Chuùng toâi nghieân cöùu söï lan truyeàn vaø tính khaùng thuoác cuûa caùc kieåu hình rieâng bieät E.coli ñöôøng ruoät töø nöôùc thaûi tôùi caùc saûn phaåm lieân quan ñeán vieäc söû duïng nöôùc thaûi (nhö rau troàng baèng nöôùc thaûi) vaø tôùi con ngöôøi taïi tænh Haø Nam.
E. coli vaø caùc coliform töø moâi tröôøng vaø töø ngöôøi ñaõ ñöôïc löïa choïn treân moâi tröôøng nhieãm saéc. Soá löôïng caùc khuaån laïc E. coli vaø caùc coliform khaùc töø caùc maãu nöôùc thaûi chöa xöû lyù vöôït quaù möùc tieâu chuaån söû duïng trong noâng nghieäp. Phaàn lôùn caùc chuûng E. coli ñöôïc phaân tích trong heä thoáng PhenePlateMcoù caùc ñaëc ñieåm sinh hoùa töông töï so vôùi caùc cô sôû döõ lieäu. Qua phaân tích nhoùm, 32 chuûng trong caùc maãu töø moâi tröôøng vaø töø ngöôøi ñaõ ñöôïc xaùc ñònh ôû möùc ñoàng nhaát 0,975 hoaëc hôn, coù nghóa laø caùc chuûng phaân laäp coù söï töông ñoàng hay ñoàng nhaát cao. Söï maãn caûm ñoái vôùi khaùng sinh ôû 15 maãu phaân laäp ñaïi dieän töông öùng laø: Ampicillin vaø Erythromycin: 100%; Trimethoprim: 80%, Gentamicin: 33% vaø Ciprofloxacin: 27%.
Nhö vaäy söï töông ñoàng hay ñoàng nhaát veà sinh hoùa cuûa caùc chuûng E.coli ôû nhöõng maãu khaùc nhau trong trong chu trình nöôùc thaûi cho thaáy söï lan truyeàn cuûa caùc kieåu hình khaùc nhau töø nguoàn nöôùc thaûi chöa xöû lyù tôùi nguoàn nöôùc trong moâi tröôøng, rau vaø tôùi con ngöôøi. Tyû leä cao veà tính khaùng khaùng sinh giöõa caùc chuûng phaân laäp ñaïi dieän laø nhöõng nguy cô cho söùc khoûe ngöôøi daân treân ñòa baøn nghieân cöùu.
Töø khoùa: E. coli, nöôùc thaûi, khaùng khaùng sinh, söï phaùt sinh loaøi
The spread and antibiotic resistance of Escherichia coli from wastewater in Hanam
Lisa Dam(*), Nguyen Viet Hung (**), Phung Dac Cam (***), Roland Mollby(****)
We studied the spread and route of transmission of individual phenotypes of the intestinal bacteria E. coli from wastewater to end products of wastewater use (vegetable) and to humans in Hanan province. E. coli and other fecal coliforms from environmental and human samples were selected on chromogenic medium. The quantity of E. coli and other coliforms colonies growing in samples from raw wastewater widely exceeded standard values for agricultural use. The presumed E. coli isolates were subjected to typing and analysis in the PhenePlateM system and several showed similar biochemical patterns in the generated data. Through cluster analysis, 32 strains from different samples from environment and humans were detected at an identity level of 0,975 or more, meaning
Söï lan truyeàn vaø tính khaùng khaùng sinh
cuûa Escherichia coli trong nöôùc thaûi ôû Haø Nam
Lisa Dam(*), Nguyeãn Vieät Huøng(**), Phuøng Ñaéc Cam(***), Roland Mollby(****)
1. Ñaët vaán ñeà vaø muïc tieâu
Hieän nay, taùi söû duïng nöôùc thaûi laø heä quaû taát yeáu cuûa quaù trình gia taêng daân soá, tieâu thuï taêng leân vaø ñoâ thò hoùa ôû nhieàu nöôùc ñang phaùt trieån. Nöôùc thaûi töø caùc hoä gia ñình, caùc khu coâng nghieäp vaø beänh vieän thöôøng ñöôïc thaûi ra maø khoâng qua xöû lyù hoaëc khoâng ñöôïc xöû lyù moät caùch ñaày ñuû [8;13;15]. Taùi söû duïng nöôùc thaûi coù theå kheùp kín ñöôïc voøng dinh döôõng (nhö nitô, phoát pho) nhöng cuõng coù theå ñoùng goùp vaøo söï laây lan cuûa caùc vi khuaån ñöôøng ruoät, maø chuùng coù theå laø caùc vi sinh vaät gaây beänh vaø coù tính khaùng thuoác. Ñieàu naøy taïo ra caùc nguy cô söùc khoûe ñoái vôùi ngöôøi daân tieáp xuùc tröïc tieáp vôùi nöôùc thaûi, hoaëc giaùn tieáp thoâng qua tieâu thuï caùc loaïi caây troàng ñöôïc troàng töø nöôùc thaûi [13;15]. Hôn 10% ngöôøi daân treân theá giôùi söû duïng nguoàn thöïc phaåm troàng töø nöôùc thaûi. Ngöôøi ta öôùc tính raèng khoaûng 50% ngöôøi daân soáng ôû caùc nöôùc ñang phaùt trieån mang caùc beänh lieân
