미세조류 및 해파리 - 유비쿼터스 해양 유용/유해 생물 관리 기술개발

가. 연구개발 수행 방법

(1) 해파리의 종판별을 위한 DNA chip 개발

(가) 해파리의 채집 및 유전자의 증폭

종판별을 위해 사용된 해파리 6종(

Aequorea coerulescens

Aurelia aurita, Bolinopsis sp, Cyanea nozakii,

Dactylometra quinquecirrha, Nemopilema nomurai

)을 거제 장목만에 서 채집하였다. 채집된 해파리로부터 G-spin

^™

Genomic DNA extraction kit(Intron, Korea)을 이용하여 gDNA를 분리하였다. Universal primer(COI forward primer 5′

-GGTCAACAAATCATAAAGATGTTGG-3′ 및 reverse primer 5′-TAAACTTCAGGGTG ACCAAAAAATCA-3′)를 이용하여 칩의 probe로 사용될 COI 유전자를 증폭하였다(Fig.

3.1.89). 증폭을 위한 PCR 조건은 전체 볼륨을 20 μL로 하였으며, 2.5 unit/μL Taq DNA polymerase, 4 mM Mgcl

2

, 0.4 mM dNTP를 혼합하였고, 각각의 프라이머 1 μL씩 사용하 였다. 또한 90℃-30초, 49℃-30초 및 72℃-1분의 사이클로 40사이클을 수행하였고, PCR 증폭된 각종의 COI 유전자들은 MEGA 프로그램을 통하여 align을 수행하였다(Fig. 3.1.90).

Fig. 3.1.89. jellyfish target gene (COI) amplification. Lane 1:

100 bp DNA ladder, Lane 2: A. coerulescens, Lane 3: A.

aurita, Lane 4: Bolinopsis sp, Lane 5: C. nozakii, Lane 6: D.

quinquecirrha, Lane 7: N. nomurai.

- 163 -

Fig. 3.1.90. Sequence alignment of mt COI genes from 6 jellyfish species.

(나) 한국에서 채집된 해파리의 유사성 확인 및 가계도 분석

Mitochondria 유전자인 COI의 각 종별 차이를 알아보기 위하여 해파리 6종의 identity를 확인하였다(Table 3.1.25.).

A. coerulescens

는 다른 5종과 약 34.3-79.8%의 identity를 볼 수 있었으며,

A. aurita

는 35.4-81.7%,

Bolinopsis sp.

는 34.3-35.8%,

Cyanea nozakil

는 35.7-82.5%,

D. quinquecirrha

는 35.8-82.8% 그리고

N. nomurai

는 34.9-82.8%의 identity를 나타내었다. 전체적으로 83% 이상의 identity가 있었으며, phylogenetic analysis 분석 결과 identity 비교와 유사한 종 간의 차이가 확인되었다(Fig. 3.1.90.). 따라서, 해파리 종 판별에 있어서 mitochondrial COI 유전자의 사용은 유용한 것으로 판단된다.

Identity (%) ^Aequorea coerulescens

Aurelia aurita

Bolinopsis sp.

Cyanea nozakil

Dactylometra quinquecirrha

Nemopilema nomurai Aequorea coerulescens 100 79.8 34.3 78.6 79.8 78.8

Aurelia aurita 79.8 100 35.4 79.3 81.7 80.7

Bolinopsis sp. 34.3 35.4 100 35.7 35.8 34.9

Cyanea nozakil 78.6 79.3 35.7 100 82.5 81.2

Dactylometra

quinquecirrha ^79.8 ^81.7 ^35.8 ^82.5 ¹⁰⁰ ^82.8

Nemopilema nomurai 78.8 80.7 34.9 81.2 82.8 100

Table 3.1.25. Nucleotide identities (%) of jellyfish species

- 164 -

Fig. 3.1.91. Topologies obtained via phylogenetic analysis of jellyfish COI gene.

