由来セロビオヒドロラーゼI の分子が，結晶セルロースの表面に沿って一方向にスライド するように観察された．また，その動きは活性をなくした変 異酵素では見られなかったことから，本酵素がセルロースを 加水分解しながらプロセッシブに進んでいるというこれまで の 生 化 学 的 な 結 果 が，初 め て 分 子 レ ベ ル で 証 明 さ れ た．
個々の分子の動きは「動く」ステップと「止まる」ステップ を繰り返していたが，時間とともにセルロース表面における 酵素分子の渋滞が生じ，セルロースの分解速度が遅くなるこ とが明らかとなった．
はじめに
セルロースは，植物細胞壁の約半分を占める構成成分 であり，地球上で最も豊富に存在する生物資源（バイオ マス）である（1）
．化学的に安定な β
-1,4結合と分子内お よび分子間の水素結合によって結晶性セルロース（セル ロースI）を形成しているため，再生可能ではあるが難 分解性のバイオマスである．その一方で，セルロース分 解性の微生物はこのように難分解性のセルロースを常 温，常圧下で分解してしまうことを考えると，セルロー ス分解酵素（セルラーゼ）による結晶性セルロース分解 の仕組みを理解することで，バイオリファイナリーを基 本とする環境適応型かつ循環型な社会の構築も実現可能 となる．しかしながらセルロースの酵素分解で大きな問 題とされているのが，セルラーゼによる結晶性セルロー スの分解反応の遅さである．化学的に安定なセルロース の分解が，自然界において長い年月がかかることは当然 のこととも言えるが，セルロースを工業的に利用するた めには，短時間（長くとも数日程度）でグルコースにま で分解しなければ，石油を出発原料としたオイルリファ イナリーには太刀打ちできない．このような背景のな The Real Ability of Cellobiohydrolase during Crystalline Cellu-lose Hydrolysis Revealed by a Single-Molecule Observation Kiyohiko IGARASHI, Masahiro SAMEJIMA, 東京大学大学院農学 生命科学研究科
単分子観察によって明らかにされた結晶性セルロース 加水分解過程におけるセロビオヒドロラーゼの実力
五十嵐圭日子，鮫島正浩
か，セルラーゼによる結晶性セルロースをいかに効率良 く分解できるかを世界中の研究者が競い合っているので ある．
本稿では，近年筆者らが結晶性セルロース表面におけ るセルラーゼの挙動を観察するために取り組んでいる高 速原子間力顕微鏡 （high-speed atomic force microscopy ; HS-AFM） によるセロビオヒドロラーゼ （cellobiohydro- lase ; CBH） 分子の直接観察の結果に関して紹介させて いただくとともに，そこから推測されたセルラーゼの反 応機構に関して紹介させていただく．高速原子間力顕微 鏡は，これまでの原子間力顕微鏡の1,000倍にも達する 速い走査速度と，試料に与えるダメージを極限まで抑え る制御回路の構築で，タンパク質のような柔らかい生物 試料を無標識で直接観察することを可能にしたものであ り（2）
，最近になってさまざまな生体分子の可視化に応用
されてきている（3〜5）．筆者らは，この高速原子間力顕微
鏡を用いて，セロビオヒドロラーゼが結晶性セルロース を分解する様子を世界で初めて観察することに成功した ので報告する．セロビオヒドロラーゼによるセルロースの分解 自然界において，セルロース分解性の微生物はCBH を生産することで，安定なセルロースIを加水分解し て，セロビオース（グルコースが
β
-1,4結合した二糖）を生産する．そのような酵素のなかで，子嚢菌 が生産する CBH I （ Cel7A） は，最も研 究が進んでいるCBHの一つである（6）
．
Cel7Aは，糖 質加水分解酵素ファミリー7に属する活性ドメイン，お よび糖質結合モジュールファミリー1に属するセルロー ス結合ドメインの2つのドメインからなるセロビオヒド ロラーゼである（7） （図1
A）．活性ドメインは，50Åの長
いトンネル構造をした基質結合サイトを有しており，セ ルロース分子鎖中のグルコース9残基を取り込んで，還 元末端側からセロビオースを加水分解によって生成す る（8）．また，野生型 Cel7Aからセルロース結合性ド
