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3 장. 연구개발 수행 내용 및 결과
제 1 절. 주요 해양생물 DNA바코드 분석과 분자마커 활용 종판별 기술 개발 및 현장 적용과 평가
제 2 절. 유해 생물 탐지 음향시스템 구축과 운용 기술
제 3 절. 주요 유용/유해생물 지리정보 DB구축, 국제 네트워크화
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3 장. 연구개발 수행 내용 및 결과
제 1 절. 주요 해양생물 DNA바코드 분석과 분자마커 활용 종판별 기술 개발 및 현장 적용과 평가
1. 무척추동물
가. 연구개발 수행 방법
(1) 종판별 프라이머 제작을 위한 Reference Data확보 및 프로브/프라이머 설계
본 사업에서 구축한 우리나라 해양생물지리정보시스템(KOBIS)의 데이터베이스를 기준으로 한국 해역에 분포하는 것으로 보고된 무척추동물의 종 정보를 파악하여 시료를 채집하였으며 해당 종의 COI유전자의 5‘ 방향의 약 650 bp 부분의 DNA바코드를 분석하였다. 한국 연근해에 서식하되 시료 를 확보하지 못한 종의 경우, NCBI와 BOLD의 자료를 통해 확보하였다.
(2) 연성저질 서식 유용 저서생물의 시료 확보 및 DNA바코드 분석
(가) 대형저서동물
대상해역인 남/서해안의 연성저질에 서식하는 유용성 무척추 동물의 현황 및 분포 특성을 분석 하기 위해 기존에 보고된 문헌조사 및 현지답사를 통해 수시로 채집 및 구입하였다. 1차년도(2008 년)에는 대상해역의 유용성 해양 무척추동물 자원의 유전적 특성을 유추하기위해 간성, 고성, 주문 진, 속초, 포항, 사천, 여수, 벌교, 격포, 오천, 태안 등 전국의 주요 산지 및 주요 항구의 잠수기 어 판장을 대상으로 시료를 수집하고 현황 조사를 실시하였다. 2차, 3차년도(2009, 2010년)에는 남해안 의 연성저질에 서식하는 유용성 무척추동물 시료 확보를 위하여 실해역 채집 및 대표적인 어판장 을 대상으로 시료를 구입하였다. 4차, 5차년도(2011, 2012년)에는 대상해역을 서해안으로 옮겨 서해 안의 연성저질에 서식하는 유용성 무척추동물을 대상으로 실해역 채집 및 대표적인 서해안의 어판장 에서 시료를 구입하였다. 채집된 시료는 디지털 카메라로 외형을 사진 촬영하고, 시료의 일부를 소 독된 실험용 가위와 해부칼로 절단하여 알코올에 고정 후, 연구실로 이동하여 분석을 실시하였으며, 나머지 시료는 급속 냉동하여 냉동고에 보관하였다.
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한국의 남해안과 서해안에 서식하는 대형저서동물종의 식별 또는 종의 객관적인 구분을 목적으 로 미토콘드리아 유전체의 COI 유전자를 활용하여 DNA 바코딩 분석을 시도하였다. COI 유전자 전 체 중에서 범용 프라이머로 알려진 부분을 증폭하여 각 생물종의 유전적 변이 정도를 측정하였다.
이 부위는 COI 유전자의 앞쪽 600여 염기서열에 해당한다. 각 종에서 3～30 개체씩을 선별하여 각 개체별로 DNA를 추출한 후 PCR 증폭과 COI 유전자 염기서열 결정을 수행하여 염기서열을 획득하 였다. DNA의 추출은 SolGent gDNA prep kit(solution type)과, SolGent animal tissue kit(sgd64-S120/SGP3301)을 사용하였으며, PCR은 Template로 추출된 DNA의 농도에 따라 1/70 dilution 혹은 원액을 7㎕ 사용하여, Primer (HCO2198 [5’-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3’] + LCO1490[5’-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3’])를 첨가한 Mixture 를 만든 후, 95℃:15min, 95℃:20sec, 58℃:40sec, 68℃: 1min, 68℃:3min, 8℃:ever 조건으로 PCR을 실시하였다. 전기영동 된 PCR산물은 (주)Solgent에 분석을 의뢰하여 자동염기서열 분석기를 이용해 염기서열을 획득하였다. 얻어진 염기서열은 multialignment algorithm으로 정렬하고, 결정 한 COI유전자의 염기서열에서 MEGA2 program의 neighbor-joining(NJ) 방법을 사용하여 계통분 석 및 계통도를 구하였다. 또한, 통계적 유의성을 가지기 위해서 bootstrap을 1000회 수행하였다.