(다) 프로브의 선별

해파리 6종의 sequence alignment 결과를 이용하여, 종 확인을 위한 specific probes 디 자인하였다(Table 3.1.26). 각 종마다 conserved site(336/713 base)가 아닌 variation이 확실한 서열(373/713 base)을 선별하였으며, 그 중 가장 효율이 좋은 세 가지의 probe를 선정하였다 (

A. coerulescens

: A_coe_1, A_coe_2, A_coe_3;

A. aurita

: A_aur_1,A_aur_2, A_aur_3;

Bolinopsis sp

.: B_sp_1, B_sp_2, B_sp_3;

C. nozakii

: C_noz_1, C_noz_2, C_noz_3;

D. quinquecirrha

: D_qui_1, D_qui_2, D_qui_3;

N. nomurai

: N_nom_1, N_nom_2, N_nom_3). Optimal signal density를 획득하기 위해 각 probe는 15 base로 제작되었으며, labeling 효율을 높이기 위해 양쪽 말단 (5’ and 3’)에 4 base의 sequence를 추가하였다. 제 작된 종 특이 probe는 DNA chip 위에 spot 하였다(Fig. 3.1.92).

Species Name RefSeq Start End Full_seq Tm

Aequorea coerulescens

A_coe_1

AGGAGGTGATCCTGT

654 669

CTGGAGGAGGTGATCCTGTTTTA

55.27391 A_coe_2

AGCAGGAGCTATAAC

588 603

TCCTAGCAGGAGCTATAACTATG

53.49131 A_coe_3

TCCAGGATTAACAAT

500 515

GAGCTCCAGGATTAACAATGGAT

53.49131 Aurelia aurita

A_aur_1

AGGAGGAGATCCAAT

654 669

CTGGAGGAGGAGATCCAATTTTA

53.49131 A_aur_2

ATCCTTCTTTGACCC

633 648

ATACATCCTTCTTTGACCCTGCT

53.49131 A_aur_3

GCTGGGGCTATTACA

589 604

CTTGGCTGGGGCTATTACAATGT

55.27391 Bolinopsis sp

B_sp_1

CTTGTTCCAGCACAT

669 684

CAGTCTTGTTCCAGCACATTTTC

53.49131 B_sp_2

GGCACCAGCTTCTTC

628 643

CTTCGGCACCAGCTTCTTCTCAG

58.83913 B_sp_3

CACTATGATGCTGAT

600 615

CAGTCACTATGATGCTGATGGAC

55.27391 Cyanea

nozakii

C_noz_1

CCCTATTTTATTCCA

663 678

GAGACCCTATTTTATTCCAACAC

51.7087 C_noz_2

GGCAGGAGCAATAAC

588 603

TGTTGGCAGGAGCAATAACTATG

53.49131 C_noz_3

TCCTGGAATGACTAT

500 515

GAGCTCCTGGAATGACTATGGAT

55.27391 Dactylometra

quinquecirrha

D_qui_1

GGAGATCCTGTTTTG

658 673

GGGAGGAGATCCTGTTTTGTTTC

55.27391 D_qui_2

GGAGCCATTACAATG

592 607

GGCTGGAGCCATTACAATGTTAT

53.49131 D_qui_3

TGTTTTCATAACCGC

542 557

GGTCTGTTTTCATAACCGCAATA

51.7087 Nemopilema

nomurai

N_nom_1

GACCCAATATTATTT

661 676

GGGAGACCCAATATTATTTCAAC

51.7087 N_nom_2

CATTACCTGTTTTAG

575 590

CTATCATTACCTGTTTTAGCTGG

51.7087 N_nom_3

GATCAGTTTTAGTTA

538 553

GTTTGATCAGTTTTAGTTACCGC

51.7087 Table 3.1.26. Probe selection for Microarray analysis

- 165 -

Fig. 3.1.92. Layout of DNA microarrays for jellyfish species identification.

