다이옥신계 화합물 (DLCs) 분해를 위한 생물정화기술 개발

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계약학과 협력지원사업 결과보고서

사 업 명 다이옥신계 화합물 (DLCs) 분해를 위한 생물정화기술 개발

사업책임자 (신청인)

성 명 권개경 소 속 한국해양과학기술원

직 위 전임교수 전 공 해양생명공학

휴대전화 010-3021-6618 전 화 031-400-6242 E-mail kkkwon@kiost.ac.kr F A X 031-406-2495 사업기간 2016. 12. 1. ～ 2016. 11. 30 (12 개월)

사 업 비

(천원) 총액(A+B) UST 지원금(A) 참여기업 부담금(B)

90,000 67,500 22,500

참여기업

회 사 명 ㈜ 비제이씨 책 임 자 최용설

부 서 총괄 휴대전화 010-3890-6899

직 위 사장 E-mail bjc6899@hanmail.net 실무담당자참여기업 성 명 김도경 휴대전화 010-9284-6469

소 속 연구부 E-mail bjc6899@hanmail.net

본 보고서를 “다이옥신계 화합물 (DLCs) 분해를 위한 생물정화기술 개 발”(사업기간：2015.12. ~ 2016.11.)과제의 최종보고서로 제출합니다.

붙임: 최종보고서

2016 년 12 월 30 일

사 업 책 임 자 : 권 개 경  참여기업책임자 : 최 용 설 

과학기술연합대학원대학교 총장 귀하

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[불임]

사업명 : 다이옥신계 화합물 (DLCs) 분해를 위한 생물정화기술 개발

2016. 12. 30.

사 업 책 임 자 : 권 개 경 (인)

참여기업책임자 : 최 용 설 (인)

과학기술연합대학원대학교 총장 귀하

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- 목 차 -

1. 협력지원사업 결과 초록

2. 협력지원사업 계획대비 실적

3. 협력지원사업 수행내용 및 결과

4. 협력지원사업 결과 및 사업화 계획

5. 별첨

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1. 협력지원사업 최종보고서 초록

가. 협력지원사업 개요

약 200만 ha의 베트남 토양은 전쟁 중 발암물질, 내분비계 교란물질로서 위해성이 매우 높은 DLC (Dioxin Like Compound) 화합물로 오염 됨. 잔류 DLCs는 지금도 영향을 주고 있어 인도적 견지와 산업적 측면에서 이의 저비용 정화기술 개발이 시급하지만 안정성이 높아 호기적 조건에서는 생물분해가 어렵다는 정화기술의 문제점을 해결하기 위해 혐기조 건에서의 탈염소화 반응과 호기조건에서의 생분해 융합기술개발 필요. 이에 적정 유기물 투입을 통해 토양을 혐기화시킴으로써 DLCs의 탈염소화를 유도하고 이후 방향족 탄화수 소 분해미생물의 접종을 통해 염소가 제거된 DLCs를 분해하기 위한 기술 개발. 실험실 실험과 현장 적용연구를 계획하였으나 기간상 실험실 실험만 완료되었고 과제 종료 후 현 장적용 시도 중임.

나. 협력지원사업 결과요약

키워드 DLCs (Dioxin Like Compounds), 생물정화, 토양 혐기화, 미생 물제제, Novosphingobium pentaromativorans

핵심기술 PCDD의 탈염소화가 촉진될 수 있도록 토양환경을 조절하는 적 정 유기물 첨가 기술과 DibenzoDioxin 분해 미생물 접종 기술

최종목표 토양 환경 조절과 미생물의 통합 적용을 통해 고엽제 성분의 분 해율을 현장 조건에서 30% 이상 향상

개발내용 및 결과

미생물 활성이 부족한 오염 토양에서 탈염소반응을 촉진시키기 위해 혐기성 미생물의 성장을 촉진시킬 수 있는 유기물을 투여하 여 혐기조건에서 DLCs의 dechlorination을 유도하고 이후 방향족 탄화수소 분해미생물을 접종함으로써 DLCs의 완전분해를 추구 함. 실험실 실험 결과 5주후 약 30%의 촉진효과를 보임.

기술개발 배경

약 200만 ha의 베트남 토양은 전쟁 중 발암물질, 내분비계 교란 물질로서 위해성이 매우 높은 DLC (Dioxin Like Compound) 화합 물로 오염 됨. 잔류 DLCs는 지금도 영향을 주고 있어 인도적 견 지와 산업적 측면에서 이의 저비용 정화기술 개발이 시급함.

핵심개발 기술의 의의

개념은 정립되어있으나 적정 조건에 대한 연구가 진행 중인 기술 임. 실제 사용 가능한 유기물로는 폐수처리장 슬러지, 분뇨 등이 있어 처리가 필요한 환경부산물 활용과 오염 정화를 동시에 달성 가능하며 사용 중인 주요 기술인 열탈착에 비해 1/3 이하의 비용 으로 가능한 경제성을 보임.

적용 분야 고엽제 성분 오염 토양의 생물정화. 기타 염소계 유기화합물 제 거가 필요한 토양 정화

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다. 기술 및 경제적 성과

기술적 성과

- DLCs 오염 토양의 생물정화기술은 선진국에서도 개발 중인 기술임. 토양혐기화와 미생물 접종을 시도한 연구로는 국내 첫 시도로써 선진국 대비 90% 수준의 기술력을 갖추게 됨 - 결과를 기반으로 한 특허 및 논문 준비 중. 기간 중 베트남

에서 세미나 발표

경제적 성과

현재 오염토양에서의 실증실험 진행 중. 성공적으로 종료될 경 우 2018년 이후 실질적인 시장 형성 기대. 시장 규모는 조단위 에 이를 것으로 예측됨.

라. 파급 효과 및 기대 효과

파급 효과

기술적 : 다이옥신 오염 토양의 생물정화기술 적용 연구 활성화 사회․경제적 : 베트남 환경정화에 기여함으로써 베트남에서의

한국 위상 강화 및 환경산업에의 활발한 진출

기대 효과

기술적 : 분해 경로 연구 결과는 보다 세밀한 기술 개발로 이어 질 것임

경제적 : 베트남에서의 본격적인 토양정화사업이 개시될 경우 조단위의 시장 참여 가능

마. 제품 사진

해당 기술은 노하우와 미생물을 중심으로 한 무형의 기술임. 이에 실험실 실험 결과 일 부와 적용 현장실험 사진으로 대체함.