quan ñeán söï toàn taïi cuûa caùc vi khuaån, virus vaø nguyeân sinh ñoäng vaät gaây beänh trong nöôùc xöû lyù khoâng hieäu quaû [15]. ÔÛ caùc nöôùc ñang phaùt trieån xöû lyù nöôùc thaûi thöôøng chöa quan taâm ñuùng möùc trong caùc muïc tieâu öu tieân do chi phí cao vaø vì coù quaù nhieàu caùc vaán ñeà caáp thieát khaùc. Ngöôøi daân ôû caùc nöôùc phaùt trieån cuõng thöôøng coù ít nhaän thöùc veà nhöõng aûnh höôûng coù haïi ñeán söùc khoûe töø nöôùc thaûi vaø ñieàu naøy gaây khoù khaên ñoái vôùi vieäc caûi thieän söùc khoûe vaø moâi tröôøng [7].
Vi khuaån laø nguoàn oâ nhieãm sinh hoïc phoå bieán nhaát trong nguoàn gaây beänh töø nöôùc. E. coli laø töø nöôùc oâ nhieãm coù theå gaây ra tieâu chaûy vaø ñau buïng [8]. E.colilaø vi khuaån coù daïng hình que, Gram aâm, hieáu khí tuøy nghi vaø thuoäc hoï vi khuaån ñöôøng ruoät (enterobacteriacae). E.coli tieát ra hai loaïi ñoäc toá laø ñoäc toá khoâng chòu nhieät (LT) vaø ñoäc toá chòu nhieät (ST), chuùng nhieãm vaøo nguoàn thöïc phaåm hay nöôùc the isolates are highly similar or identical. The antibiotic susceptibility test on 15 representative isolates of the population showed resistant rates of 100 % for ampicillin and erythromycin, 80 % for trimethoprim, 33% for gentamicin and 27% for ciprofloxacin.
We conclude that findings of biochemically similar or identical strains of E. coli in several places in the nutrient loop denote the transmission of different phenotypes from the untreated wastewater to environmental water, vegetables and humans. High prevalence of antibiotic resistance among the E.
coli isolate represents a risk to the population in the studied area.
Keywords: E. coli, wastewater, antibiotic resistance, phylogeny
Taùc giaû
(*) Thaïc syõ Lisa Dam, Khoa Vi sinh y hoïc, phoøng virus, Beänh vieän ñaïi hoïc Karolinska, Huddinge, Stockholm, Thuïy Ñieån, Email: [email protected]
(**) TS. Nguyeãn Vieät Huøng, Boä moân Moâi tröôøng vaø Söùc khoûe, Ñaïi hoïc Y teá coâng coäng, Vieän Nhieät ñôùi vaø Y teá coâng coäng Thuïy Syõ. Basel, Thuïy Syõ. Khoa nöôùc vaø veä sinh cho caùc nöôùc ñang phaùt trieån (Sandec), Vieän Lieân bang Nghieân cöùu Nöôùc (Eawag). Dubendorf, Thuïy Syõ. Email: [email protected].
(***) GS.TS. Phuøng Ñaéc Cam, Khoa Vi khuaån, Vieän Veä sinh dòch teã trung öông. 1, Yersin, Hai Baø Tröng, Haø Noäi. Email: [email protected]
(****) GS.TS. Roland Mollby, Khoa Vi sinh y hoïc, U vaø sinh hoc teá baøo (MTC), Vieän Karolinska, Stockholm, Thuïy Ñieån
vaø sau khi vaøo ñöôøng tieâu hoùa noù phaù vôõ chöùc naêng bình thöôøng cuûa lôùp maøng nhaày ôû ruoät non, keát quaû laø söï baøi tieát quaù möùc vaø tieâu chaûy [14]. E. colivaø caùc coliform töø phaân thöôøng ñöôïc söû duïng nhö laø vi khuaån chæ thò ñoái vôùi nguoàn nöôùc bò oâ nhieãm phaân [5]. Enterohaemorrhagic E. coli(EHEC) vaø ñaëc bieät laø chuûng 0157:H7 coù theå gaây ra beänh nguy hieåm vôùi bieåu hieän tieâu chaûy ra maùu coù theå daãn ñeán ñe doïa tính maïng do hoäi chöùng HUS ñaëc bieät laø ôû ngöôøi giaø vaø treû nhoû [18].