(2) 미세조류 종판별을 위한 DNAchip 개발 및 종조성 확인 연구

(가) 미세조류 CO1 유전자 염기서열 분석 및 가계도 분석

부경대학교 미세조류 은행과 한국해양과학기술원으로 부터 분양받은 총 25종의 미세조 류(

Achnanthes longipes ,Amphora sp., Asterionella glacialis, Chaetoceros atlanticus, Chaetoceros didymus, Chaetoceros septentrionalis, Chaetoceros vistulae, Chlorella ellipsoidea, Chlorophyta UF, Coscinodiscus perforates, Cylindrotheca closterium, Cylindrotheca fusiformis, Cymatosira lorenziana, Ditylum brightwellii, Gloeocystis gigas, Gyrodimium impudicum, Heterosigma akashiwo, Melosira nummuloides, Navicula sp., Nitzschia pungens, Nitzschia subpacifica, Prorocentrum minimum, Skeletonema costatum, Stephanopyxis turris, Thalassiosira allenii

)로부터 COI 유전자를 클로닝하고, 염기서열을 분석하였다(Fig. 3.1.93). 749 bp의 nucleotide composition 분석 결과 평균적으로 A(25%), T(38.7%), G(19.2%), C(17.1%)로 구성되어 있는 것으로 나타났다. 또한 conserved sites는 269/749(35.9%), variable sites는 480/749(64.1%), singleton sites는 60/749(8%)로 분석되었다. 종간의 identity와 diversity의 결과에서도 대부분의 종과 종간 의 차이가 85.9% 이하의 identity를 나타내었다.

A. longipes

와

P. minimum

에서는 98.5%

의 identity를 보였고, diversity 에서도 10.5%의 작은 차이가 있었다. Phylogenetic analysis에서도 또한 identity 비교와 같은 종 간의 차이가 나타났다(Fig. 3.1.94). 따라서, 미세조류 종 판별에 있어서 mitochondrial COI 유전자의 적용은 유용한 것으로 판단된다.

- 166 -

Fig. 3.1.93. Sequence alignment of mtCOI genes from 25 microalgal species.

- 167 -

% 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

1 ^- ^60.8 ^61.4 ^60.8 ^60.8 ^60.7 ^62.8 ^64.4 ^62.8 ^60.9 ^61.8 ^61.8 ^62.2 ^59.7 ^59.4 ^65.2 ^62.2 ^61.8 ^61.1 ^59.5 ^63.4 ^98.5 ^62.7 ^61.7 ^64.0 2 ^57.1 ^- ^74.4 ^75.8 ^74.5 ^74.5 ^73.7 ^75.5 ^54.1 ^78.3 ^79.9 ^80.3 ^61.6 ^75.8 ^78.7 ^75.9 ^72.0 ^72.5 ^74.2 ^75.9 ^71.4 ^60.5 ^73.9 ^75.8 ^59.6 3 55.0 31.4 - 83.1 80.7 81.8 81.4 76.2 55.4 79.4 75.6 75.1 60.1 83.1 74.6 75.5 72.7 74.4 80.1 72.0 79.7 61.4 82.0 77.3 58.3

4 ^56.3 ^29.3 ^19.2 ^- ^85.1 ^82.5 ^85.1 ^76.3 ^55.5 ^80.3 ^75.6 ^76.3 ^60.3 ^85.9 ^77.0 ^76.9 ^72.0 ^77.9 ^82.0 ^73.6 ^79.3 ^60.3 ^83.1 ^81.1 ^60.0 5 56.6 31.2 22.3 16.7 - 80.7 83.4 76.2 54.7 79.4 75.8 75.1 60.3 83.5 74.4 76.4 69.7 79.4 77.3 71.1 77.9 60.8 81.7 79.7 59.0

6 ^56.6 ^31.2 ^20.9 ^19.9 ^22.3 ^- ^82.0 ^75.5 ^55.3 ^78.8 ^77.9 ^77.0 ^61.7 ^85.6 ^75.4 ^75.5 ^72.3 ^76.3 ^80.0 ^73.0 ^78.3 ^61.1 ^82.3 ^78.7 ^59.4 7 52.0 32.5 21.5 16.7 18.9 20.7 - 75.6 55.5 80.4 75.5 76.1 61.0 83.5 74.9 74.8 71.8 76.8 80.3 73.3 78.5 62.5 81.7 77.6 60.1

8 ^49.1 ^29.7 ^28.7 ^28.4 ^28.6 ^29.8 ^29.5 ^- ^57.7 ^76.9 ^76.5 ^75.1 ^63.2 ^77.5 ^75.1 ^80.8 ^72.1 ^74.2 ^74.4 ^72.9 ^73.5 ^64.5 ^75.4 ^75.2 ^61.2 9 51.5 72.4 68.4 67.8 70.0 68.2 67.6 62.4 - 53.9 55.3 55.7 68.4 55.3 53.1 58.1 57.1 55.0 55.5 54.2 56.1 62.8 56.4 53.8 67.9

