Г.А. Шалахметова, М. Мырзабаева, С. Алтайулы, З. Аликулов
Изучение осмопротектанта, стимулирующего прорастание семян галофитов в условиях засоления
(Евразийский национальный университет им. Л.Н. Гумилева, г. Астана, Казахстан )
Из корней галофитного растения тамарикса был выделен смопротектант (ОСМП). После тонкослойной хроматографии ОСМП не окрашивается нингидрином и не флуоресцирует. Ионобменная хроматография с использованием QAE- и SP-сефадексов показала, что ОСМП содержит кислотную группу, но не аминогруппу. Очищенный препарат ОСМП при HPLC разделяется на две активные формы с временами задержки 18.0 и 19.1, соответственно.
Эрозия и засоление вызывают деградацию почвы и потери ее плодородия. В глобальном масштабе 1.5 миллиард гектаров находится под действием засоления и от одной трети до половины поливных территории потеряли плодородия из-за сильного засоления. Побережье Аральского Моря Казахстана пострадало от чрезмерного полива хлопка и риса. Приток к Аральскому Морю уменьшился меньше чем половина из-за массивного полива. Главной проблемой, вызванной необдуманным поливом является заболачивание и высокий темп испарения привело к засолению почвы.
В результате эволюции у многих видов растений развиты развивались механизмы адаптации, которые позволяют выдержать засоление окружающей среды. Галофитные растения обладают высоким уровнем физиологической пластичностью в отношении стрессу окружающей среды, особенно в ответ повышающему засолению. Более того, галофиты могут аккумулировать в ткани огромное количество солей. Способность галофитов уменьшить соли почвы была продемонстрирована несколькими учеными [1, 2] Таким образом, галофитные растения являются единственным инструментом очистки почвы от солей.
В отличие от взрослых растений семена галофитов при высокой концентрации соли не способны к прорастанию, т.е. прорастание семян галофитов не коррелируется с устойчивостью взрослых растений к высокой концентрации соли [2]. Однако покоящиеся семена галофитов устойчивы высокой концентрации солей и остаются жизнеспособными и прорастают в отсутствии соли. Кроме того, молодые проростки галофитов также чувствительные к засолению. Поэтому из-за высокой чувствительности семян к соли их всхожесть очень низкий и рост проростков замедлен в засоленных почвах, плотность растительности очень низкая, что не позволяет колонизацию почвы растениями и остановки опустынивания. Таким образом, стадия прорастания семян и развитие молодых проростков являются решающими этапами в жизненном цикле галофитов.
Ранее нами было обнаружено, что в корнях некоторых галофитов содержится вещество, названное осмопротектантом (ОСМП), которое стимулировало прорастание семян галофитов в условиях засоления [3]. В данной работе представлены результаты исследований по изучению природы ОСМП, выделенного из корней тамарикса.
Материалы и методы
Из корней проростков тамарикса (Tamarix), плотно посеянных в засоленную почву, выделяли осмопротекторный фактор по следующей схеме: гомогенизация ’ фильтрация через сефадекс G-15 → концентрация → центрифугирование → супернатант → сефадекс G-15 → низкомолекулярная фракция → концентрирование. Низкомолекулярная фракция после сефадекса G-15 концентрировалась в вакуумном испарителе при 37оС. Во избежание метаболизма ОСМП во время гомогенизации и процедур выделения интактные корни галофитов предварительно прогревали при 100оС в течение 5 минут (предыдущие эксперименты показали, что осмопротектант стабилен при прогревании, по крайней мере в течение 10 минут.
Получение осмопротектанта. В высушенные ткани корней (1 г) была добавлена 5 мл сильно охлажденная смесь метанол: хлороформ : вода (60:25:15). Смесь была гомогенизирована
на фарфоровой ступке. Полученный гомогенат центрифугировался при 15000 оборотов в минуту в течение 10 мин при комнатной температуре. Растворы для проведения анализов тонкослойной хроматографии. Стандартные 1% растворы аминокислот приготовили в воде.
Хроматографические растворители ацетонитрил и 0.1М ацетат аммония 60:40, рН 4.0 или 5.0. Хроматографические растворы для дансиламинокислот: (1) Муравьиная кислота - Н2О 1.5:100. (2) Толуол - уксусная кислота 10:1. (3) Этилацетат - метанол - уксусная кислота 2:1:1.
