(2) 오대산국립공원 공간정보
산림밀도 산림영급
임상도 토지피복도
[그림 Ⅲ-2-2] 오대산국립공원 등줄쥐 채집지점 현황
(3) 태백산국립공원 공간정보
산림밀도 산림영급
임상도 토지피복도
[그림 Ⅲ-2-3] 태백산국립공원 등줄쥐 채집지점 현황
(4) 소백산국립공원 공간정보
산림밀도 산림영급
임상도 토지피복도
[그림 Ⅲ-2-4] 소백산국립공원 등줄쥐 채집지점 현황
(5) 월악산국립공원 공간정보
산림밀도 산림영급
임상도 토지피복도
[그림 Ⅲ-2-5] 월악산국립공원 등줄쥐 채집지점 현황
(6) 속리산국립공원 공간정보
산림밀도 산림영급
임상도 토지피복도
[그림 Ⅲ-2-6] 속리산국립공원 등줄쥐 채집지점 현황
(7) 덕유산국립공원 공간정보 ㅡ
산림밀도 산림영급
임상도 토지피복도
[그림 Ⅲ-2-7] 덕유산국립공원 등줄쥐 채집지점 현황
(8) 지리산국립공원 공간정보
산림밀도 산림영급
임상도 토지피복도
[그림 Ⅲ-2-8] 지리산국립공원 등줄쥐 채집지점 현황
2) 유전자원 확보 지점별 서식환경
국립공원 지점명 해발
고도(m) 경사도
(%) 임상 경급 영급 밀도 토지피복
설악산 설악1 675 10 침활혼효림 대경목 6영급 밀 혼효림
오대산
오대1 471 12 경작지 치수 비산림 비산림 기타초지 오대2 759 14 소나무림 대경목 6영급 중 활엽수림
오대3 986 5 경작지 치수 비산림 비산림 활엽수림
오대4 881 5 소나무림 대경목 6영급 중 활엽수림
오대5 814 9 침활혼효림 대경목 6영급 밀 기타나지 오대6 698 2 침활혼효림 중경목 5영급 밀 활엽수림
태백산
태백1 1338 10 소나무림 대경목 7영급 중 침엽수림 태백2 1284 5 침활혼효림 소경목 3영급 중 활엽수림 태백3 870 6 침활혼효림 소경목 3영급 중 활엽수림 태백4 1091 20 낙엽송 중경목 4영급 밀 침엽수림
태백5 676 2 소나무림 대경목 7영급 중 침엽수림
소백산 소백1 682 13 잣나무 중경목 4영급 밀 침엽수림
월악산
월악1 428 14 낙엽송 중경목 4영급 중 침엽수림
월악2 497 12 소나무림 대경목 6영급 밀 단독주거시설
월악3 435 7 소나무림 대경목 6영급 밀 침엽수림
월악4 323 9 소나무림 대경목 7영급 중 혼효림
속리산
속리1 191 14 경작지 치수 비산림 비산림 내륙습지
속리2 408 7 소나무림 대경목 6영급 중 침엽수림
속리3 407 26 경작지 치수 비산림 비산림 침엽수림
속리4 477 4 경작지 치수 비산림 비산림 기타초지
속리5 174 25 소나무림 중경목 5영급 밀 침엽수림
속리6 316 7 소나무림 중경목 5영급 중 침엽수림
속리7 344 19 활엽수림 대경목 7영급 밀 내륙습지 속리8 381 19 경작지 치수 비산림 비산림 침엽수림 속리9 369 19 경작지 치수 비산림 비산림 기타초지 속리10 222 17 경작지 치수 비산림 비산림 기타초지 덕유산 덕유1 637 11 경작지 치수 비산림 비산림 기타초지
덕유2 871 16 낙엽송 대경목 6영급 중 기타나지
지리산
지리1 501 20 침활혼효림 중경목 5영급 밀 활엽수림 지리2 1169 18 잣나무 중경목 5영급 밀 자연초지 지리3 1369 18 제지 치수 비산림 비산림 활엽수림
지리4 193 2 경작지 치수 비산림 비산림 기타초지
지리5 122 4 경작지 치수 비산림 비산림 도로
지리6 117 19 경작지 치수 비산림 비산림 기타초지 [표 Ⅲ-2-1] 등줄쥐 채집지점의 공간정보
나. 유전자원 수집방법
털과 꼬리는 개체별 각각 다른 핀셋과 가위를 이용하여 채취하였으며, 확보한 시료는 100% 에탄올에 넣어 -20℃에서 냉동 보관함
구강 스왑(swab) 시료는 멸균된 스왑 제품을 사용하여 등줄쥐의 구강을 긁어서 확보하여 실험실로 이동한 후, -20℃에서 냉동 보관함
다. 유전자 실험 및 분석방법
등줄쥐 털, 꼬리 및 구강 스왑 시료 138개로부터 전체 genomic DNA 추출
Genomic DNA 추출을 위하여 Multitherm-shaker H5000-H-E (Benchmark, USA)를 이용하여 proteinase K 20㎕ 첨가 후 56℃에서 최대 12시간 동안 용해시킨 후 DNeasy Blood & Tissue kit (Qiagen, USA)와 G-spinTM Total DNA extraction kit (Intron Biotechnology, Korea)를 사용하여 프로토콜 가이드라인에 따라 추출하였고, 추출한 DNA는 fluorometer (Invitrogen, USA) 농도 측정 후 -20℃에서 냉동 보관함
라. 집단유전학(population genetics) 실험 및 분석방법 1) 미토콘드리아 DNA 실험 및 분석방법
(1) 실험방법
집단유전학 분석은 미토콘드리아 DNA cytochrome b (Cyt-b) 유전자 부위를 타겟으로 수행함
기존에 개발되어 있는 프라이머(Irwin
et al.