10 ^56.0 ^25.6 ^24.1 ^22.9 ^24.1 ^24.9 ^22.8 ^27.7 ^72.3 ^- ^79.4 ^77.2 ^62.2 ^83.2 ^77.0 ^76.0 ^70.9 ^79.0 ^77.7 ^75.1 ^78.0 ^60.6 ^79.5 ^81.0 ^59.1 11 54.8 23.5 29.5 29.5 29.3 26.2 29.7 28.3 69.2 24.1 - 82.8 64.0 79.5 80.3 75.7 75.1 73.5 75.5 77.7 74.1 61.4 75.5 78.3 60.1

12 ^54.8 ^22.9 ^30.4 ^28.5 ^30.4 ^27.4 ^28.9 ^30.3 ^67.8 ^27.3 ^19.5 ^- ^61.1 ^77.4 ^79.7 ^75.6 ^73.2 ^73.5 ^74.9 ^77.0 ^71.4 ^61.7 ^74.8 ^76.5 ^60.7 13 53.4 54.1 57.0 56.7 56.7 53.6 55.3 50.8 41.6 52.6 49.1 55.0 - 62.9 61.8 60.2 62.0 55.8 59.7 61.1 60.4 62.0 61.0 59.7 68.5

14 ^58.8 ^29.2 ^19.2 ^15.6 ^18.7 ^16.0 ^18.7 ^26.7 ^68.6 ^19.1 ^23.9 ^26.9 ^51.2 ^- ^77.5 ^76.9 ^73.2 ^77.8 ^82.5 ^74.6 ^79.5 ^60.0 ^84.3 ^81.1 ^60.5 15 59.6 25.0 31.0 27.4 31.4 29.9 30.6 30.4 74.3 27.5 22.9 23.6 53.3 26.7 - 77.9 73.9 71.0 75.1 75.7 73.0 59.3 73.5 75.2 58.3

16 47.7 29.2 29.8 27.7 28.3 29.7 30.9 22.2 61.6 29.0 29.4 29.5 56.9 27.5 26.3 - 72.8 73.3 74.3 72.2 73.2 65.3 74.5 76.3 60.5

17 ^52.7 ^35.1 ^34.1 ^35.1 ^38.9 ^34.9 ^35.4 ^34.9 ^63.9 ^36.8 ^30.3 ^33.1 ^53.3 ^33.3 ^32.1 ^33.9 ^- ^68.3 ^69.4 ^67.7 ^71.4 ^62.5 ^68.9 ^71.0 ^61.2 18 54.1 34.2 31.4 26.3 24.2 28.6 27.9 31.6 68.9 24.8 32.8 32.8 66.9 26.4 36.7 33.0 41.2 - 74.8 70.4 74.4 62.2 75.8 81.3 57.8

19 ^55.7 ^31.6 ^23.1 ^20.7 ^27.0 ^23.3 ^23.0 ^31.4 ^67.6 ^26.5 ^29.7 ^30.6 ^57.9 ^20.0 ^30.3 ^31.5 ^39.3 ^30.8 ^- ^72.4 ^81.4 ^61.0 ^79.3 ^77.6 ^59.1 20 60.0 29.2 35.1 32.6 36.5 33.5 33.1 33.8 71.2 30.3 26.5 27.5 54.9 30.9 29.4 34.7 42.3 37.6 34.4 - 68.7 59.5 72.6 73.6 57.5

21 ^50.8 ^36.1 ^23.9 ^24.3 ^26.4 ^25.8 ^25.6 ^32.8 ^66.3 ^26.2 ^31.9 ^36.1 ^56.4 ^24.0 ^33.6 ^33.5 ^36.0 ^31.5 ^21.4 ^40.7 ^- ^63.4 ^79.9 ^76.5 ^59.4 22 10.5 57.7 55.0 57.8 56.5 55.6 52.6 48.8 51.5 56.6 55.7 55.2 53.6 58.2 60.1 47.3 52.1 53.0 56.2 59.8 50.9 - 62.0 61.1 63.2