Используется специальная лампа для детекции флуоресценции.
Анализ наличия аминных групп. В составе ОСМП может быть амидная или пептидная связь, т.е. это вещество может состоять из аминокислот. Для обнаружения свободных аминокислот использовался специальный реагент - нингидрин. Поскольку многие производные аминокислот, включая фенилтиогидантоин и дансилные производные, содержат ароматическую часть, их можно обнаружить под флуоресцирующей лампой.
Для связывания данcилхлорида количество изучаемого вещества должно быть около 0.1 мг.
Раствор дансилхлорида - 5 мг в мл ацетона.
HPLC-система состояла из автосамплера (717 плюс), дегазатора, насоса (600Е), фотодиодный (996) детектор. Каждый секунд спектр абсорбции элюированных веществ сканировался от 190 до 400 нм интервалом 1.2 нм. Максимум чувствительности спектра абсорбции был на 195 нм. Ультрафиолетовая абсорбция на этой длине волны использовалась для количественного измерения содержания веществ. HPLC-колонка размером 6.5 × 300 мм (Waters Sugar-Pack 1) использовалась для разделения осмопротектантов. Стационарная фазой была сульфонатностирендивинилбензеновая смола в кальциевой форме. Мобильной фазой была деионизированная, дегазированная и очищенная от бактерии (вакуумная фильтрация через фильтр Millipore HA 0.45 mm) вода, содержащая Са-ЭДТА (5мг/л). Скорость тока поддерживался на 0.6 мл в минуту. Перед началом использования и после прохождения 200 мл растительных образцов колонка восстанавливалась пропусканием через нее одного литра раствора Са-ЭДТА (500 мг в л). Затем колонка промывалась с мобильной фазой (5 мг в л) до полного ее уравновешивания. В наших экспериментах, для достижения оптимального разделения составляющих фактора концентрация Са-ЭДТА в мобильной фазе должна быть 2.5 мг в литре. Высокие концентрации кальция сокращают время задержки компонентов фактора конкуренцией за катионные участки колонки.
Результаты и их обсуждение
Изучение условий прорастания семян галофитов. Как известно, семена галофитов не способны прорастать в условиях засоления почвы (при содержании выше 100 мМ или 0.6 % NaCl в почве). Как правило, семена галофитов начинают быстро прорастать после дождя, когда из верхних слоев почвы соли вымываются в нижние слои почвы. Во время испарения почвенной (дождевой) воды до того, как соли нижних слоев снова поднимутся в верхний слой, семена успевают прорастать, и дальше молодые проростки уже становятся более устойчивыми к засолению. Поэтому нами была изучена устойчивость проростков по мере их развития в динамике возрастания концентрации соли в почве.
В чашках Петри в присутствии супернатанта, полученного из корней, изучали способность прорастания семян галофитов в различных концентрациях NaCl. В более молодых корнях чувствительность к засолению была высокая. Однако, по мере повышения концентрации соли в почве повышалась и устойчивость проростков к засолению. Это сопровождалось с повышением содержания ОСМП в корнях развивающихся проростков. На 20 день сначала воздействие возрастающей концентрации соли активность фактора была максимальной. Через несколько дней после максимальной активности фактора его содержание (или его активность) постепенно падало.
При малых концентрациях соли в среде активность ОСМП была низкая. Однако для ее возрастания было необходимо постепенное повышение концентрации NaCl в среде роста
(Таблица 1). Резкое повышение концентрации соли не индуцировало появления ОСМП в корнях молодых проростков галофитов.