5주 배양 후 조건별 TCDD 농도 변화. 단순 구조의 오염물질 추가를 통해 분해속도 증진 가능

베트남 Dong Son 지역에 실증실험구 설치

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2. 협력지원사업 추진현황

항목 계획 실적

개발 목표 달성 정도

오염된 토양에 대해 30% 이 상 분해율이 향상된 DLC화합 물 정화기술 개발

- 탈염소 DLC화합물 우수분 해 미생물 확보

- DLC화합물 탈염소화를 위 한 환경조건 조절

- 토양환경의 혐기-호기조건 조절을 통한 DLCs의 탈염 소화 및 생분해과정 동시 적용 또는 연속적용 시스 템

○ DLC화합물 분해 우수 미생물 확보

- 확보된 베트남 오염 토양, 국내 유류오염 토양 등으로부터 DLCs에 대한 우수한 분해 미생물 을 확보하기 위해서 농후 배양 및 분리 실험 을 진행

- 베트남 토양으로부터 110개의 단일 콜로니, 국내 토양으로부터 9개의 단일 콜로니를 분 리. 분리 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 통한 분자동정 실시 결과 분리된 미생 물은 Bacillus aerophilus, B. anthracis, B.

cereus, Psychrobacillus psychrodurans, Rumelibacillus pycnus, Paenibacillus panacisoli 등 Bacillus 계통의 미생물들과 96.8~100%의 높은 유사도를 보임.

- 분리동정 결과 동일균주로 추정되는 균주 제 외하고 형광광도계를 이용하여 분리 균주의 DF 분해능을 평가. 형광 측정 결과, R.

pycnus s2를 제외하고 DBF 분해능을 띄는 균 주는 발견되지 않음. R. pycnus S2 균주의 경 우에도 1일간 10% 내외의 형광 감소를 보임 으로써 원하는 만큼의 우수한 분해능을 띄지 는 않았음.

- 다양한 종류의 다환 방향족 탄화수소 (PAHs, polycyclic aromatic hydrocarbons) 분해균주 로 알려진 N. pentaromativorans US6-1의 경우 S. wittichii RW1에 비해 빠른 속도로 DBF 분해를 진행시킴을 확인. 이에 US6-1 균주를 우수 균주로 선정하여 실험 진행.

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(계속 1)

○ DLC화합물 분해 우수 미생물 확보 (계속)

- US6-1 균주의 유전체로부터 DBF 분해 관련 유전자들을 추출하여 계통수를 그림

- US6-1 균주의 다양한 Dioxygenase 효소들의 분자계통수를 작성한 결과 RW1과는 차이가 있으며 유사도가 낮은 다수의 dioxygenase 효 소들이 존재하였음. 이 결과는 US6-1 균주의 DBF 분해과정이 기존 균주들, 특히 RW1과는 다르다는 것을 시사함

- 시간 경과에 따른 DBF 분해능 측정 결과 US6-1 균주는 840 ppm의 DBF를 19시간 후 대부분 분해하며, 이 과정에서 초기 대비 후기 로 가면서 분해 속도가 줄어드는 것으로 나타 나 중간산물 분해에 따른 지연으로 추정됨

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(계속 2)

○ DLC화합물 분해 우수 미생물 확보 (계속) - DBF 분해 과정 중 배지의 색깔이 시간에 따

라 노란색에서 주황색을 거쳐 붉은 와인색으 로 변하는 것을 관찰 할 수 있었음

- DBF 분해 경로는 크게 2가지로 나뉘며 아래 그림과 같음

- 배양액 중 ethyl acetate 추출 분획에서 주요 산물로 3(2H)-benzofuranone이 검출 됨. 이 는 분해과정이 meta-cleavage일 가능성을 시 사함.

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(계속 3)

○ DLC화합물 분해 우수 미생물 확보 (계속) - GC/MS 분석 결과로는 알 수 없는 부분으로

수용성 산물의 구조인데 이는 LC/MS 분석을 통해 보완이 필요함.

- DBF 분해과정 중 발현되는 유전자를 확인하 기 위하여 RNA 추출 및 분석을 시도함. 현재 RNA 추출이 완료되었으나 끌림 현상이 발생 하여 보다 고품질의 RNA를 얻기 위한 과정 진행 중

○ DLC화합물 탈염소화를 위한 환경조건 조절 - DLCs 탈염소화 최적 나노 물질 탐색

․ 반응성, 환경유해성, 가격 등을 고려해 ‘Fe’선 정. Fe⁰의 강력한 환원력을 이용해 염소계 DLCs의 탈염소화 가능

․ 다음 반응식 이용 실험실환경에서 nZVI 제조

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(계속 4)

○ DLC화합물 탈염소화를 위한 환경조건 조절 (계속)

- DLCs 탈염소화 최적 나노 물질 탐색

․ 반응시약 농도비에 따른 nZVI 생산수율 실험 결과 시중의 nZVI 판매가격 10000~20000원 /g 가격대비 최적 생산 조건의 반응몰비 찾음

시약 이름반응몰비 넣은 양(g)넣은 가격 (원)

얻은 nZVI(g)

nZVI g당 가격(원) FeSO4‧

7H2O 1 2

(Fe=0.402) 369.6

NaBH4 1:0.4 0.11 326.7 0.013 53561.53846 1:1 0.274 813.78 0.112 10565.89286 1:1.47 0.4 1188 0.165 9440

1:2 0.548 1627.56 0.3544 5635.33 1:3 0.822 2441.34 0.420 6992.39

․ 인터넷 검색 결과 저가의 나노 철 판매 업체 확인 -> 구입 평가 수행

․ 나노물질이 지니는 제약 (강한 반응성, 빠른 산화, 무작위 반응 등)을 극복하기 위한 다양 한 방법 (표면 산화, CMC capsulation, emulsifying 등) 검토 및 토양환경조건 고려 결과 나노철은 토양환경 정화에 부적합한 것 으로 결론. 대안으로 혐기화 기술 모색

- 토양혐기화를 통한 토착 탈염소균 활성화 : 적 정 유기물 탐색

․ 보조기질로 oil + DBF, oil+ZVI, dextrin+균 주 조건을 평가함. 혐기 조건에서는 미생물 군 집 중 실험구의 경우 대조구와 큰 차이가 없지 만 호기조건에 영양염만을 첨가한 경우 13주 후 Chloroflexi phylum의 비율이 2배 정도 증 가함. 또한 혐기조건에 DBF가 첨가되거나 영양 염만 첨가된 경우에는 Acidobacteria가 증가하 는 것으로 나타남. 반면 Deltaproteobacteria의 변화는 크지 않음.