23 ^52.6 ^32.1 ^20.7 ^19.2 ^21.0 ^20.3 ^21.1 ^30.0 ^65.8 ^23.9 ^29.8 ^30.8 ^55.2 ^17.6 ^32.7 ^31.2 ^40.3 ^29.4 ^24.3 ^34.2 ^23.6 ^54.2 ^- ^78.5 ^59.6 24 54.7 29.3 27.1 21.8 23.7 25.1 26.8 30.1 72.1 22.1 25.6 28.2 57.9 21.8 30.1 28.5 36.7 21.7 26.7 32.6 28.3 56.0 25.4 - 58.8

25 ^49.3 ^58.4 ^61.2 ^57.3 ^59.5 ^58.5 ^57.1 ^54.7 ^42.1 ^59.3 ^56.9 ^55.7 ^41.0 ^56.3 ^61.0 ^56.4 ^54.9 ^61.9 ^59.2 ^62.8 ^58.5 ^51.0 ^58.1 ^59.9 ^- Table 3.1.27. Nucleotide identities (upper) and divergence (lower) of microalgal species

- 168 -

Fig. 3.1.94. Topologies obtained via phylogenetic analysis of microalgal COI gene.

(나) 프로브의 선별

미세조류간의 종 분류를 위해 mitochondria COI 유전자를 이용하여 species-specific probe를 선별하였다(Table 3.1.28), 각 종간 variation site에 기초하여 21-23 bp의 길이로 2 base 이상 차이가 있는 probe를 제작하였다.

A. longipes, Ch. septentrionalis, Cy.

fusiformis, D. brightwellii, G. gigas, Gy. impudicum, H. akashiwo, N. subpacifica, P.

minimum, S. turris

는 1개의 probe로 2개의 position,

Amphora sp., A. glacialis, Ch.

atlanticus, Ch. didymus, Ch. vistulae, C. ellipsoidea, Ch. UF, C. perforates, Cy.

closterium, Cy. lorenziana, Navicula sp., N. pungens, S. costatum, Th. allenii

는 2개의 probe로 4개의 position,

M. nummuloides

는 3개의 probe로 6개의 position에 spot 하였다 (Fig. 3.1.95).