Таблица 1. Содержание осмопротектанта в корнях тамарикса в нормальных условиях и в условиях возрастающих концентрациях соли в почве
Концентрации NaCl (мМ) в почве Дни после подачи NaCl
Контроль без NaCl 50 мМ 100 мМ 150 мМ
1 0.0 0.6 0.8 1.2
2 0.0 0.6 1.7 2.7
3 0.0 0.6 5.4 7.6
4 0.0 0.7 11.2 19.4
5 0.0 0.8 11.7 29.3
6 0.0 0.8 12.3 35.4
8 0.0 0.8 12.5 41.5
9 0.0 1.0 12.3 41.5
10 0.0 1.2 12.8 42.6
Хроматография осмопротектанта на ионобменниках. Синтетические резины, такие как QAE-, AG-1, AG -50 и SP сефадексы идеально подходят для очистки относительно маленьких и стабильных молекул, таких как аминокислоты и их производные, нуклеотиды, пигменты и других. Как известно, такие ионобменные смолы были сделаны из двух частей: нерастворимой, трехмерного матрикса и химически связанной заряженной группы, которые расположены внутри и на поверхности матрикса. Резины синтезируются из различных материалов, включающих полистирен, акриловые резины, полисахариды (декстраны) и целлюлозы.
Ионобменники делятся на катионные и анионные. Ионобменники с четвертичной аминогруппой являются сильным основным анионобменником, тогда как ионобменники с первичной или вторичной ароматической или алифатической аминогруппой относятся к слабым основным анионобменникам. Сильнокислотный катионобменник содержит сульфонокислотную группу.
Ионобменная хроматография на аниообменнике QAE- и катионобменнике SP-сефадексы показала, что осмопротекторный фактор сильно адсорбируется на аниообменнике QAE- сефадексе. Поскольку этот ионообменный сефадекс в качестве "лиганда"содержит четвертичную аминогруппу, молекула осмопротекторного фактора должна содержить карбоксильную (или фосфатную) группу. ОСМП из QAE-сефадекса элюировался высокой концентрации NaOH (10 мМ). Обычно вещество, адсорбированное на ионобменниках при элюции выходит из колонки более концентрированным. Однако активность фракции осмопротекторного фактора, элюированная из QAE-сефадекса, показала очень низкую активность по сравнению с его активностью до нанесения на ионообменник. Остается неясным нарушает ли четвертичный амин носителя QAE и высокая концентрация NaOH структуру молекулы осмопротектанта (т.е. его инактивирует).
При хроматографии на катионобменнике SP-сефадекс ОСМП, выделенный из корней галофитов не адсорбировался на ионобменнике, т.е. элюировался "нулевым объемом". Это указывает на то, что в молекуле ОСМП действительно содержится кислотная группа (или группы), которая не позволяет ему связываться с катионобменником. С другой стороны, молекула осмопротекторного фактора не содержит аминогруппу, или она блокирована другими химическими группами.
Известно, что для анализа NH2-концевых аминокислот используются 2,4- динитрофлуоробензол (реагент Сэнгера), 1-диметиламинонафтален-5-сульфонилхлорид (дансилхлорид) или фенилизотиоцианат (реагент Эдмана). Эти вещества ковалентно связываются с терминальной NH2-концевой аминокислотой пептидов и их комплекс
с аминокислотой остаются стабильным при кислотном гидролизе. Реагент Сэнгера с аминокислотой образует 2,4-динитрофенильное производное желтого цвета. Если содержание аминокислот очень низкое для анализа, для обнаружения используется флуоресценция.
Дансилхлоридный метод дает очень легко обнаруживаемое флуоресцирующее производное.
Проводили дансилирование отдельных аминокислот и препарата ОСМП вышеуказанными методами. Для каждой дансилированной аминокислоты проводили тонкослойную хроматографию на силикогеле в двух направлениях с использованием вышеуказанных растворителей. Таким образом, определялось место каждой аминокислоты на силикогельной пластинке после двумерной хроматографии, т.е. составляли карту расположения отдельных аминокислот после тонкослойной хроматографии (Рис.1 А и Б). Затем проводили такую же двумерную хроматографию препарата осмопротекторного фактора после его инкубации с раствором дансилхлорида. Для двухмерной тонкослойной хроматографии фактора использовали те же растворители. Для каждого варианта растворителей использовали 10 силикогельные пластинки. После хроматографии пластинки высушивали и проверяли на возможное присутствие флуоресцирующего вещества. На пластинках были обнаружены два пятна, обладающие активностью осмопротектанта, т.е. дансилхлорид не связывался с осмопротектантом. Связывание с дансилхлоридом привело бы к модификации молекулы осмопротектанта и потере его активности. Более того, эти пятна не проявляли флуоресцирующей активности. Это подтверждает вывод о том, что молекула осмопротектанта не содержит свободную аминную группу (или групп), которая связалась бы с дансилхлоридом.