Theo WHO (2005) 63-85% toång soá tröôøng hôïp nhieãm EHEC laø do phôi nhieãm vôùi nguoàn thöïc phaåm bò oâ nhieãm [18]. Tieâu thuï thòt soáng hay chöa ñöôïc naáu kyõ, hoa quaû, rau, vaø söï nhieãm cheùo trong quaù trình cheá bieán thöïc phaåm coù theå daãn ñeán nhieãm beänh. Nhö vaäy caùc loaïi caây troàng luùa, ngoâ vaø caùc loaïi rau aên soáng hoaëc aên chín troàng töø nöôùc thaûi coù theå gaây beänh cho ngöôøi tieâu thuï neáu caùc loaïi thöïc phaåm naøy khoâng ñöôïc röûa saïch hay cheá bieán ñeå loaïi boû vi sinh vaät gaây beänh. Caùc hôïp chaát khaùng sinh bò thay ñoåi qua caùc quaù trình trao ñoåi chaát trong cô theå con ngöôøi taïo thaønh caùc chaát chuyeån hoùa coù hoaït tính cao hôn hoaëc keùm hôn ñi vaøo nguoàn nöôùc thaûi vaø moâi tröôøng sau quaù trình ñaøo thaûi qua nöôùc tieåu hay phaân [2]. Vieäc söû duïng caùc thuoác khaùng sinh ñaõ laøm taêng söï baùo ñoäng vaø löïa choïn ñoái vôùi caùc vi khuaån khaùng [14;4].
Treân theá giôùi, caùc hôïp chaát khaùng sinh ñaõ thöôøng bò söû duïng quaù lieàu vaø bò laïm duïng trong nhieàu thaäp kyû qua. Hôn 50% caùc thuoác khaùng sinh ñöôïc keâ trong caùc beänh vieän ñeå phaùt cho beänh nhaân maø khoâng chæ roõ veà söï nhieãm töø quaù trình nuoâi caáy hay giaùm ñònh. Nhieàu beänh nhaân vôùi nhieàu beänh khaùc nhau ñöôïc ñieàu trò baèng caùc khaùng sinh coù hoaït phoå roäng, noù ñaõ laøm taêng nguy cô cuûa vieäc phaùt trieån caùc ñoät bieán khaùng thuoác vaø caùc maët aûnh höôûng nguy hieåm ñoåi vôùi ngöôøi beänh. Caùc ñoät bieán phaùt trieån ngaãu nhieân ñaõ taïo ra caùc gen khaùng thuoác, ñoù laø Plasmid R, noù coù theå chöùa caùc gen khaùng ñoái vôùi nhieàu loaïi khaùng sinh, coù theå ñöôïc truyeàn sang caùc vi khuaån khaùc vaø keát quaû laø cuõng taïo ra söï khaùng. Nhieàu kieåu khaùng khaùng sinh ñaõ ñöôïc hình thaønh trong vi khuaån song phoå bieán nhaát laø söï ngaên caûn ñôn giaûn ñoái vôùi söï trao ñoåi qua lôùp maøng ngoaøi. Ñoái vôùi E. coli, chieán löôïc khaùng khaùng sinh cuûa E. colilaø loaïi boû khaùng sinh ra khoûi chuùng thoâng qua caùc bôm vaø photon ñi vaøo teá baøo ruoät nhôø heä thoáng khaùng treân lôùp maøng nguyeân sinh chaát cuûa chuùng [14].
Chuùng toâi nghieân cöùu naøy vôùi muïc ñích tìm hieåu söï lan truyeàn vaø ñöôøng laây lan cuûa caùc kieåu hình rieâng bieät E. coli ñöôøng ruoät töø nöôùc thaûi tôùi caùc saûn phaåm lieân quan ñeán vieäc söû duïng nöôùc thaûi (nhö rau troàng baèng nöôùc thaûi) vaø tôùi con ngöôøi taïi tænh Haø Nam.