- 169 -

Species Position RefSeq Start End

Achnanthes longipes 3,4

CACTGCAAAAATCAGATAGAGCG

26 49

Amphora sp. 5,6

GCTCCAGGCTTTTTTATGCATAA

544 567

7,8

GAAACTACAGTTCCAATAACACC

55 78

Asterionella glacialis 9,10

GATCCTGTCTTATACCAGCATTT

706 729 11,12

CTGGTGCTTCATCAATATTAGGT

485 508 Chaetoceros atlanticus 13,14

AAAGATAGAGCAGTCCCAGCTAC

58 81

15,16

CTACTCCAGATATTGCACCAAAA

39 62

Chaetoceros didymus 17,18

TTTTTGACCCTGCAGGGGGTGGA

638 706 19,20

CCAGTGCTTGCGGGAGCTATTAC

625 648 Chaetoceros septentrionalis 21,22

GGCAATTACCATGCTTTTAACTG

639 662 Chaetoceros vistulae 23,24

GGCTGTCTTAATAACAGCTTTCT

585 608 25,26

TGGCGCAGTGGATTTAGCTATTT

447 470 Chlorella ellipsoidea 27,28

GATCCCGTATTGTACCAACATTT

706 729 29,30

GTATGAGTATGCATAGACTACCT

551 574

Chlorophyta UF 31,32

CCCAGTCTTGTTCCAGCACAT

709 730

33,34

TGCTGATGGACATCCACTTCG

654 675

Coscinodiscus perforatus 35,36

CAGGTGCTATCACAATGCTTTTA

635 658 37,38

TATCGGGAGCTGCTTCTATTTTA

482 505 Cylindrotheca closterium 39,40

CCAGAAATGGCTTGGCATAAATT

547 570 41,42

AAATATGCGAAGTCCAGAAATGG

534 557 Cylindrotheca fusiformis 43,44

GGAGGTGATCCAATACTTTATCA

700 723 Cymatosira lorenziana 45,46

CTTTAGTGCAACGGGTGGTGGTG

684 704 47,48

GCTTTTGACAGATCGTTTTTACG

651 674 Ditylum brightwellii 49,50

CATCTTTCTGGTGCTTCTTCTAT

478 501 Gloeocystis gigas 51,52

GAGAGCAATAGGAATGACATTTC

540 563 Gyrodimium impudicum 53,54

CTACCTTTTACGATCCGGCAGGA

677 700 Heterosigma akashiwo 55,56

TCCTTGGGCTATCCTTATCAC

580 601 Melosira nummuloides

57,58

GATCCCGTTCTTTATCAACATCT

707 729 59,60

TTTTTTTGACCCCGCAGGAGGCG

681 704 61,62

CTGTTCTTGCTGGAGCTATTACT

626 649

Navicula sp. 63,64

GATCCAGTTTTATACCAGCACTT

706 729

65,66

GTGTGGTCAGTATTTTTAACAGC

580 603 Nitzschia pungens 67,68

GGAGGAGACCCTATATTATATCA

100 723 69,70

GCAGCAGGTATAACTATGTTGTT

634 657 Nitzschia subpacifica 71,72

CTGTGTTATTCCAGCACTTATTC

710 733 Prorocentrum minimum 73,74

CAAAAATGAGATAAAGCGTGCCA

21 44 Skeletonema costatum 75,76

GTCTTGTTTCAGCATCTTTTCTG

712 734

77,78

CTGTTTTAGCTGGAGCTATTACA

626 649 Stephanopyxis turris 79,80

CCTTTATTTGCCTGGTCAGTTTT

571 594 Thalassiosira allenii 81,82

CAGCGTTCTTTAATGCTGCTG

678 699 83,84

GTTGATTACTGATCGTCACTTTG

651 674 Table 3.1.28. Probe selection for microarray analysis

- 170 -

Fig. 3.1.95. Layout of DNA chip for microalgal species identification.

(3) PCR기법을 이용한 종판별 기술 개발 및 현장 적용

(가) 해파리 유전자의 탐색 및 분자 마커 클로닝

거제 장목 및 통영 앞바다에서 채집한 해파리 4종을 이용하여 PCR을 통한 종 조성 확 인 연구를 수행하였다. Consensus한 COI 검출 primer(LCO1490: GGTCAACAAATCATA AAGATATTGG, HCO2198: TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA)를 이용하여 분자 마 커 유전자를 증폭하였으며, 증폭조건은 annealing 온도를 50℃로 하여 40사이클을 수행하였 다. 보름달물해파리(

Aurelia aurita

)는 109 bp, 유령해파리(

Cyanea nozakii)

120 bp, 커튼원 양해파리(

Dactylometra quinquecirrha

) 100 bp, 노무라잎깃해파리(

Nemopilema nomurai)

는 112 bp의 밴드를 얻었다(Fig. 3.1.96). 증폭된 유전자를 클로닝하고, 염기서열을 분석하였 다(Fig. 3.1.97). 종 특이적인 프라이머는 AlleleID 7이라는 프로그램을 통하여 다른 종에는 결합이 불가능한 서열을 획득하였으며, 그 서열을 바탕으로 프라이머를 제작하였다(Table 3.1.29).

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Fig. 3.1.96. COI amplification by PCR in jellyfish.

Fig. 3.1.97. Sequence analysis of jellyfish.

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번호 종명 Primer 서열

1 Aurelia aurita ^5’ CCGTACTGGTAACCGCAATAT 3’ GCAGGGTCAAAGAAGGATGTAT 2 Cyanea nozakii ^5’ TCTGGAGGTTCTGTTGATATGG

3’ CCTGCTAGGACTGGTAATGATA 3 Dactylometra quinquecirrha ^5‘ GCTATGTTAGGTGACGATCAGA 3' ACAAGGCAGGAGGTAATAATCA 4 Nemopilema nomurai ^5' GGCTTGGCTAACTGGATGATTC

3’ CTGGTGCCGAAGTGGATGT Table 3.1.29. Construction of species specific primers in jellyfish

(나) 적조 원인종 탐색을 위한 분자 마커 클로닝

남해에서 적조에 관련된 미세조류를 확보하기 위하여 거제 장목 앞바다에서의 샘플링을 통해 미세조류를 순수 분리하였으며, 순수분리를 통하여 획득 불가능한 종은 부경대학교 미 세조류 은행을 통해 배양을 하였다. 각 종에 대한 전자현미경(SEM) 사진을 확보하였다 (Fig. 3.1.98).