Рисунок 1.А - хроматограмма дансилированных аминокислот (флуоресценция). Б - хроматограмма свободных аминокислот (окрашивание нингидрином). Условия для связывания данcилхлорида: Сухой порошок аминокислоты +
раствор дансилхлорида (5 мг в мл ацетона и 0.2 М бикарбонат натрия) и инкубация при комнатной температуре 10 мин. Растворитель для тонкослойной хроматографии: этилацетат - метанол - уксусная кислота (2:1:1).
В следующих экспериментах проводили тонкослойную хроматографию аминокислот без предварительного дансилирования. После тонкослойной хроматографии на силуфоле пластинку окрашивали раствором нингидрина. Эти флуоресцирующие вещества окрашивались нингидрином очень слабо. Слабое окрашивание или не- окрашивание нингидрином говорят о том, что осмопротектант не содержит аминную группу (групп). Как известно, при реакции с нингидрином аминокислота деградируется на соответствующий альдегид, диоксид углерода и аммиак. При этом нингидрин восстанавливается. В присутствии аммиака восстановленный нингидрин вступает в реакцию со своей окисленной формой и образует легко обнаруживаемый окрашенный комплекс [5].
После хроматографии каждую из 10 пластинок силикагеля разрезали на 42 квадратики. Из них отделяли сухие порошки силикагеля. Силикагель из отдельных квадратиков смешивали с дистиллированной водой. Суспензию силикагеля использовали в качестве препарата ОСМП.
Двумерная хроматография в различных растворителях показали, что в квадратике, где обнаружена активность ОСМП (Рис.2 А и Б), не наблюдается флуоресценция. Отсутствие
флуоресценции в квадратике ОСМП еще раз показывает отсутствие в его молекуле аминогруппы, т.е. дансилхлорид не связывается с его молекулой.
Рисунок 2. Тонкослойная хроматография ОСМП на пластинке с силикагелем
А - после растворителя-1 (1.5% муравьиная кислота) и -2 (толуол-уксусная кислота). Б - после растворов 1, 2 и 3 (этилацетат-метанол-уксусная кислота).
Таким образом, вышеуказанные результаты с использованием реагентов для аминогрупп однозначно показали, что в молекуле осмопротектанта, выделенного из корней галофитов, выращенных в сильнозасоленной почве, не содержится аминогруппа (или аминогрупп), или же аминогруппа блокирована другими химическими группами.
Анализы HPLC. Препарат ОСМП, элюированного из соответствующего слоя силикогеля, концентрировали в вакуумном испарителе. Этот препарат ОСМП хроматографировали через колонку HPLC (Waters Sugar-Pack 1 колонка размером 6.5 × 300 мм). Спектр абсорбции элюированных веществ сканировался при длине волны от 190 до 400 нм. Как видно из рисунка, из колонки элюировались два основных пика и несколько минорных пиков (Рис.3).
Во фракциях, элюированных из колонки HPLC, определяли активность осмопротектанта.
Оба основные пики обладали активностью осмопротектанта и уровень их активности соответствовала высоте пиков. Как видно из таблицы, время задержки ОСМП-2 и ОСМП- 1 были 18.07 и 19.17, соответственно. В настоящее время планируется определение молекулярной массы этих форм осмопротектанта с использованием газо-хроматографии - масс- спектрометрии.
Изучение хроматографических профилей различных аминокислот на ионообменниках и HPLC для идентификации осмопротектантов. Время задержки 22 аутентичных аминокислот, введенные в HPLC индивидуально, показаны в таблице 2. Девять из них либо не обнаруживаются при длине 190 - 400 нм, либо не элюируются в этих экспериментальных условиях. Аминокислоты и азотсодержащие осмопротектанты элюируются только после 18 мин, после этого времени различные аминокислоты могут мешать определению изучаемых осмопротектантов. Эти аминокислоты можно полностью удалить с использованием сильного анионобменнника. С другой стороны, слабый катионобменник полностью удаляет мешающие аминокислоты и меняет уровни бетаинов до очень малого значения.