2. Phöông phaùp nghieân cöùu
2.1. Ñòa baøn nghieân cöùu
Nghieân cöùu naøy ñöôïc thöïc hieän taïi xaõ Nhaät Taân töø thaùng 2 ñeán thaùng 3 naêm 2009. Caùc maãu xeùt nghieäm ñöôïc thu thaäp töø soâng Nhueä, soâng chaûy töø phía baéc Haø Noäi qua thaønh phoá xuoáng phía nam ñi qua tænh Haø Taây tôùi Haø Nam, qua huyeän Kim Baûng vaø xaõ Nhaät Taân. Xaõ Nhaät Taân, tænh Haø Nam coù soá daân laø 10500 ngöôøi, haàu heát trong soá ñoù tham gia vaøo saûn xuaát noâng nghieäp. Haàu heát caùc hoä gia ñình coù khoâng gian haïn cheá vaø söû duïng nöôùc möa, ñöôïc chöùa trong caùc beå chöùa beâ toâng, laøm nöôùc uoáng. Chæ 20% caùc hoä gia ñình coù söû duïng nhaø veä sinh hôïp tieâu chuaån veä sinh. Caùc gia ñình coù vaät nuoâi, chuùng thöôøng ñöôïc nuoâi raát gaàn vôùi caùc beå chöùa nöôùc möa vaø beáp, coù theå laøm taêng söï nhieãm vaø taùi nhieãm vaøo nguoàn thöùc aên vaø nöôùc trong caùc hoä gia ñình [12].
Nöôùc thaûi töø caùc hoä gia ñình ñöôïc daãn tröïc tieáp ra soâng, hoà thaû caù vaø caùc caùnh ñoàng luùa xung quanh.
Hoà caù, naèm ôû giöõa xaõ Nhaät Taân vaø chöùa nguoàn nöôùc thaûi töø soâng Nhueä vaø töø caùc hoä gia ñình, ñöôïc duøng cho nuoâi caù vaø cuõng coù raát nhieàu treû em bôi loäi ôû ñoù.
Soâng Nhueä coù chöùa nöôùc thaûi chöa ñöôïc xöû lyù töø caùc khu coâng nghieäp vaø caùc hoä gia ñình ôû Haø Noäi, caùc caùnh ñoàng ñöôïc söû duïng nöôùc thaûi töø soâng laøm nöôùc töôùi tieâu [8]. Caùc loaïi rau, ñöôïc troàng treân nöôùc thaûi, thöôøng ñöôïc duøng aên soáng. Trong khi nöôùc möa ñöôïc söû duïng laøm nöôùc uoáng thì nöôùc gieáng khoan thöôøng ñöôïc söû duïng ñeå taém giaët vaø naáu nöôùng.
2.2. Thu thaäp maãu
Chuùng toâi laáy maãu taïi xaõ Nhaät Taân, Kim Baûng vaøo 4 thôøi ñieåm khaùc nhau trong muøa khoâ giöõa thaùng 2 vaø thaùng 3 naêm 2009. Baûng 1 moâ taû nguoàn maãu vaø soá löôïng maãu thu thaäp trong thôøi gian nghieân cöùu. Caùc maãu nöôùc thaûi, nöôùc vaø rau ñaõ ñöôïc choïn ñeå ñaùnh giaù ñöôøng nhieãm cuûa quaù trình nhieãm E. colitôùi con ngöôøi sau khi tieáp xuùc hay aên vaøo.
Maãu phaân cuûa 3 beänh nhaân tieâu chaûy caáp ñöôïc thu thaäp taïi beänh vieän tænh Haø Nam vaø caùc maãu nöôùc thaûi tröôùc vaø sau khi xöû lyù cuûa beänh vieän cuõng ñöôïc laáy maãu.
2.3. Phaân laäp E.coli vaø caùc coliform khaùc Phaân laäp vaø xaùc ñònh E. coli vaø caùc coliform khaùc ñöôïc thöïc hieän taïi Vieän Veä sinh Dòch teã Trung öông, Haø Noäi. Caùc maãu ñöôïc ñem pha loaõng theo cô soá 2 (trong dung dòch ñeäm phosphate) vaø laùng treân ñóa thaïch löïa choïn maøu E. coli/Coliform, sau ñoù nuoâi qua ñeâm ôû 370C.
Moâi tröôøng sinh maøu maøu E. coli/Coliform coù chöùa Rose-Gal and X-Glu, caùc chaát chæ thò maøu xaùc ñònh hoaït tính caû men β-galactosidase vaø töông öùng.
Moâi tröôøng naøy cho pheùp löïa choïn ñoái vôùi caùc vi khuaån Gram aâm nhôø thaønh phaàn cuûa sodium lauryl sulfate.