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(계속 5)

○ DLC화합물 탈염소화를 위한 환경조건 조절 (계속)

- 토양혐기화를 통한 토착 탈염소균 활성화 : 적 정 유기물 탐색 (계속)

․ DBF가 첨가될 경우 Acidobacteria 중 혐기성 인 Holophagae의 비율이 높게 나타나 DBF 첨가는 목적에 부합하는 것으로 평가됨.

․ Chloroflexi에 속하는 미생물의 경우 대부분 Ktedonobacteria강에 속하여 dechlorination에 의 기여는 크지 않음

- 토양환경의 혐기-호기조건 조절을 통한 DLCs 의 탈염소화 및 생분해과정 동시적용 또는 연 속적용 시스템 : 군집변화 분석

․ 다양한 조건에서의 혐기화는 육안으로 차이 가 관찰됨

․ 각 실험조건에서의 미생물 군집구조를 비교 해 보면 혐기, 호기 조건별로 그리고 1차 기 질의 유무에 의해 클러스터가 형성됨을 확인 할 수 있음

․ 순차적으로 혐기-호기조건을 제공한 실험구 는 혐기, 호기 양쪽에 섞여 있는데 9주차 이 전과 이후의 차이를 보임

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(계속 6)

- 토양환경의 혐기-호기조건 조절을 통한 DLCs 의 탈염소화 및 생분해과정 동시적용 또는 연 속적용 시스템 : 군집변화 분석 (계속)

․ 이상과 같은 군집구조 형성은 산소와 1차기 질이 유사한 수준으로 영향을 미치는 것으로 해석될 수 있음

․ 또한 혐기조건 실험구들은 Acidobacteria에 속하는 특정 종이 우점하는 경향을 보이는 반면 호기조건에서는 중심미생물종이 뚜렷하 지 않음

․ 호기조건으로 진행된 실험구의 주요 미생물 계통의 경우 Deltaproteobacteria의 변화는 크지 않지만 Acidobacteria와 Chloroflexi는 Na-Acetate 첨가 결과로 시간 경과에 따라 감소하는 경향을 보임

․ 이 경우 Alpha-, Beta-proteobacteria와 키 틴분해 미생물인 Bacteroidetes문에 속하는 Chitinophagia의 비중이 높아짐

․ 혐기조건에서는 Acidobacteria가 증가 경향을 보임

․ 순차적으로 혐기-호기조건을 제공한 실험구 에서는 1차기질 (유기물)에 의한 Chloroflexi, Acidobacteria의 감소와 무첨가 혹은 2차기질 첨가에 따른 두 분류군의 증가를 볼 수 있음

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(계속 7)

- 토양환경의 혐기-호기조건 조절을 통한 DLCs 의 탈염소화 및 생분해과정 동시적용 또는 연 속적용 시스템 : 군집변화 분석 (계속)

․ 이상의 결과는 실험구 내 미생물 군집이 투 여되는 유기물과 산소 공급 여부에 의해 크 게 좌우됨을 보여 줌으로써 최소한 serum vial 규모에서는 원하는 방향으로 미생물 군 집 조절이 가능함을 확인함.

- 토양환경의 혐기-호기조건 조절을 통한 DLCs 의 탈염소화 및 생분해과정 동시적용 또는 연 속적용 시스템 : TCDD 농도 변화

․ 5주차 실험구들의 TCDD 추출액을 1/100 희석 하여 ELISA kit로 측정 후 상대적인 농도를 측 정하였을 때 2차 오염기질에 더하여 혐기조건 혹은 1차 유기물이 추가될 경우에 10~40% 정 도의 TCDD가 제거된 것으로 나타남.

․ 9, 13주차 및 보조기질 유효성 실험구의 TCDD농도는 추출원액, 1/10 희석액, 1/100희 석액 간의 차이가 나타나지 않아 유의한 농도 분석이 이루어지지 못 함. 이는 5주차 이후 활 발한 분해, 혹은 외부적 요인 (UV 등)에 의한 영향으로 TCDD 농도가 검출 범위에 있지 않음 을 의미함.

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기술개발 결과의 질적 수준

- 예상 성과물

․ 극내 특허 1건

- 정량적 성과물로 국내 특허 1건을 제시하였으 나 연구 방향 수정에 따른 촉박한 기간으로 인하여 아직까지 진행 되지 못 함.

- 보고서 완료 후 분석 결과를 토대로 특허 명 세서 작성 및 특허출원 예정임

- 연구개발 결과물 중 Novosphingobium pentaromativorans US6-1 균주의 DBF 분해 경로에 대한 분석은 분해 특성의 차이점과 함 께 S. wittichii와 차이를 보이는 부분으로서 학술적 가치를 가지는 것으로 판단되며 유전 자발현분석 완료 후 논문화 추진

- Serum vial에서 추진한 기질 추가여부에 따른 토양미생물 군집변화 결과는 산소와 유기물의 복합영향을 분석할 수 있는 결과물로서 정밀 분석 이후 논문화 추진

- 이상과 같이 논문 작성이 가능한 연구 결과 2 건과 특허출원이 가능한 결과를 확보함으로써 시간적 지연 이외 충분한 질적 수준 달성한 것으로 판단됨

※ 주어진 양식의 크기에 구애받지 않고 가능한 상세히 기술 (페이지 추가 가능)

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추진 체계의 타당성

○ 기 확보된 미생물자원/정 보 활용

○ 참여기업과 협력체계 구 축

- 한국해양과학기술원이 주 관으로 연구를 수행하며 참여기업인 ㈜ 비제이씨 는 실험시료 확보 및 베 트남과 협력 부분을 담당

○ 시료 정밀분석이 필요할 경우 전문분석기관과 용 역 형태로 진행

○ 연구개발 추진 과정 및 방법

- 주관연구기관에서는 다양한 문헌자료, 기존 연구재료 및 경험 등을 토대로 연구개발 디자 인 후 추진

- 새로운 기술 (nano Fe particle 적용) 접목과 관련하여 매질에 따른 기술 적용 효용성에 대 한 시행착오를 겪었으나 대안 기술 추진을 통 해 한계 극복