Fig. 3.1.98. SEM image for microalgae species isolation.

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2

배지를 이용하여 20℃에서 미세조류를 배양하였으며 배양된 미세조류를 이용하여 consensus한 COI 검출 primer(LCO1490: GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG, HCO2198: TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAA TCA)를 이용하여 분자 마커 유전자의 증 폭하였다(Fig. 3.1.99). 샘플링된 모든 종에서 약 700 bp 이상의 COI 유전자가 증폭되었으 며, pGEMT-easy 벡터를 이용하여 클로닝하였다. 클로닝된 유전자는 T7 프라이머와 SP6 프라이머를 통해 서열정보를 분석하였다(Fig. 3.1.100).

Fig. 3.1.99. COI amplification by PCR in microalgae.

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Fig. 3.1.100. Sequencing analysis of microalgae

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(다) 적조 원인 미세조류의 종 특이적 프라이머 개발 및 PCR을 통한 종 확인

종 특이적인 프라이머는 AlleleID 7이라는 프로그램을 통하여 다른 종에는 결합이 불가 능한 서열을 획득하였으며, 그 서열을 바탕으로 프라이머를 제작하였다(Table 3.1.30.). 각 미세조류는 intron kit을 이용하여 genomic DNA prep과 PCR을 수행하였다. PCR을 위한 template의 양은 각 샘플당 3 ng/μL로 하여 total volume을 1 μL부터 3 μL까지 조건을 변 화 시켰으며, 최종적으로 2 μL를 넣었을 경우 즉 각 미세조류 샘플당 6 ng을 넣었을 때 가 장 좋은 결과를 얻었다. Annealing 온도의 변화는 55℃에서 65℃까지의 변화를 주었으며, 결과적으로는 61℃ 조건에서 가장 확실한 밴드를 얻었다. 사용한 Taq은 Takara에서 제품화 한 EX Taq을 사용하여 실험을 수행하였으며, 0.2 μL부터 0.5 μL까지 사용하였을 때 0.2 μ L를 사용한 경우 밴드가 거의 생성되지 않은 반면에 0.5 μL의 경우 거의 대부분의 종에서 도 비특이적인 밴드가 생성되었다. 최종적으로 0.3 μL를 사용한 조건에서 만족할 만한 결과 를 얻었다. 결론적으로 template의 농도는 각 샘플당 최소 6 ng, annealing 온도는 61℃, taq의 볼륨은 0.3 μL 사용하여 PCR을 수행하였을 경우 최적의 결과를 얻을 있는 것으로 판단된다.

위의 조건을 토대로 하여 PCR을 통해 각 미세조류의 종 동정이 가능한지에 대해 실험을 수행하였다. 각 종에 대한 특이적 프라이머를 이용하여 positive(only 프라이머에 맞는 미세 조류)와 negative(프라이머에 맞지 않는 다른 종의 mixture) 그리고 total 샘플(순수분리하 여 gDNA를 준비한 모든 미세조류의 mixture)로 나누어 PCR을 수행하였다. P는 positive, N은 negative 그리고 T는 total 샘플을 나타내며 각 번호는 그 종의 임의적인 숫자로 라벨 링하여 사용하였다.

(라) 미세조류 종 특이적 프라이머의 현장 적용

종 특이적 프라이머의 현장 적용 가능성을 파악하기 위하여 남해의 통영 바다 목장에서 매달 미세조류를 채집하였으며 gDNA를 추출하였다. 1월부터 6월까지의 샘플을 이용하여 현장 적용 가능성을 분석하였다. Template의 양은 100 ng/μL로 하여 1 μL를 사용하였으며 다른 조건은 앞서 확인된 종 특이적 프라이머 조건과 동일한 조건으로 실험을 수행하였다.