E. coli/Coliforms laø nhöõng vi sinh vaät coù khaû naêng leân men ñöôøng lactose vaø giaûi phoùng maøu Rose-gal taïo thaønh caùc khuaån laïc maøu hoàng. Gen uidA coù trong vi khuaån E. coli seõ maõ hoùa thaønh men βâ-glucuronidase laøm phaân giaûi chæ thò maøu X-Glu.
Gen naøy khoâng coù trong caùc coliform khaùc neân do ñoù söï phaân bieät giöõa E. colivôùi chuùng laø taïo thaønh caùc khuaån laïc maøu tím töø söï phaân giaûi cuûa E. coli ñoái vôùi caû hai chaát chæ thò maøu [11]. Caùc ñóa cho keát quaû nghi ngôø veà E. coli ñöôïc tieán haønh nuoâi caáy chuyeån ñoái vôùi caùc khuaån laïc rieâng leû treân boä moâi tröôøng löïa choïn E. coli/Coliform khaùc vaø laøm ñoái töôïng cho ñònh loaïi PhP.
2.4. Ñònh loaïi E. colibaèng heä thoáng PhP Ñóa PhP-RE cuûa haõng PhenePlateM system (PhPlate, Stockholm, Sweden;
http://www.phplate.se), heä thoáng naøy söû duïng caùc bieän phaùp ñònh löôïng veà ñoäng hoïc cuûa caùc phaûn öùng sinh hoùa cuûa vi khuaån treân ñóa vi chuaån ñoä vôùi caùc chaát khöû. Caùc chaát ñònh loaïi ñöôïc söû duïng trong phöông phaùp naøy ñöôïc choïn chuyeân bieät cho caùc nhoùm vi khuaån E. colikhaùc nhau ñeå cho keát quaû coù khaû naêng phaân bieät toái öu vaø khaû naêng nhaân leân cuûa chuùng. Ñoái vôùi moãi vi khuaån phaân laäp, noù sinh ra moät daáu aán sinh hoùa töø nhieàu döõ lieäu ñònh löôïng ñöôïc söû duïng trong phaàn meàm PhPlate ñeå tính toaùn möùc ñoä töông ñoàng giöõa caùc chuûng phaân laäp ñem xeùt nghieäm [6;9].
Trong moãi moät maãu, coù tôùi 30 maãu ñôn vaø caùc khuaån laïc phaân laäp gioáng E. coliñöôïc choïn ngaãu nhieân baèng que taêm voâ truøng töø caùc ñóa thaïch löïa choïn maøu coliform/E. colivaø hoøa tan vaøo gieáng ñaàu tieân cuûa daõy pha loaõng ñaõ cho saün 350 μl moâi tröôøng phaùt trieån. Duøng pipette ña keânh, chuyeån 25 μl huyeãn dòch vi khuaån töø gieáng ñaàu tuaàn töï sang 11 gieáng tieáp theo ñaõ coù saün 150 μl moâi tröôøng phaùt trieån. Caùc ñóa sau ñoù ñöôïc nuoâi trong tuû aám 370C, vaø sau 16, 40 vaø 64 giôø nuoâi, caùc ñóa ñöôïc ño böôùc soùng treân maùy ñoïc ñóa ELISA (BioRad Laboraories, USA) vaø scan laïi hình aûnh cuûa ñóa. Caùc giaù trò haáp phuï thu ñöôïc töø maùy ñoïc ELISA vaø hình aûnh ghi töø maùy scan ñöôïc chuyeån ñoåi sang döõ lieäu ñoä haáp phuï daïng soá baèng phaàn meàm PhPWIN (PhPlate, Sweden; http://www.phplate.se). Caùc döõ lieäu PhP taïo ra ñöôïc phaân tích sau naøy theo ñoä töông ñoàng thoâng qua vieäc söû duïng heä thoáng caây phaân caáp vaø caùc döõ lieäu tham khaûo trong phaàn meàm PhP.
38 trong toång soá 142 khuaån laïc E. coliphaân laäp ñöôïc, cho thaáy töông ñoàng hay ñoàng nhaát veà caùc thaønh phaàn phaàn sinh hoùa trong phaân tích PhP, ñöôïc choïn cho phaân tích ñoái chöùng sau naøy trong phaàn meàm PhP. Sau laàn ñoïc cuoái cuøng, caùc giaù trò trung bình cuûa caùc laàn ñoïc cuûa moãi chuûng phaân laäp ñöôïc Baûng 1. Soá löôïng maãu thu thaäp taïi xaõ Nhaät Taân,
Kim Baûng vaø beänh vieän Haø Nam
tính toaùn ñeå ñöa ra daáu aán sinh hoùa goàm 11 giaù trò soá cho moãi chuûng phaân laäp.