- 연구개발 추진 방법은 3항 참조

○ 참여기업의 역할

- 최초의 역할분담 계획과 같이 참여기업은 베 트남과의 협력 관계 유지 및 현지 시료 채취 추진을 통해 원활한 연구개발 뒷받침

- 또한 국내의 안전성평가연구소 경남독성본부, 농업기반공사 등과의 공조를 추진함으로써 시 료 채취 과정, 오염물질의 농도 분석 등이 이 루어지도록 뒷받침

- 7월 3~7일 베트남 자연환경보존협회 회장단 의 방한을 추진하여 연구개발 현황, 연구개발 및 사업화 능력 등을 소개하고 9월 28-10월 1일 사이의 세미나 지원 및 실증사업 협의, 12 월 중 현장실증 진행 등을 주도함으로써 기술 개발 이후의 원활한 사업화 추진 중

○ 교육 성과

- 연구개발 과정에서 두 학생 모두 기술 개발의 시작과 방법, 결과 도출에 이르기까지의 과정 을 경험함으로써 연구개발 인력으로서의 경험 축적

- 한재호 학생은 나노물질 제작 경험과 더불어 관련 기술이 가지는 한계에 대해 문헌 조사 등 을 통해 다양한 대안을 도출하는 과정 습득 - 나혜윤 학생은 미생물의 분리, 활성 측정, 개

별 미생물에 대한 심층적이고 다각적인 접근을 통한 기능 규명 과정에 대한 연구 경험 축적 - 두 학생 모두 연계 과제에서 현장 실험구 제

작 및 운영, 미생물 군집 및 활성 변화 연구를 통한 생물정화기술 적용 결과 해석 등의 경험 을 통해 실무적으로 생물정화 기술 적용 과정 에 대해 경험 축적

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사업화 가능성

○ 개발된 기술을 기반으로 특허출원 (국내 출원 후 국제특허 추진)

○ 개발된 기술의 베트남 오 염지역 실증시험 추진

○ 실증 성공시 기술이전 및 사업화 및 한․베트남간 공동사업화 추진

- 베트남측과의 사전 협의 결과에 따라 과제 종 료 직후인 2016년 12월 현장실증실험 시작

※ 2016년 7월 베트남자연환경보존협회 회장 일 행이 방한하여 개발기술로 A Luoi 지역의 오 염 토양에 대해 80 ppt 이하로 정화하기 위한 실증사업 제안. 2016년 9월 말 베트남 하노이 에서 관련 세미나를 개최하고 세미나 후의 협 의를 통해 A Luoi 지역 2 ha의 오염토양 중 100 m²에 대한 실증실험 합의

- 현재 진행 중인 실증실험 결과가 양호하게 나 올 경우 베트남 내에서의 오염토양 정화사업이 개시될 것으로 전망됨

- 다만 초기 사업의 경우 한-베트남 환경부장관 회담에 따른 한국측 지원을 통해 사업비가 마 련 될 것으로 예측됨

- 초기 규모는 2 ha에 대해 500만불 내외로 예 상됨

- 이후 시장은 호치민 인근 토지개발에 따른 시 장과 오염이 극심한 Bien Hoa 등의 공항 정화 사업이 될 것으로 예측됨

※ 주어진 양식의 크기에 구애받지 않고 가능한 상세히 기술 (페이지 추가 가능)

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3. 협력지원사업 수행 내용 및 결과 가. 최종 목표 및 평가 방법

○ 최종 목표 : 오염된 토양에 대해 30% 이상 분해율이 향상된 DLC화합물 정화기술 개발

- 혐기-호기조건 조절을 통한 탈염소화율 80% 이상 달성 - 탈염소 DLC 화합물 (DD)의 분해율 80% 이상 달성

- 토양환경조절과 미생물적용의 통합을 통해 DLCs 분해율 30% 이상 향상 (현장 시료)

○ 평가 방법 : 정성-정량적 실적 검증 - 과제 종료 6개월 이내 특허 출원 여부

- 과제 종료 6개월 이내 학생 졸업 여부 (논문 발표 포함) - 과제 종료 후 실증사업 진행을 통한 사업화 추진 여부

나. 개발 내용 및 개발 범위

○ 세부 내용 및 범위

- DLC화합물 탈염소화를 위한 환경조건 조절 : 다양한 유기물을 대상으로 적용 조건을 확보함으로써 토양 내 탈염소화 미생물의 enrich 효율이 우 수한 유기물 및 농도 선정

- 탈염소 DLC화합물 우수분해 미생물 확보 : 나노물질에 대한 내성 및 탈 염소화 환경조건에 적응된 DD화합물 분해 우수균주 확보

- 토양환경의 혐기-호기조건 조절을 통한 DLCs의 탈염소화 및 생분해과정 동시적용 또는 연속적용 시스템

○ 실험 방법

- DLC화합물 분해 우수 미생물 확보

․ 실험내용: 확보된 베트남 오염 토양, 국내 유류오염 토양 등으로부터 DLCs에 대한 우수한 분해 미생물을 확보하기 위해서 농후 배양 및 분리 실험을 진행하였다. 또한 기 보유중인 PAHs 분해 미생물을 대상으로 DBF (dibenzofuran) 분해능을 검증하고 활용하고자 하였다.

․ 미생물 분리 : 고농도의 DLCs만이 포함된 환경에서 성장하게 되면 DLCs

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를 탄소 및 에너지원으로 이용하지 못하는 미생물은 점차 도태되고 DLCs 를 기질로 이용할 수 있는 미생물만이 생존하게 된다. 이와 같은 전제 하 에 위에서 확보한 대상시료 적당량을 준비된 무기영양원 배지인 MM2배지 ((NH₄)₂SO₄ 2.38 g, FeSO₄・7H₂O 0.02g, CaCl₂・2H₂O 0.02 g, MgSO₄・ 7H₂O 0.25 g, 1 M Phosphate buffer 10 ㎖, 1L 기준)에 접종하여 7일 간격으로 3회 걸쳐 1ml 의 배양액을 새로운 배지에 접종시킨 후 배양 후 200ul의 농후배양액을 DBF를 기질로 첨가한 MM2 Agar 배지에 도말한다.