メインを欠落させると，結晶性セルロースの分解能が著 しく低下するが，非晶性セルロースや可溶性のセロオリ ゴ糖の分解にはほとんど影響がないことが報告されてい る（9）．このような生化学的および構造学的特徴から，
Cel7Aはセルロース結合性ドメインによって結晶性 セルロース表面に吸着し，さらに活性ドメインがセル ロース分子鎖を連続的（プロセッシブ）に加水分解し て，セロビオースを生産していると考えられている（10）
．
高速原子間力顕微鏡によるセルラーゼの可視化（11）
緑藻由来の高結晶性セルロースをグラファイト基板上 に載せ， Cel7Aを添加し，高速原子間力顕微鏡に よって観察したところ，図1Bに示したように結晶性セ ルロース表面を動く粒子が多数観察され，この粒子は結 晶性セルロースの軸方向に一方向に動いていることがわ かった．以前の研究から， Cel7Aはセルロースの還 元末端から加水分解を進行すると考えられており，さら に Cel7Aとインキュベートした結晶性セルロースは 還元末端側から細くなっていくことが透過型電子顕微鏡 によって観察されている（12） ことから， Cel7Aは還元 末端から非還元末端に向かって動いていると考えられ た． Cel7Aは分子内に糖質結合モジュールファミ リー1に属するセルロース結合性ドメインを有すること が知られているが，本ドメインは3つの芳香族アミノ酸 によって結晶性セルロースの疎水表面（110面）に吸着 すると考えられている（13）
．高速原子間力顕微鏡による
観察では，結晶性セルロース表面だけでなく多数の Cel7A分子が基板であるグラファイト表面にも吸着 している様子が観察された．しかしながら，グラファイ ト表面に吸着した分子は，ブラウン運動をしているだけ で方向性をもった動きは観察されなかった． Cel7A 分子がセルロース表面でのみ一方向に動くという事実 は，基質表面への単純な疎水結合が運動性を引き起こし ているのではなく，基質と酵素のコンビネーションに よって移動していることがわかる．また， Cel7Aを タンパク質分解酵素で処理して得られる活性ドメインも 図1■高速原子間力顕微鏡によるTrCel7Aの一分子観察 A : セルロースIの結晶構造とTrCel7Aの3次元構造比較．B : 高速 原子間力顕微鏡で20秒毎の取得したTrCel7Aの微速度映像．ス ケールバーは50 nmで矢印はそれぞれ同じTrCel7A分子を示す．同様に観察したところ， Cel7Aと同じ濃度で添加し た場合はほとんど分子が観察されないが，10倍の濃度
（20
μ
M） にした場合には明らかに Cel7Aと同様に動 く分子が観察された．観察して得られる活性ドメインの 移動速度は Cel7Aのそれとほとんど変わらないこと から， Cel7Aが結晶性セルロース表面を移動するた めにはセルロース結合ドメインは必須ではなく，活性ド メインが重要な役割を果たしていると考えられた．セルラーゼはどうセルロース表面を動くのか 図
2
Aに示すように Cel7Aの活性ドメインは，基質 結合サイトとして−7 〜−1までの7残基，生成物結合 サイトとして＋1と＋2の2残基の計9個のグルコース残 基が活性ドメイン内に取り込まれることが報告されてい る（8）．そのなかで−
1と＋1サイトの間に位置している 212番目のグルタミン酸 （E212） は，加水分解反応時の 求核性残基であることが知られている（14）．その残基を
グルタミンに置き換えた変異酵素 （E212Q） は，シオグ サ由来結晶性セルロース，非晶性セルロースおよび可溶 性モデル基質（ -ニトロフェニル-β
-D-ラクトシド）のす べてに対して活性を示さなくなる．一方で，−7サイト に位置する40番目のトリプトファン （W40） は，基質結 合サイトの入り口付近に位置しており，基質であるセルロース分子と疎水的インタラクションをしていると考え られている残基であるが，それをアラニンに置き換えた 変異酵素 （W40A） では，非晶性セルロースと可溶性モ デル基質に対しては Cel7Aと同等の活性を示すもの の，結晶性セルロースの分解活性が著しく低下してい た．これらの変異酵素の結晶性セルロース表面での挙動 を，高速原子間力顕微鏡によって観察してみたところ，
E212Qは，多くの分子が結晶性セルロース表面で観察 されるが，それらの分子は全く動くことがなく，非常に 長い時間セルロース表面に止まっていることがわかっ た．また，W40Aを同様の実験に供したところ，E212Q とは違ってW40A分子はほとんどセルロース表面に止 まっていない．そこで観察する速度を毎秒1フレームか ら毎秒4フレームまで上げてさらに高速走査を行うと，