, 1991)와 본 연구에서 개발한 등줄쥐PCR 반응은 10×Dream Taq Green buffer (Thermo Scientific lnc., USA) 1.5 ㎕, 2.0 mM dNTPs (Bio Basic lnc., Canada) 1.5 ㎕, forward/reverse primers 0.5 ㎕, Taq DNA polymersae (Thermo Scientific lnc.) 0.2 ㎕, template DNA 1 ㎕ 및 멸균된 증류수 9.8 ㎕를 혼합하여 총 15 ㎕의 부피로 2720 thermal cycler (Applied Biosystems, USA) 기기를 이용하여 수행함 두 쌍의 프라이머 PCR 증폭 조건은 95℃에서 3~5분 동안 초기 변성(denaturation) 반응 후, 95℃에서 30~60초간 변성, 45~57℃에서 30~60초간 결합(annealing), 72℃에서 1분간 신장(extension) 반응을 35회 반복하였고, 이후 72℃에서 5~20분 동안 최종 신장반응을 수행함
PCR 증폭 후 2% agarose gel 전기영동을 통해 증폭이 확인된 PCR 산물은 Exonuclease Ⅰ (New England BioLabs, USA) 0.4 ㎕, Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)(New England BioLabs, USA) 1.6 ㎕, PCR 산물 8 ㎕를 혼합하여 37℃에서 15분, 85℃에서 15분 동안 정제(purification) 과정을 거친 후 ABI 3730xl automated DNA sequencer (Applied Biosystems)를 사용하여 forward/reverse primer를 이용하여 염기서열 분석을 실시함
획득된 염기서열 데이터를 미국유전자은행[NCBI (National Center for Biotechnology Information) GenBank] blast search를 이용하여 등줄쥐 DNA 추출 여부 확인 및 염기서열 길이 정보를 확인함
유전자 부위 프라이머 프라이머 정보(5‘-3’) 타겟부위 길이(bp)
Cyt-b
cyt_14724a CGAAGCTTGATATGAAAAACCATCGTTG
850~950 Cyt_15915a AACTGCAGTCATCTCCGGTTTACAAGAC
Agra_cytb_Fb ACTTTGGCTCCCTCCTAGGT Agra_cytb_Rb GTTGTCCGCCGATTCAGGTA
[표 Ⅲ-2-2] 등줄쥐 미토콘드리아 DNA Cyt-b 유전자 증폭을 위해 이용된 primer-pairs 정보
※ a: 기 개발된 프라이머(Irwin et al., 1991); b: 본 연구에서 새로이 개발된 등줄쥐 특이적 프라이머.
(2) 분석방법
① 진화 계통수(phylogenetic relationship) 분석
유라시아 등줄쥐의 진화적 근연관계를 파악하기 위해서 BIOEDIT v7.2.5 (Hall, 1999) 프로그램을 이용하여 단상형(haplotype) 결정 후, 확인된 단상형은 MEGA v7 (Kumar
et al.