이 때 사용된 agar 배지는 double layer 형태로 under layer는 1.5% MM2 agar이고 over layer은 5000ppm DBF가 첨가된 3.5ml 1% agarose gel 이다. 도말한 후 30℃에서 colony가 충분히 자라 clean zone이 형성될 때 까지 배양시킨다.

․ DBF분해능 확인 : DBF의 control인 MM2배지에 carbon souce인 DBF만 넣어준 샘플, 미생물 자체의 형광 control인 분리된 미생물만 넣어준 샘플 과 DBF와 분리된 미생물을 함께 넣어준 3개의 샘플을 각각 형광을 측정 하여서 DBF를 분해할 수 있는 미생물을 선발한다.

․ 대조구로는 현재 가장 강력한 DBD (Dibenzodioxin)/DBF 분해 균주로 알 려진

Sphingomonas wittichii

RW1을 사용하였다.

- DLC화합물 분해 우수 미생물의 DBF 분해 경로 분석

․ 실험배경 :

N. pentaromativorans

US6-1 균주의 DF 분해과정을 규명하기 위해서 형광광도계를 이용하여 분해 과정을 모니터링 하고 유전체 정보 분 석과 transcriptome 분석, 대사산물 분석을 통해 분해 경로 및 관련 효소 를 규명한다.

․ DBF 분해 관련 유전자는

S. wittichii

RW1에서 보고된 유전자와

N. pentaromativorans

US6-1 균주의 유전체 결과를 비교하여 추정하였다.

비교에는 BLAST 방법을 이용하였다.

․

N. pentaromativorans

US6-1 균주의 DBF 분해 경로 추적을 위해 3가지 다른 조건의 실험군을 준비하였다. 첫째, MM2배지에 OD5의 US6-1 균주 만을 넣어준 것과 둘째로 840ppm DBF로 녹인 MM2배지, 마지막으로 동 일한 농도로 DBF를 기질로 넣어준 MM2배지에 OD5의 US6-1 균주를 접 종시키고 시간에 따른 형광값의 변화를 관찰하였다. 그리고 DBF의 분해가 확인되는 지점에서 해당 균주의 mRNA를 추출하여 RNA-Seq 분석을 하 고자 하였다.

․ 발현된 유전자는 RNeasy Mini Kit(Qiagen) 및 Trizol 추출법을 이용하여 mRNA를 추출하고 Illumina miseq platform을 이용하여 RNA-Seq 분석을

(19)

하고자 한다.

․ 또한, 시간에 따른 배지 내 존재하는 DF의 중간대사산물을 분석하기 위하 여 배지를 ethyl acetate로 추출하여 GC-MS 분석을 통해 중간대사산물 분석을 하여 분해과정을 확인하고자 하였다. GC-MS 분석 조건은 다음과 같다. 컬럼은 HP-5 MS column을 사용하였고 오븐 온도는 80℃에서 3분 간 머물게 한 후 290℃까지 1분당 5℃로 승온하였다. 시료는 pulsed splitless mode로 주입하였으며 이 때 온도는 250℃이었다. 운반기체로 헬 륨을 이용하였고 유량은 1.0mL/min이었다.

․ 실험에 사용된 토양 시료 : 시료 채취는 베트남 전쟁당시 사용된 고엽제 내 다이옥신 성분 때문에 피해를 보고 있는 A Luoi 지역에서 진행됐다.

협력기관인 안정성평가연구소에서 분석한결과 다이옥신 농도가 수십~수백 ppt(TEQ)로 측정되었다. 이번 실험에는 상대적 오염도가 가장 높은 4개의 샘플링 구역에서 코어링한 토양 중 지면에서 10cm이상, 25cm이하 깊이의 토양을 혼합해서 사용했다.

․ 토양 혐기화 방법 : 유기물로서 1차 기질 - 토양에 넣는 유기물의 역할은 첫 째로 호기성 미생물이 대사에 쉽게 이용할 수 있어 토양표면의 산소를 소모, 토양 표면의 약혐기 조건을 형성하는 것이다. 즉 혐기 미생물이 활 성화 될 수 있는 환경조건을 만들어준다. 두 번째로 혐기성 조건에서 혐기 미생물의 수소첨가분해로 염화물의 염소이온이 수소이온으로 치환되는

(20)

Co-metabolism을 발생시키는 것이다 (이재원 등 2005,

Kor J Microbiol

)

.

위 두 가지 역할을 수행하기 위해 쉽게 분해 가능한 유기물 중 acetate가 가장 효과적이라고 판단되었으며 (박대원 등 1993,

J Kor Soc Environ Eng

) 혐기화 진행 중 산성화 완충을 위해 Sodium acetate가 최종 선정돼 실 험에 사용됐다.

․ 토양 혐기화 방법 : 활성 촉진제로서 2차 기질 - TCDD보다 독성 및 Chlorinated 단계가 낮으면서 분석이 용이한 염화물을 선정했다.

1-Chloronaphthalene, 1,4-Dichloro benzene 두 가지 염화물이 실험에 사용 됐다.

․ 토양 혐기화 방법 : 기본 영양물질로서 무기영양염 - 이상적인 C:N:P 비 율을 따르기 위해 유기물의 탄소함량을 계산하여 질소원으로 NH₄Cl이 투 입됐다. 인은 토양에 필요한 미량이 존재하는 것으로 간주하여 투입하지 않 았다.

․ 토양 혐기화 방법 : 실험구 조건 - 주기적 실험구 vs 기질조건 실험구

․ 토양 혐기화 방법 : 주기적 실험구 - 5, 7, 9, 11, 13주 주기 관찰을 수행하기 위한 실험구로 적절한 처리방법을 선정하기 위하여 산소유무조건, 1차 기질, 2차 기질을 조합해 100ml serum vial에 실험구를 설정했다. 산소조건은 A(항시 Aerobic), An(항시 Anaerobic), S(5주간 Anaerobic 후 Aerobic 전환)으로 구성 되며 An, S 조건은 마지막 단계에 필터링한 N2:CO2=8:2 혼합가스를 주입하여 무산소 조건으로 만들었다. A 조건은 매주 필터링한 공기를 넣어줬으며 S 조건 은 5주차부터 필터링한 공기를 넣어 산소조건으로 만들었다. 기질투입조건은 0(Blank, 토양만), 1(1차 기질만 넣은 것), 2(2차 기질만 넣은 것), 3(1차, 2차 기질을 함께 넣은 것)으로 구성해 1차 기질을 넣은 효과와 2차 기질의 탈염 경 향을 관찰하려했다. 군집분석만 하는 실험구는 1반복 실험, 오염물 분해도를 함 께 보는 실험구는 3반복 실험 설정했다. 토양은 4개 샘플링 사이트의 토양 500g 씩 총 2kg을 잘 섞어준 후 정수 2L, 영양염과 혼합된 슬러리 20ml을 serum vial에 넣어줬다. 모든 13주차 실험구들에는 호기, 혐기상태를 파악하기 위해서 0.001% resazurin이 주입되었다.