多くの分子が結晶性セルロース表面への吸着と脱着を繰 り返している様子が観察された．これらの変異酵素の挙 動から，図2Bに示したようにE212Qはセルロース分子 鎖を掴んでいる状態で止まっているのに対して，W40A ではセルロース分子鎖を捉えることができなくてセル ロース表面から離れてしまうという分子メカニズムが考 えられた．これまで，CBHがセルロース表面に吸着す るとき，セルロース結合ドメインが結晶表面を荒らし，
一本鎖になったセルロースが活性ドメインに送り込まれ るというメカニズムが提唱されてきた（15）
．しかしなが
ら，本研究での高速原子間力顕微鏡による変異酵素の観 察結果から，活性ドメインにおける基質結合と加水分解 の双方が，結晶性セルロース表面を動くために必須であ ることが示された．さらに， Cel 7Aと活性ドメイン の移動速度がほとんど変わらないという結果から，セル ロース結合ドメインはセルロース表面を活性化する機能 はなく，むしろ不溶性基質である結晶性セルロースの表 面における酵素濃度を高めるために働いている可能性が 高いことも示唆された．セルラーゼ分子が渋滞する？（16）
上述のように，セルラーゼを利用するうえで最も問題 とされているのが，その分解反応の遅さである．筆者ら は，高速原子間力顕微鏡を用いた観察によって，セル ラーゼの「遅さ」は何が原因なのかを把握することを試 みた．セルロースI上を動く Cel7A分子挙動をさら に詳細に調べたところ， Cel7A分子は止まっている 状態（平均速度は毎秒−0.32 nm）と動いている状態
（毎秒7.1 nm）を断続的に繰り返していることがわかり，
道路を走る自動車のように「止まる」と「動く」という 図2■A : Cel7A触媒ドメインの3次元構造とW40（左上）
およびE212（右下）．B :高速原子間力顕微鏡による観察から 推測された Cel7Aおよび変位酵素の動き
星印は高速原子間力顕微鏡で観察されたと考えられる分子の状態．
動作を繰り返していると考えられた．また，基質として シオグサ由来のセルロースIに加えて，セルラーゼによ る 分 解 性 が 非 常 に 向 上 し た セ ル ロ ー スIIIIを 用 い，
Cel7Aによる2種類の結晶性セルロースの分解を比べ たところ，セルロースIではセルラーゼ分子がモノレー ルのように一列に並んで進んでいるのに対して，セル ロースIIIIでは，結晶の表面全体を酵素が進んでいるこ とがわかった．この現象に関しても，結晶性セルロース 表面を動く酵素分子を自動車としてたとえると，セル ロースI上には「車線」が1レーンしかないのに対して，
セルロースIIIIでは複数の車線があるために，セルロー スIIIIの分解性が高くなることが示唆された．また，セ ルラーゼが同じ（実際には多少ずれているが）車線を前 後で通っていくとき，直前の分子が何かしらの理由で動 けなくなると，引き続く複数の Cel7A分子による
「渋滞」が起こってしまう様子も観察された（図
3
）．こ
れまで， Cel7Aに同菌由来のセロビオヒドロラーゼII（ Cel6A）を添加すると結晶性セルロースの分解が相 乗的に促進されることが報告されている．そこで，本現
象を高速原子間力顕微鏡によって観察したところ，はじ めに Cel6Aが結晶性セルロースを分解したところか ら Cel7Aが動き始める様子が観察されたことから，
相乗的に促進される結晶性セルロースの分解機構は，
Cel6Aが表面に作った「入口」と「出口」を利用し て， Cel7Aが渋滞せずに効率良く動けるようになっ ているからであることが推察された．アンモニア処理が 結晶性セルロースの分解速度を向上すること， Cel6A と Cel7Aの2つの酵素を使用することで効率良くセ ルロースが分解されることは，これまでにも報告されて いたが，これらの現象が「セルラーゼの渋滞解消」に よって説明できるということは，今回の高速原子間力顕 微鏡を用いた観察によって初めて明らかにされた．
おわりに
本実験において筆者らは，高速原子間力顕微鏡によっ て結晶性セルロース繊維に沿って移動する Cel7A分 子の様子を世界で初めて可視化することに成功した．ま た， Cel7Aは活性ドメインにおける連続的（プロ セッシブ）な加水分解反応によって動くことを明らかに するとともに，セルロース結合ドメインが主にセルロー ス表面における酵素濃度を高めるために働いている可能 性も示唆した．さらに，加水分解だけでなくセルロース 分子鎖に対する基質結合サイトの親和性が，プロセッシ ブな動きをするために重要であることも明らかにした が，一方でそのプロセッシブな動きのせいで Cel7A はセルロース表面で渋滞が起こってしまうというユニー クな現象を発見した．たしかにこれまでに得られた情報 でもこれらの分子機構を推測することは可能であるが，