2.5. Tính toaùn möùc ña daïng
Caùc daáu aán sinh hoùa cuûa taát caû caùc chuûng phaân laäp ñöôïc so saùnh theo caëp ñoâi ñeå xem xeùt vôùi chuûng khaùc vaø möùc töông ñoàng giöõa moãi caëp ñöôïc tính toaùn theo heä soá töông quan. Sô ñoà ma traän veà söï töông quan theo ñoù thu ñöôïc laø ñoái töôïng cuûa phaân tích nhoùm qua söû duïng phöông phaùp UPGMA [16].
Möùc ñoàng nhaát 0,975 ñöôïc choïn trong nghieân cöùu naøy do caùc pheùp thöû ñaõ cho heä soá töông quan cao hôn giöõa cuøng maãu phaân laäp vaø pheùp thöû ôû toái thieåu 95% caùc tröôøng hôïp [3].
Söï ña daïng ñöôïc tính döïa theo chæ soá ña daïng Simpson (Di) [1] ñeå ño söï phaân boá caùc maãu phaân laäp thaønh caùc loaïi khaùc nhau. Giaù trò cao (toái ña 1) cho thaáy möùc phaân loaïi ngang nhau cuûa caùc chuûng phaân laäp. Ngöôïc laïi, giaù trò thaáp (toái thieåu 0) cho thaáy moät hay vaøi loaïi chieám öu theá trong quaàn theå. Taát caû caùc döõ lieäu ñöa ra, bao goàm caùc tính toaùn veà möùc töông ñoàng, phaân tích nhoùm, vaø caùc tính toaùn veà söï ña daïng ñöôïc thöïc hieän baèng söû duïng phaàn meàm PhPWIN.
2.6. Kieåm tra tính maãn caûm khaùng sinh 15 phaân laäp E. coli, ñaïi dieän chung nhaát trong caùc loaïi PhP ñaõ phaân laäp vaø 5 chuûng tham chieáu khaùc töø Haø Noäi ñaõ ñöôïc caáy chuyeån treân thaïch CLED (Cystine Lactose Electrolyte Deficient) taïi Khoa Vi sinh y hoïc, U vaø sinh hoïc teá baøo (MTC), Stockholm, Thuïy Ñieån ñeå laøm caùc xeùt nghieäm tính maãn caûm khaùng sinh söû duïng phöông phaùp Kirby Bauer khueách taùn treân ñóa. Cô sôû löïa choïn caùc khaùng sinh ñeå thöû tính khaùng khaùng sinh laø choïn caùc khaùng sinh thöôøng ñöôïc duøng ñeå ñieàu trò E. coli.
Nhö vaäy tieán haønh xaùc ñònh tính maãn caûm vôùi 5 loaïi khaùng sinh khaùc nhau [Gentamycin [17], Macrolides: Erythromycin [10], Beta-lactams:
Ampicillin (AMP), Quinolones: Ciprofloxacin (CIP)g, Sulfonamides: Trimethoprim (TMP)g]. Moãi ñóa/chuûng ñöôïc hoøa tan trong 10ml PBS, troän ñeàu vaø laáy 10 μl huyeãn dòch moãi maãu ñöôïc ria caáy treân ñóa thaïch ISO-thaïch xeùt nghieäm ñoä nhaïy (Oxoid, England), sau ñoù caùc taám troøn coù chöùa caùc loaïi khaùng sinh khaùc nhau ñöôïc ñaët treân ñóa thaïch ñaõ ria caáy roài chuyeån vaøo uû 24 giôø ôû 370C. Tính maãn caûm/tính khaùng cuûa moãi maãu ñöôïc ño (ñöôøng kính) bôûi söï öùc cheá xuaát hieän xung quanh taám khaùng sinh troøn. Caùc hôïp chaát ñöôïc choïn ñaïi dieän cho caùc nhoùm
khaùng sinh khaùc nhau vaø vì taát caû khaùng sinh ñoù ñeàu ñöôïc söû duïng phoå bieán khi ñieàu trò caùc beänh ôû Vieät Nam.