분석

항목 NO. 실험구

(용량 : 20ml)

실험조건

산소 영양염 1차 기질 2차 기질

군집 분석 (1반복 실

험)

0 Blank(soil) A

+ - -

An Seq

1 1차 기질

(sodium acetate)

A

+ 0.2g -

An Seq 군집

분석, 오염물 분해도 (3반복 실

2

2차 기질 (1-chloronaphtalane, 1,4-dichlorobenzene

A

+ - 100ng

An Seq

3 1차 기질

+ 2차 기질

A

+ 0.2g 100ng

An

(21)

․ 토양 혐기화 방법 : 보조기질 유효성 실험구 – 13주 후 TCDD분석과 미생 물 군집구조 분석을 실시하였으며 주기적 실험구에서 처리한 조건 외 여러 보조기질들의 토양 내 TCDD농도 저감 기여도를 보기위한 실험구다.

TCDD와 비슷하나 DLCs 중 가장 분해되기 쉬운 형태인 DBF를 Oil(1차 기질 역할 + DBF가 토양에 잘 섞이게 해주는 역할)과 함께 넣은 실험구, airstable한 nZVI와 Oil을 함께 넣은 실험구, 1차 기질을 Dextrin으로 대체 하고 PAHs(Polycyclic aromatic hydrocarbons) 분해 능력이 뛰어난 균주 를 넣은 실험구, Blank 실험구로 구성됐다.

분석 항목

실험구

(용량 : 20ml) 산소 영양

염 Oil DBF Dextrin nZVI 균주

TCDD 분해도

(3반복 실험)

oil(hexadecane)

+DBF An + 1% 0.01g - - -

oil(hexadecane)

+airstablenZVI A + 1% - - 0.03g -

dextrin

+균주(US6-1, IC10) A + - - 0.1g - 1%

Blank(soil) An

+ - - - - -

A

- 분석 방법

․ 미생물 군집분석 : Genomic DNA 추출 - 실험구 내 토양슬러리 3ml 채취 후 PowerMax^◯^R Soil DNA Isolation Kit(MoBio Laboratories Inc.)를 사용해 동봉된 매뉴얼에 따라 bacterial DNA 추출했다.

․ 미생물 군집분석 : 1차 PCR - 16S rRNA 유전자를 증폭하기 위하여 원핵 미생물 유전자 증폭용 범용 primer들인 341F (5‘-CCTACGGGNBGCASCAG-3’) primer와 805R (5‘-GACTACNVGGGTATCTAATCC-3’) primer가 PCR 반응에 사용되었 다(Takahashi et al., 2014). PCR 반응액 조성은 1X Buffer, 0.8 mM dNTPs, 0.5 pM primer, 1.25 unit DNA free-Taq DNA polymerase로 조성된 CellSafe kit가 사용되었고, 전체 증폭 반응물은 20㎕ 용량이 되도 록 조절하였다. 주형 DNA는 1~100 ng을 넣어주었다. 온도조건으로 95℃

에서 5분간 반응 후 94℃에서 60초, 55℃에서 60초, 72℃에서 2분씩 30 회 반복되었고, 마지막에 72℃에서 10분간 더 반응시켰다. 최종반응물은 AMPure XP beads (Beckman Coulter Life Sciences)를 이용하여 정제하 였다.

․ 미생물 군집분석 : 2차 PCR - 1차 PCR 과정을 통해 증폭 후 정제된 16S rRNA 유전자 단편에 시료를 구별하기 위한 Tag(표 참고)를 달기 위하여

(22)

2차 PCR을 실시하였다. PCR 반응용액 조성은 1X Buffer, 0.8 mM dNTPs, 0.2 pM primer, 2.5 unit DNA free-Taq DNA polymerase로 구 성된 CellSafe kit가 사용되었고, 전체 증폭 반응물은 50㎕ 용량이 되도록 조절하였다. 주형 DNA 1~100 ng을 추가하여 반응을 진행시켰다. 2차 PCR은 Tag를 붙여주는 것이 목적이기 때문에 반응 횟수를 적게 하여 지 나친 증폭으로 인한 오류를 줄일 수 있도록 하였다. 온도조건으로 95℃에 서 5분간 반응 후, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분씩 8회 반복되었고, 마지막에 72℃에서 10분간 더 반응되었다. 최종반응물은 AMPure XP beads (Beckman Coulter Life Sciences)를 이용하여 정제하 였다. 정제가 완료된 PCR 산물은 분광광도계를 이용하여 농도를 측정하고 각각의 시료로부터 유래하는 DNA가 동량이 될 수 있도록 혼합하여 한 개 의 시료로 만들어 주었다.

․ 미생물 군집분석 : 대용량 sequence 분석 - 정제된 2차 PCR 산물의 DNA sequence 분석은 (주)천랩에 의뢰하여 수행됐고 대용량 sequencing 에는 Illumina사의 Myseq GA platform이 사용되었다. 선별 read를 Blast 하여 Ez-Taxon의 database의 서열들과 비교된 파일을 ClCommunity^TM프 로그램으로 실행해 군집구조 분석을 수행했다.

․ 탈염능 분석 : 추출 및 분석준비 - 군집분석용으로 3ml이 제거된 각 실험구 vial에 toluene 20ml과 내부표준물질인 a,a′-Dichloro-p-xylene 넣어 overnight 교반해서 실험구내 2차 기질 및 TCDD를 녹여낸다. Sonication은 5 분 3반복한다. 추출용액을 파스퇴르 파이펫으로 채취하여 무수황산나트륨이 올려진 깔데기를 통과시켜 100ml 복숭아 플라스크에 모은다. 내부표준물질을 넣는 것과 overnight교반을 제외한 위 과정을 3회 반복한다. 복숭아 플라스크 에 모인 추출용액을 50℃ 물 중탕하며 질소로 기화시켜 1.06ml로 농축한다.