(나) 중형저서동물
수생태환경 모니터링으로 유용한 생물학적 평가방법 개발 및 소형무척추동물 다양성 분석을 위 한 목적으로 해당 해역인 여수 해역(가막만)에서 조사를 실시하였다. 조사기간은 2008 ～ 2010년까 지였으며, 2008년에 5개 정점, 2009 ～ 2010년에는 10개 정점에서 조사를 실시하였다. 계절별로 2008년에 5월과 8월, 2009 ～ 2010년에는 2월, 6월, 8월에 걸쳐 정량, 정성 조사 및 분석 실시하 였다. 정점은 여수해역인 가막만의 서식지 환경 특성별 구분을 위해 St.1 하수처리장 배출구 앞, St.2 꼬막 양식장, St.3 가두리 양식장, St.6, 7 어항단지 및 하천유입 지역, St.10 여수 시내 앞 지 역, St.4, 5 청정 일반 해역으로 선정하였으며, 현장조사시 소형선박을 임차하여 각 정점에서 조사를 실시하였다(Fig. 3.1.1, Table 3.1.1). 시료의 채집은 Smith-McIntyre garb과 소형 van Veen grab을 이용하여 저층퇴적물을 선상에 올린 후, 정량분석을 위한 시료는 현장에서 직접 직경 2.6
㎝의 밑단이 절단된 플라스틱 주사기를 사용하여 퇴적물의 표층에서 5 ㎝ 깊이까지 채집한 후, 로즈 벵갈(Rose Bengal) 단백질 염색제를 혼합한 5% 중성 포르말린으로 고정했다. 종 분석 및 DNA 추 출을 위한 정성분석 시료는 채집된 표층퇴적물 시료를 현장에서 일부는 5% 포르말린으로 고정하고, 일부는 드라이아이스를 이용하여 급속 냉동하여 연구실로 운반하였다. 연구실로 운반되어진 생물 시 료는 연구실에서 각 크기의 체(1 ㎜, 500 ㎛, 250 ㎛, 125 ㎛, 63 ㎛, 37 ㎛)로 크기별로 걸러내어 광학현미경 하에서 분류 및 계수하였다. 생체량 분석은 Shirayama(1983)의 중형저서동물의 주요 분류군별 개체 크기별 ash free dry weight (㎍) 환산 값을 사용하였다.
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한국의 남해안과 서해안의 간극수 환경에 서식하는 중형저서동물종의 식별 또는 종의 객관적인 구분을 목적으로 핵 DNA인 rRNA 유전자 부위 중에서 18S RNA 유전자의 염기서열 변이를 활용하 여 DNA 바코딩 분석을 시도 하였다. 18S rRNA 유전자 전체 염기서열을 결정하여 이중에서 범용 프라이머로 알려진 부분을 증폭하여 각 생물종의 유전적 변이 정도를 측정하였다. 이 부위는 18S rRNA 유전자의 앞쪽 400여 염기서열에 해당한다. 각각의 종에 대해서 3개체씩을 분석하여 종내의 유전적 변이와 종간의 유전적 변이를 측정하였다.
Fig. 3.1.1. Location of sampling station in the study area.
Latitude Longitude
st.1 N 34° 42' 93" E 127° 41' 41"
st.2 N 34° 42' 22" E 127° 42' 99"
st.3 N 34° 34' 27" E 127° 44' 34"
st.4 N 34° 34' 66" E 127° 41' 38"
st.5 N 34° 32' 38" E 127° 45' 53"
st.6 N 34° 43' 70" E 127° 43' 64"
st.7 N 34° 44' 22" E 127° 44' 05"
st.8 N 34° 34' 43" E 127° 45' 52"
st.9 N 34° 39' 59" E 127° 42' 74"
st.10 N 34° 44' 10" E 127° 40' 54"
Table 3.1.1. Position of sampling station in study area