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번호 종명 Primer 서열

1 Skeletonema marioni ^5’ GCTGGAACCGCATTGTCTT 3’ TGTCCTGTGACGATAACATTGT 2 Nitzschia improvisa ^5’ TGAGAATTAGCAGGTCCAGGTA 3’ AAACGAGGGAAAGCCATATCAG 3 Chaetoceros brevis ^5’ AACTTAGCACAACCGAACAGTA 3' TACAGTCCAACCAGTACCTACA 4 Heterocapsa triquetra ^5' GCGATGCCACGAATGAATAA

3’ TTGAAGAACCAGCGGAGGAT 5 Skeletonema dornii ^5' GGCGGTGGACATGGCAAT

3' GCAATGAGAGCAACAGCAAGA 6 Ditylum brightwellii ^5’ GCTATATCTGGTGTTGCTGGTA

3’ ACCTCCTGAGTGTGCTGTAG 7 Asterionellopsis glacialis ^5’ AATCGCTTCGGTTCTAACTGAA

3’ ACATTGTGATTGCTCCTGCTAA 8 Chaetoceros protubalans ^5’ GGGCTCCTGACATGGCTTT

3’ CAGTACCTGCTCCAGACTCTAC 9 Navicula gregaria ^5’ GTCATTCAGGAGGTTCTGTTGA 3’ GCCATTTCTGGACTTCGCATA 10 Heterosigma akashiwo ^5’ GGTAGAAGCAGGAGCAGGAA

3’ ATAAACACAGCCCACACAAACA 11 Coticribra weissflogii ^5’ ATCAAGTGCAACAGCTCATTCT

3’ ACAACATTGTGATCGCTCCAG 12 Chaetoceros diadema ^5’ TGGTGCTGTGTCTGGTGTT

3’ CCTGTTCCTACTCCTGCTTCT 13 Stephanopyxis turris ^5’ CTTACCTTAGAATCGCCTGGAA

3’ CTGTACCAACTCCTGCTTCTG 14 Prorocentrum minimum ^5’ GTCCTGGTATATCCGCCTTGA 3’ CGACATCAGCAACAGCACAA 15 Akashiwo sanguinea ^5’ CTGACATGGCTTTCCTCGTTTA

3’ CCAGTACCAGCTCCTCCTTC 19 Chaetoceros debilis ^5’ AGGACATGCGTTCGTTATGATT

3’ CCCACACCTGCTTCTGCTA 20 Thalassiosira gravida ^5' CAACGGTCACCTGTGGAATG

3' CGAGAGCGGCGGATAGAG Table 3.1.30. Construction of specific primers in microalgae

(4) 적조 원인종 종 조성 분석을 위한 자동화 시스템의 개발

자동화 시스템을 개발하기 위하여 RNA 서열의 상동화를 이용하여 형광 검색을 수행할 수 있는 방법인 FISH method를 이용하였다.

Heterocapsa circularisquama

28S DNA 시퀀 싱 결과를 이용하여 NCBI web site에서 blast 분석을 수행하였으며, 유전자 서열이 비슷한 약 20개 종의 미세조류를 확인하였다. 확인된 미세조류와 유전자 서열 분석을 통해 1 base 또는 2 base 차이가 있는 28S DNA 부분을 선별하였으며, 그 부위를 이용하여 5개의 probe를 제작하였고 각각의 probe의 5‘ 방향에 FAM dye로 labelling을 수행하였다(Fig.

3.1.101).

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Fig. 3.1.101. Probe design method for FISH analysis.

FISH method의 전체적인 과정은 Fig. 3.1.102과 같다.

① SET buffer 및 10% IGEPAL과 같은 FISH과정에 사용된 solution 제조 ② Filter set 장착

③ Saline과 formalin 으로 미세조류를 고정

④ 고정된 미세조류를 filter를 통해 membrane 에 부착 ⑤ 만들어진 Probe로 부착된 미세조류를 염색

⑥ 42도씨에서 30분간 반응함으로써 미세조류 세포내로 probe가 들어가 염색이 완료 ⑦ probe를 washing 단계를 통해 제거

⑧ slide glass에 membrane을 옮기고 형광 현미경을 통해서 관찰

Fig. 3.1.102. Diagram of FISH method.

Dalam dokumen 유비쿼터스 해양 유용/유해 생물 관리 기술개발 (Halaman 167-190)