, 2016) 프로그램을 이용하여 Neighbor Joining (NJ) 방법으로 NCBI에 기 등록된 한국을 포함한 아시아 전체 지역과 유럽지역(중국, 내몽골, 카자흐스탄, 러시아, 유럽, 한국 제주, 대만)의 등줄쥐 염기서열을 함께 이용하여 계통유연관계를 분석함우리나라 등줄쥐의 진화적 근연관계를 조사하기 위해 본 연구에서 확인된 78개 단상형과 NCBI에 기 등록되어 있는 우리나라에 분포하는 83개 단상형을 함께 MEGA v7 (Kumar
et al
., 2016) 프로그램을 이용하여 Neighbor Joining (NJ) 방법으로 분석함② 유전자 분포 지도 작성 및 네트워크 분석
결정된 단상형은 각 국립공원의 위도/경도 정보에 따라 지도상에 개체수와 단상형 정보를 도식화하여 나타냄
우리나라 등줄쥐 미토콘드리아 단상형 간 계통학적 관계 추론을 위해서 본 연구에서 얻은 78개 단상형과 NCBI에 등록되어있는 우리나라에 분포하는 83개 단상형을 대상으로 백두대간 내·외 지역과 제주 지역의 단상형을 대상으로 HAPSTAR v0.7 (Teacher and Griffiths, 2011) 프로그램을 사용하여 단상형 네트워크 분석 (haplotype network analysis)을 수행함
또한, 백두대간 국립공원 분포 등줄쥐 단상형 간 계통학적 관계 이해를 위해 본 연구에서 얻은 78개 단상형만을 대상으로 네트워크 분석 수행함
③ 집단 간 유전적 다양성 평가
확인한 단상형 데이터를 통해 ARLEQUIN v3.5.1 (Excoffier and Lischer, 2010) 및 CONTRIB v1.02 (Petit
et al
., 1998) 프로그램을 이용하여 NH (단상형 개수), HR (단상형 풍부도), H (단상형 다양성), π (뉴클레오티드 다양성) 및 PH (고유단상형) 등의 유전자 다양성 지수를 8개 국립공원 집단별로 산출함[그림 Ⅲ-2-9]④ 집단 간 서식지 연결성 평가
미토콘드리아 및 마이크로새틀라이트 유전자 데이터 기반 GENEPOP v4.3 (Rousset, 2008) 프로그램을 이용하여 집단 간 유전적 분화도(genetic differentiation) 정도를
F
ST 통계 수치로 평가함[그림 Ⅲ-2-9]Genepop version 4.3
Current input file: 180708_allpop.txt Last read at date: 12-13-2019, time: 13:56:44 ---> Change Data···C Testing :
Hardy-Weinberg exact tests (several options)···1 Exact tests for genotypic disequilibrium (several options) ··· 2 Exact tests for population differentiation (several options) ··· 3 Estimating:
Nm estimates (private allele method) ··· 4 Allele frequencies, various Fis and gene diversities ··· 5 Fst & other correlations, isolation by distance (several options) 6 Ecumenicism and various utilities:
Ecumenicism: file conversion (several options) ··· 7 Null alleles and miscellaneous input file utilities ··· 8 QUIT Genepop ··· 9 Your choice? :
[그림 Ⅲ-2-9] 분석에 이용한 ARLEQUIN(좌)과 GENEPOP(우) 프로그램
2) 핵 DNA 마이크로새틀라이트 실험 및 분석방법
(1) 실험방법
등줄쥐 특이적인 핵 마이크로새틀라이트 유전자를 증폭하기 위해 기 개발된 primer 쌍(Gockel
et al.
, 1997; Makovaet al.
, 1998; Ohnishiet al.
, 1998; Harret al.
, 2000; Wuet al.
, 2008) 총 21개를 이용하여 PCR 증폭 실험을 실시함 PCR 반응은 미토콘드리아 DNA 유전자 증폭과 동일한 방법으로 총 15 ㎕의 부피로 2720 thermal cycler (Applied Biosystems, USA) 기기를 이용하여 수행함 테스트한 21개 마이크로새틀라이트 유전자 중, PCR 성공도, 유전적 변이정도, 비평형연관테스트(linkage disequilibrium) 및 비대립유전자(null allele) 여부 테스트를 통해 분석 기준에 부합하는 유전자로 판단되는 9개의 마커를 최종적으로 선별하여 forward primer를 형광염색(FAM, HEX, TAMRA) 후 PCR 증폭 실시함[표 Ⅲ-2-3]PCR 증폭 조건은 95℃에서 5분 동안 초기 변성 반응 후, 95℃에서 1분간 변성, 56~62℃에서 30초간 결합, 72℃에서 45초간 신장 반응을 35회 반복하였고 72℃에서 20분간 최종 신장반응을 수행 후 2% agarose gel 전기영동을 통해 증폭된 PCR 산물을 확인함
각각의 마이크로새틀라이트 유전자 절편 크기(fragment sizes)는 GENEMAPPER v5.0 (Applied Biosystems)을 이용하여 ROX-500bp size standard 크기와 비교
·결정하는 방식으로 genotyping을 수행함
프라이머 GenBank
Accession Nos. Dye
labelling 염기서열 정보(5'→3') 참고문헌 SFM1 EU430642 - F: GAGCTTAACTAGCCCTGAC
Wu et al.