0.5ml씩 두 번 따서 하나는 2차 기질 GC분석용, 나머지는 ELISA kit를 이용 한 TCDD분석용으로 한다. GC 분석용 0.5ml은 다시 질소를 이용해 benzene 1ml로 치환한다.

․ 탈염능 분석 : 기기분석 - 문헌을 참고하고 수정하여 GC/ECD로 2차 기질 들과 내부표준물질을 한번에 검출할 수 있는 조건을 잡고각 물질에 대한 피 크를 확인 후 분석한다.

※ 낮은 기질농도로 인하여 GC/ECD로 충분한 감도가 나오지 않아 결과는 수록 하지 않음

․ ELISA kit를 이용한 TCDD 농도 분석 : ABRAXIS사의 TCDD ELISA KIT 를 사용했으며 방법은 매뉴얼을 따랐다.

(23)

다. 유형적 발생품(연구시설, 연구장비 등) 구입 및 관리 현황

구입 기관

연구시설/

연구장비명

규격

(모델명) 수량 구입 연월일 구입 가격 (천원)

구입처 (전화번호)

비고 (설치 장소)

KIOST 혐기 챔버 W h i t e l e y

A35 1 2016.10

5,182,700 ( 총 액 5 5 , 6 1 8 , 0 0 0 중 위 금액 부담)

진성유니텍 (010-

KIOST 1317 호

※ 연구개발 수행시작부터 현 작성시점까지 구입한 1개(건)당 1,000만원(부가세 포함)이상의 모든 유형적 발생품 표기

(24)

4. 협력지원사업 결과 및 사업화 계획 가. 협력지원사업 최종 결과

○ 추진 일정

사업 내용 추 진 일 정 (월)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 비고 TCDD의 탈염소화 나노물질

탐색 및 개량 ^중단

토양 혐기화를 통한 DLCs의

탈염소화 연구 ^{동시 수행}

미생물제제의 DBF 분해능 검증 ^{반복 확인}

DBF 분해미생물 추가 탐색 _{현장 시료}^베트남

토양환경 조절-미생물제제 복합 처리효과 검증

Serum Vial

현장 시료를 이용한 DLCs

처리효과 검증 ^{베트남시료}

DLCs 추출 및 분석 ^{ELISA kit}

사업진도(%) 20 25 30 35 38 40 45 50 60 70 80 90

계획 추진

○ 사업계획 변경 이력

2016년 7월 20일 부로 기술 개념 변경

협약 당시 목표는 Fe nano particle을 이용한 탈염소화 후 생물분해였으나 철이온의 특 성상 토양환경에 적용하기 어렵다는 결론을 내고 토양혐기화를 통한 탈염소화로 주요 방 법 변경

○ 추진 실적

- DLC화합물 분해 우수 미생물 확보

․ 확보된 베트남 오염 토양, 국내 유류오염 토양 등으로부터 DLCs에 대한 우수한 분해 미생물을 확보하기 위해서 농후 배양 및 분리를 진행하였다.

․ 미생물 분리 - 총 119주의 단일미생물 분리 후 형광광도계를 이용하여 DBF 분해 활성을 측정하였으나 유의한 분해능을 보이는 균주는 1종이었

(25)

․ 기 확보 균주 평가 - 고분자 PAHs 분해력이 뛰어난

Novosphingobium pentaromativorans

US6-1 균주의 DBF 분해능 및 분해 경향 평가 수행 결과 US6-1 균주는 강력한 DLCs 분해균주로 보고된

Sphingomonas wittichii

RW1보다 빠른 속도로 DBF를 분해함을 확인하고 이를 주 실험 균주로 선정

- DLCs 오염 토양 확보

(26)

․ 연구개발기간 직전 참여기업의 주관하에 베트남 ALuoirns Dong Son 지역 에서 시료 채취 및 검역과정을 거쳐 국내 반입

․ 시료는 농어촌기반공사의 협조를 통해 core sampler를 이용하여 채취하였 으며 오염도는 한국안전성평가연구소를 통해 수행

그림 베트남 방문 기간 중 연구 협의 및 현장시료 채취, 채취된 시료 사진

(27)

- US6-1 균주의 DBF 분해 특성

․ 유전체정보 분석을 통한 dioxygenase 계통 분석 - 다수의 신규성이 높은 유전자 확인

․ DBF 분해 경로 탐색 - 기질 분해 과정 중 GC/MS 분석 결과 중간산물로 3(2H)-benzofuranone이 검출되었으며 수용층에는 붉은 색소가 축적됨

그림 중간산물 3(2H)-benzofuranone의 구조, 배양액 색상 변화 및 알려진 주요 분해경로도

(28)

․ 이상의 결과는 US6-1 균주의 경우 meta-cleavage 경로를 통해 DBF를 분해함을 시사하며 발현유전자 분석과 수용층의 LC/MS 분석을 통해 확증 필요

․ ELISA kit를 이용한 TCDD 분석 결과는 5주 배양 후 10-40%의 TCDD 가 감소됨을 보여 줌

그림 조건에 따른 실험구 내 TCDD 농도 변화. A = 호기조건, An = 혐기조건, S = 혐기 -호기 교대, B = 혐기화 촉진물로서 유기물 첨가, C = 활성 촉진제로서 보조 오염물질 첨가

․ 각 실험구의 미생물 군집구조를 비교해 보면 유기물 주입과 산소 공급 여 부가 미생물 군집구조를 결정하는 것으로 나타나 원하는 방향으로의 미생 물 군집구조 조절이 가능함을 시사함

(29)

○ 기술개발 결과의 정성 및 정량 성과 전체를 기재 - 정성적 성과

․

Novosphingobium pentaromativorans

US6-1 균주가 DBF의 강력한 분해 자이며 기 보고된

Sphingomonas wittichii

RW1과는 다른 분해경로를 가짐 을 규명

․ 혐기-호기 조건 전환을 통해 (적절한 기질 첨가를 통해) 미생물 군집구조 를 조절할 수 있으며 그 결과로 5주 후 10-40%의 TCDD 감소 효과 확인

- 정량적 성과 : 특허, 논문 등의 정량적 성과는 준비 중 ․ 지식재산권

번 호 종 류 명 칭 출원일 등록일 국 명 등록번호 발생년도

년도 년도

(30)