3. Keát quaû
3.1. Ñònh löôïng E.coli vaø coliform
Coliform ñöôïc phaùt hieän trong taát caû caùc maãu ôû möùc ñoä khaùc nhau. Moät löôïng lôùn caùc khuaån laïc moïc treân moâi tröôøng löïa choïn maøu bao goàm caùc maãu töø nguoàn nöôùc thaûi thoâ nhö maãu nöôùc thaûi töø hoä gia ñình vaø beänh vieän. Vi khuaån E. coli ñöôïc phaùt
Baûng 2. Soá löôïng khuaån laïc E. coli vaø coliform treân g rau vaø treân ml nöôùc
hieän trong gaàn moät nöûa soá maãu. Maãu nöôùc thaûi chöa xöû lyù cuûa beänh vieän tænh Haø Nam coù chöùa caùc khuaån laïc nhieàu nhaát nhöng khuaån laïc cuõng ñöôïc thaáy trong maãu nöôùc thaûi beänh vieän ñaõ qua xöû lyù. Nhieàu khuaån laïc cuõng ñöôïc tìm thaáy ôû maãu nöôùc laáy töø hoà caù, soâng vaø nöôùc thaûi töø hoä gia ñình.
3.2. Caáu truùc cuûa quaàn theå E.coli
Caùc maãu trong soá 142 maãu ñöôïc cho laø chuûng E. coliñöôïc phaân laäp trong caùc ñóa PhP-RE cho thaáy söï töông ñoàng caùc thaønh phaàn sinh hoùa trong cô sôû döõ lieäu PhP. Qua phaân tích nhoùm baèng phaàn meàm PhP, 32 chuûng töø caùc maãu khaùc nhau ñaõ ñöôïc xaùc ñònh vôùi möùc ñoàng nhaát laø 0,975 hoaëc cao hôn. Ñieàu naøy cho thaáy caùc chuûng phaân laäp coù söï töông ñoàng hay tính ñoàng nhaát cao (Hình 3).
Caùc nhoùm lôùn cuûa caùc chuûng phaân laäp coù söï töông ñoàng hay ñoàng nhaát cao ñöôïc tìm thaáy trong caùc maãu nöôùc thaûi töø caùc hoä gia ñình. Caùc chuûng phaân laäp töø caùc maãu khaùc nhau cuõng ñöôïc nhoùm laïi vôùi nhau trong möùc ñoàng nhaát. Trong moät tröôøng hôïp, caùc maãu phaân laäp töø ngöôøi, maãu rau vaø nöôùc töø moâi tröôøng vaø beänh vieän ñöôïc nhoùm laïi gaàn nhau (Hình 3). ÔÛ moät soá tröôøng hôïp khaùc, caùc nhoùm cuûa caùc chuûng phaân laäp khaùc coù theå ñöôïc thaáy trong caùc maãu rau vaø nöôùc töø moâi tröôøng vaø beänh vieän (Hình 3).
Phaân tích ñoái chöùng caùc chuûng phaân laäp ñöôïc ñaùnh daáu trong heä thoáng PhP cho thaáy caùc möùc töông ñoàng töông öùng vôùi caùc phaân tích tröôùc ñaây.
Caùc chuûng phaân laäp coù möùc töông ñoàng hay ñoàng nhaát cao ñöôïc tìm thaáy trong caùc maãu rau muoáng vaø rau xaø laùch, nöôùc soâng Nhueä, nöôùc hoà caù, caùc maãu phaân, nöôùc thaûi hoä gia ñình vaø nöôùc thaûi beänh vieän tröôùc vaø sau xöû lyù.
Hình 3. Caây phaân caáp cuûa 142 chuûng E. coli phaân laäp töø caùc maãu nôi E. coli ñöôïc tìm thaáy sau khi phaân tích nhoùm vaø phaân loaïi PhP-RE.
Truïc tung chæ möùc töông ñoàng. Caùc nhoùm ôû beân phaûi haøng chaám coù möùc ñoàng nhaát 0.975 hoaëc hôn. Ww = nöôùc thaûi, hospital 1 = nöôùc thaûi tröôùc khi xöû lyù, beänh vieän tænh Haø Nam, hospital 2 = nöôùc thaûi sau khi xöû lyù, beänh vieän tænh Haø Nam, river 1 vaø river 2
= Vò trí khaùc nhau khi thu thaäp maãu nöôùc soâng Nhueä, pat 2 = beänh nhaân treû em gaùi 7 thaùng tuoåi, pat 3 = treû em trai 7 thaùng tuoåi, caû hai ñaõ ñieàu trò taïi beänh vieän. Caùc chuûng phaân laäp ñaùnh daáu troøn ñöôïc choïn ñeå phaân tích ñoái chöùng sau naøy veà tính töông ñoàng.