古典的な生化学では決して証明することができない現象 であり，異なる学問の融合がブレークスルーをした典型 的な例だと思われる．しかしながら，本実験で得られた Cel7A分子の移動速度（毎秒7.1 nm）から算出され る加水分解速度は，セロビオース単位を約1.0 nmとす ると毎秒7回であり，実際に結晶性セルロースからセロ ビオースを生成する速度（毎分約1回）の400倍にも達 する．これまで，セルラーゼが「遅い酵素」であると考 えられてきた理由は，セルラーゼを用いてセルロースや セルロースを含むバイオマスを糖化する際に得られる糖 の生産速度の遅さにあるのだが，今回の高速原子間力顕 微鏡による一分子観察の結果は，セルラーゼの反応その ものが遅いのではなく，反応に加わっている酵素分子の 数が少ないことを示している．つまり系に存在する酵素 のほとんどが「駐車場」に止まっている状態で，実際に 図3■高速原子間力顕微鏡により捉えられたセルラーゼ Ce-
l7A分子
Cel7A分子がセルロース結晶上を右から左へ移動している様子 が観察されるが，時間経過とともにセルラーゼが 渋滞 を起こ している．
は道路を走っていないのである．これを解消するため に，より多くの自動車を道路に出せば，当然道路は渋滞 をする．つまり，道を広げずに自動車を増やしたり自動 車の速度を向上させたりしても，交通量の限界は道路に よって決められていると言えるわけである．これまで，
数多くの研究者がセルロースの糖化を向上させようとし てきたが，うまくいかなかった理由は「ボトルネック」
が基質であるセルロースの側にあることを認識してこな かったことが原因だと筆者らは考えている．本研究で得 られたような情報を今後も蓄積していくことが，セル ロース系バイオマスの糖化過程でのボトルネックである 酵素糖化速度の向上につながると筆者らは確信してい る．
謝辞：本研究を遂行するにあたり，金沢大学の安藤敏夫教授，内橋貴之 准教授，東京大学の和田昌久准教授，木村 聡助教，フィンランド技術 研究センターの Anu Koivula 主任研究員，Merja Penttilä 研究教授，
（株）生体分子計測研究所には多大なるご助力を賜りました．ここに感謝 の意を表します．
文献
1） D. N. S. Hon : , 1, 1 （1994）.
2） T. Ando : , 98, 12468
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16） K. Igarashi, T. Uchihashi : , 333, 1279 （2011）.
プロフィル
五十嵐圭日子（Kiyohiko IGARASHI）
＜略歴＞1994年東京大学農学部林産学科 卒業／同年同大学大学院農学生命科学研 究科修士課程／1996年同博士課程，その 間計6カ月間米国ジョージア大学生化学・
分子生物学科派遣研究員／1999年同修了，
博士（農学）／同年日本学術振興会特別研 究員 （PD）, その間2000年から2001年まで スウェーデン国ウプサラ大学バイオメディ カルセンター博士研究員／2002年東京大 学大学院農学生命科学研究科助手／2007 年身分名称変更により同助教／2009年同 准教授，現在に至る＜研究テーマと抱負＞
セルロース分解にかかわるさまざまな酵素 の反応メカニズムや進化を理解すること で，セルロース系バイオマスの利用に役立 てていきたい＜趣味＞フライフィッシン グ，子どもと工作
鮫島 正浩（Masahiro SAMEJIMA）
＜略歴＞1977年東京大学農学部林産学科 卒業／1982年東京大学大学院農学系研究 科博士課程修了，農学博士／同年日本学 術振興会奨励研究員／1983年東京大学農 学部助手，その間1990年から1992年まで 米国ジョージア大学生化学科博士研究員／
1995年東京大学大学院農学生命科学研究 科助教授／2001年同研究科教授，現在に 至る＜研究テーマと抱負＞セルロース系バ イオマスからの有用物質生産にかかわる酵 素工学とそのシステム化を通して，世のな かに貢献していきたい＜趣味＞音楽鑑賞，
山歩き，犬と散歩