Таблица 2.Характеристики элюции аминокислот и галофитных осмопротектантов на HPLC и ионобменниках
Аминокислоты Выход из ионобменника (%)
Время задержки
Слабый катион Сильный анион
Аланин 22.7 100 100
Аргинин НО* НО НО
Аспарагин 22.0 94 100
Аспартат НО НО НО
Валин 23.6 96 100
Гидроксипролин 20.0 100 100
Гистидин НО НО НО
Глицин 25.0 100 100
Глутамат НО НО НО
Глутамин 21.5 100 100
Изолейцин 27.7 100 100
Лейцин 28.6 100 100
Лизин НО НО НО
Метионин 25.9 98 100
Пролин 30.3 8 100
Серин 21.4 100 100
Треонин 19.9 98 100
Триптофан 36.7 100 100
Тирозин НО НО НО
Цистеин НО НО НО
Фенилаланин НО НО НО
Глицинбетаин 23.09 0 0
ОСМП-1 18.0 7 100
ОСМП-2 19.1 НО НО
НО* - не обнаруживается
Время элюции (мин)
Рисунок 3.Профиль элюции препарата осмопротектанта, выделенного из корней галофитов
В этих исследованиях осмопротектанты разделяются по принципу исключения по размеру и обмена лигандами или слабым катионным обменом. Как известно, более большие молекулы элюируются раньше, чем маленькие. Принцип обмена лигандами растворяет сахара и многоатомные спирты координацией их гидроксильных групп с Са2+ ионами смолы. Всеобщий
эффект заключается в том, что вещества, относящие к сахарам, элюируются в течение 15 минут потому, что они взаимодействуют со смолой очень слабо.
В настоящее время общепризнано, что глицинбетаин (осмопротектант на основе заряженных аминокислот) является потенциальным осмопротектантом, защищающий растительные клетки от засухи и засоления. Поэтому, нами было изучено содержание в растительных тканях и характер элюции коммерческого глицинбетаина для выяснения его идентичности с осмопротектантами ОСМП-1 и ОСМП-2 галофитов.
Таким образом, осмопротектант, выделенный из корней галофита тамарикса, не является глицинбетаином, не содержит аминогруппу, и возможно содержит кислотную группу.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ke-Fu Z. 1991. Desalinization of saline soils by Suaeda salsa. Plant and Soil. 135: 303-305.
2. Zhu J.K. 2003. Regulation of ion homeostasis under salt stress. Curr. Opin. Plant Biol. 6:441- 445.
3. Alikulov Z., Lips H. 2007. Final Research Report. USAID Project СА21-026 (2003-2007): "The Use of Higher Plants for Reclamation of Salt Affected Areas in Central Asia".
4. Fried B. 1999. Thin-layer chromatography. Chromatographic Science. 4th ed. CRC. P.341.
5. Hanai T. 1999. HPLC introduction and application. HPLC: A practical guide. Springer-Verlag (New York). P. 214.
Г.А. Шалахметова, М. Мырзабаева, С. Әлтайұлы, З. Аликулов
Тұзды стресс барысында галофиттердiң өнгiштiгiн жақсартатын осмопротектанттарды зерттеу Галофиттi өсiмдiк тамарикстiң тамырынан осмопротектанттар бөлiнiп алынды. Хромотографиядан кейiн ОСМП-тар нингидринмен боялмады. QAE- және SP-сефадек пайдалана отырып жүргiзген ионалмасу хромотографиясы ОСМП- тардың амин топтарынан емес, қышқыд топтарынан тұратыны анықталды. HPLC арқылы тазаланған ОСМП-тар екi белсендi қабатқа 18.0 және 19.1 бөлiнетiнi анықталды.
Chalakhmetova G.A., Myrzabayeva M.T.,Altayuly C, Alikulov Z.A.
Investigation of osmoprotectants which improves the seed germination under salt stress.
Osmoprtectant (OSMP) was isolated from the roots of tamarix, a halophyte plant. After thin layer chromatography showed that OSMP does not stain with ninhydrin and was not fluorescent. Ion exchange chromatography by using QAE- and SP- sephadexes showed that OSMP contains acid group but not amine group. Purified preparation OSMP was separated by HPLC to two its active forms with retention times of 18.0 and 19.1, respectively.
Поступила в редакцию 12.05.11 Рекомендована к печати 31.05.11