․ 논문 게재/발표 실적

번 호 구분(논문 게재 or

학회발표) 논문명 저자명 저널명 일시 구분(국내, 국외)

SCI 등재 여부

발생 년도

년도

․ 기술이전 실적

번호 기술이전 내역 대상국명 대상기관명 이전일시 수입금액(백만원) 발생년도 년도 년도

․ 인증/포상 실적 등 (국내 및 국외)

번호 구분 명칭 일시 국명 수여기관명 발생년도

년도 년도 ※ 관련 증빙자료 준비

※ 이외, 기타 성과는 주어진 양식의 크기에 구애받지 않고 가능한 상세히 기술 가능

(31)

나. 협력지원사업 추진 체계

○ 주관기관의 역할 및 추진 내역

- 실험 디자인, 수행 및 참여기업에 대한 기술 지원

․ 참여 학생과의 협의를 통해 전체적인 연구 내용과 과정을 설계하고 수행할 수 있도록 함

․ 관련 타 과제 참여를 통한 연수장려금 지원 및 실험 방법, 장비 사용 등에 대한 지도 및 지원

○ 참여기업의 역할 및 추진 내역

- 베트남과의 국제협력 및 사업화 관련 사항 추진

․ Dioxin계 화합물로 오염된 베트남 토양 채취 및 반출 허가 획득 : 결과물 로서 과제 시작 직전인 2015년 11월 중 베트남 Hue성 A Luoi군 Aso 면 Dong Son 읍에 위치하는 옛 청룡부대 주둔지의 고엽제 오염 토양 채취 및 국내 반입

․ 2016년 7월 베트남측 파트너인 VACNE 소속 임원진의 방한 및 연구 협의 수행

․ 2016년 9월 중 베트남에서의 한-베 다이옥신 정화 관련 세미나 지원

․ 2016년 12월 (과제 종료 후) 베트남 현지 실증실험 진행

○ 계약학과 학생의 역할 및 추진 내역

- 참여연구원으로서 실험 수행을 통해 기술 개발 및 적용 과정 습득과 적용 능력 배양

․ 한재호 학생 : 초기 nano particle을 이용한 dehalgenation 연구 (실용성 문제로 중단), 후기 혐기-호기 전환과 보조기질을 이용한 고엽제 성분 분 해 연구 수행. 실험실 내 사전 연구 디자인과 더불어 현장 연구 디자인, 실험구 설치, 결과 분석 등을 수행.

․ 나혜윤 학생 : 활성 미생물 분리와 분리된 미생물의 오염물질 분해 특성 연구 수행. 오염물질을 기질로 한 농후배양과 형광광도계를 이용하는 간편 스크리닝 방법, 고농도 배양 중 오염물질 분해과정 추적, 분해 산물 검출, 유전체 정보 기반 유전자 발현 변화 분석 등의 연구 수행.

다. 시장 현황 및 사업화 전망

○ 다이옥신 오염 토양 정화 시장

(32)

- 베트남 다이옥신 오염 현황 및 정화사업 전망

․ 베트남 다이옥신 오염 토양 규모에 변화는 없음. 다만 오염 농도는 기존 자료에 비해 부분적으로 낮은 것으로 판단되며 실제 정화가 필요한 토양 규모는 오염 면적 200만 ha 중 10% 내외 일 것으로 추정 됨

․ 베트남 자체로는 정화예산이 충분하지 않다고 판단되며 주로 개발사업과 연계되어 시장이 형성 될 것으로 전망됨. 이에 따라 최대규모 시장은 대규 모 오염이 있는 공항들과 공간 제약을 받고 있는 호치민 시 인근이 될 것 으로 보임.

․ 잠정적인 규모는 2 ha에 대해 50억원 규모로 추정되었으며 한-베 협력 등을 통해 최소한의 시장이, 개발사업과 연계되어 대형 시장에 대한 사업 화가 가능할 것으로 판단됨.

라. 교육적 효과

○ 참여 학생들은 아래와 같은 연구 경험을 통해 독자적으로 실험을 수행하기 위한 능력을 배양할 수 있었음

○ 나혜윤 학생

- 독자적 연구 개발 수행 능력 배양

․ 분자생물학적 방법론을 이용한 오염물질 분해 과정과 중간산물 검출에 관 여된 연구를 직접 수행함으로써 독자적 실험 수행 능력 배양

- 미생물 취급 능력 함양

․ 새로운 미생물의 확보를 목적으로 한 농후 배양과 이후의 단일 미생물 분 리 과정 습득

․ 개별 미생물의 보존과 활성 유지의 주요성에 대한 이해 및 지속적으로 이 용하는 균주의 관리 방법 습득

- 미생물 연구와 관련된 분자생물학적 방법론 습득

․ 균주의 분자동정, 유전체 정보를 기반으로 한 유전자 탐색, 분해경로 추정, 유전자 발현 분석과 관련된 RNA 분석 등 생물정화업체에 근무하면서 요 구되는 기본적인 분자생물학 기술 습득

○ 한재호 학생

- 독자적 연구 개발 수행 능력 배양

․ 주어진 목표 (Fe nano particle 제작 및 활용, 혐기화를 통한 탈염소화 실 험)에 대해 필요한 자료 수집, 실험 과정 설계, 준비, 실행에 이르는 전반 적인 과정을 경험함으로써 독자적 실험수행을 위한 능력 배양

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- 미생물 취급 및 군집분석 능력 함양

․ 지정된 균주의 대량 배양과 이를 이용한 분해력 확인 실험 수행을 통해 발 효기 사용, 균주의 유지 관리 능력 습득

․ 분자생물학적 방법을 이용한 미생물 군집구조 분석 실험 수행을 통해 미생 물 군집구조 분석 결과를 생물정화와 연계하여 활용할 수 있도록 교육 - 기기분석 능력 배양

․ 가스크로마토그라프를 이용한 오염물질 분석을 수행함으로써 조건 확립을 포함하여 오염물질 분석을 독립적으로 수행 할 수 있도록 교육 수행

○ 두 학생 모두 본 과제에 병행하여 원유로 오염된 해안의 생물정화기술 적 용 및 검증 과제에 참여하여 현장 연구 및 GC 등을 이용한 오염도 변화과 정 분석 경험을 축적함으로써 생물정화업체인 (주)BJC에 필요한 연구 능 력 함양.