(2008) R: ATGTGCCTCTGTTTGTGG
SFM3 EU430644 TAMRA F: GGCTCCATCCTTCACTCC R: ATCCACCAACCACTTCTTTA SFM4 EU430645 - F: CGAGCAGGTCAATCAAGT
R: TTTATCCATCAAGCCATC SFM6 EU430647 - F: AGCCACCACATTTGGAAGAG
R: CTACAGCCAGCAACAACAGG SFM7 EU430648 - F: CTTCGGATCATAACTCTTTC
R: TTTCCCAACAATTAACTCAC SFM9 EU430650 HEX F: AAGCCAAGCCCGAAGAAA
R: TAGAGCCAGCCACCGTTA SFM11 EU430652 - F: TTGTTTTCTTACCTCCAT
R: ACCAACCAGCTATACTTT SFM12 EU430653 - F: TTTTCTCATAAGCACCCT
R: CATCCATGCAGGCAAAGC SFM14 EU430655 HEX F: ATGCACATATCAACCCAA
R: AGCAAACGACCTTACTCC CAA2A AF007198 FAM F: AATTTGCCCTTAAGTGAGGAAG
Makova et al.
(1998) R: GCAGTGACCCAGGAGAAATTACC
GTTF9A AF007203 - F: GGGTCCCAAGGGTAGTTTCAAAT R: CCCACCACAGCGTGTCTATAGG GATAE10A AF007204 TAMRA F: GCAGGAGTTCAGCAGTCTGAGG R: GATGCGGAATGACAGGATTTGA GACAB3A AF007206 TAMRA F: AGGGGAACCTCACAAATATAGGAAA
R: GGCTTCCAATTTTGAACTACAGAGC GACAD1A AF007207 - F: GCCCTTGCATGAAGCTTACCA
R: TCTAAGCTTTAACTTGCTCCTCTCTG TNF(CA) AF12735-127360 - F: AGGAAATGGGTTTCAGTTCTCAGG
R: GGTCCCCACCAGGATTCTGTG GCATD7S AF007209 HEX F: CTGGGTCTTCTGCACTGTTCTTTACC
R: GCAGATGCCCACCTTCTGTAACCAA GTTA1A AF007199 - F: TTTGATGCCTTGACTTTGATTACC
R: AATGCCAGTGGTGATTTTATTTGG GTTC4A AF007200 FAM F: GTAAATGGCTAGAAGGAGAGAAGGTTC
R: TTCCCTGGAAACTATTTGGTAAATCC
MSAF22 Y09904 - F: CAAGCCTGGGATACATAAGAC Gockel et al.
(1997) R: GGCAGAAGCAGTAGCAAATGA
AS-7 AF246520 - F: CAGGTCTTATTCTTCCAGTTA Harr et al.
(2000) R: ACAATTGATTAAATTGGAACC
MSAA5 - FAM F: CAGCTCCCATTGATACTCCAT Ohnishi et al.
(1998) R: TAATACACGGGCATGCTTGTC
[표 Ⅲ-2-3] 등줄쥐 21개 핵 DNA 마이크로새틀라이트 유전자 증폭 테스트에 이용된 primer-pairs 정보. 최종 선정하여 분석에 이용한 9개 유전자 마커는 음영 표기
(2) 분석방법
① 집단 간 유전적 다양성 평가
9개 마이크로새틀라이트 마커별 대립유전자(allele) scoring 후, FSTAT v8.9.3.2 (Goudet, 2001) 및 GENPOP v4.3 (Rousset, 2008) 프로그램을 사용하여 마커별 AR (대립유전자 풍부도), PA (고유대립유전자), HO (실제 관측 이형접합도) 및 HE
(HWE 이론 상 예측 이형접합도)를 계산하고, 등줄쥐 개체군의 무작위교배 및 근친교배/이계교배(FIS) 등 교배체계를 조사하기 위해 하디와인베르크 평형테스트(HWE) 분석을 실시함[표 Ⅲ-2-4]
백두대간에 포함되는 8개 국립공원 내 등줄쥐 개체군의 최근 개체 수 감소 현상 (집단병목현상, population bottleneck) 발생여부를 조사하기 위하여 BOTTLENECK v1.2.02 (Piry
et al
., 1999) 프로그램을 이용하여 분석함② 집단 간 서식지 연결성 평가
마이크로새틀라이트 유전자데이터의 경우 집단(또는 국립공원) 간 특정 유전적 그룹 (genetic cluster) 존재 유무 확인을 위해 STRUCTURE v2.3.4 (Evanno
et al.
, 2005) 프로그램 분석을 수행함BARRIER v2.2(Manni