Hình 4. Caây phaân caáp cuûa 38 chuûng E. coli phaân laäp cho thaáy söï töông ñoàng sau phaân tích nhoùm vaø phaân loaïi PhP-RE.
Caùc chuûng phaân laäp coù neàn ñaäm ñöôïc phaân tích theo möùc maãn caûm vôùi 5 khaùng sinh khaùc nhau. Ww = nöôùc thaûi, hospital 1 = nöôùc thaûi tröôùc khi xöû lyù, beänh vieän tænh Haø Nam, hospital 2 = nöôùc thaûi sau khi xöû lyù, beänh vieän tænh Haø Nam, river 1 vaø river 2 = Vò trí khaùc nhau khi thu thaäp maãu nöôùc song Nhueä, pat 2 = beänh nhaân treû em gaùi 7 thaùng tuoåi, pat 3 = treû em trai 7 thaùng tuoåi, caû hai ñaõ ñieàu trò taïi beänh vieän. E. coli(D2260 ETEC+) vaø Klebsiella (Pneumoniae) laø chuûng ñoái chöùng töø Haø Noäi. Caùc chuûng phaân laäp ñöôïc ñaùnh daáu (*) ñöôïc xaùc ñònh khoâng phaûi laø E. coli
3.3. Tính maãn caûm khaùng sinh
15 ñaïi dieän caùc chuûng phaân laäp coù caùc phaàn töông ñoàng ñaõ ñöôïc xeùt nghieäm tính maãn caûm khaùng sinh. Tyû leä khaùng cao vôùi caùc khaùng sinh kieåm tra ñöôïc phaùt hieän trong taát caû caùc maãu ñaïi dieän. Taát caû caùc maãu naøy khaùng vôùi Ampicillin vaø Erythromycin, 12 maãu khaùng vôùi Trimethoprim, 5 vôùi Gentamicin vaø 4 vôùi Ciprofloxacin. Hai maãu phaân laäp töø maãu nöôùc thaûi chöa qua xöû lyù cuûa beänh vieän vaø moät chuûng phaân laäp töø rau muoáng vaø moät chuûng phaân laäp töø maãu nöôùc hoà caù khaùng vôùi taát caû caùc loaïi khaùng sinh xeùt nghieäm. Voøng khaùng khuaån cuûa hai loaïi khaùng sinh Ciprofloxacin vaø Gentamicin laø lôùn nhaát. Ñieàu naøy coù nghóa laø söï maãn caûm cuûa nhöõng khaùng sinh naøy cao hôn so vôùi caùc loaïi khaùng sinh khaùc. ÔÛ caùc maãu nöôùc, rau vaø maãu töø ngöôøi ñeàu thaáy söï töông ñoàng veà tính khaùng.
Khi so saùnh caùc chuûng ñoái chöùng trong döõ lieäu PhP vôùi caùc chuûng E. colitham chieáu töø MTC vaø caùc beänh vieän ôû Haø Noäi (Hình 4), caùc chuûng ñoái chöùng cho thaáy söï khoâng töông ñoàng ôû möùc 0,975 so vôùi baát cöù döõ lieäu naøo cuûa MTC Stockholm. Baûy chuûng ñoái chöùng cho thaáy söï töông ñoàng ôû möùc 0.975 vôùi döõ lieäu tham chieáu töø chuûng YS-L143A vaø 4 chuûng ñoái chöùng cho thaáy söï töông ñoàng vôùi caùc chuûng HN-166, HN-169 vaø HN-172 - taát caû caùc chuûng naøy ñeàu ñöôïc phaân laäp töø caùc beänh vieän ôû Haø Noäi.
4. Baøn luaän
Trong taát caû caùc maãu, caùc coliform ñöôïc tìm thaáy vöôït xa vôùi giaù trò chuaån. Theo Meisner vaø coäng söï (2007), möùc coliform toång soá khoâng ñöôïc vöôït quaù 5.000 MPN (Most Probable Number)/100 ml nöôùc sinh hoaït vaø möùc ñoä trong nöôùc duøng trong töôùi tieâu noâng nghieäp khoâng quaù 10.000 MPN/100 ml [8]. Ñaëc bieät, nöôùc thaûi thoâ töø hoä gia ñình (100.000 CFU/ml) vaø töø beänh vieän (>50.000 CFU/ml) ñaõ vöôït xa möùc tieâu chuaån vaø khieán cho nöôùc caøng khoâng theå phuø hôïp vôùi caùc muïc ñích noâng nghieäp. Moät löôïng lôùn vi khuaån E. colicoù trong rau muoáng (18/gram) vaø rau xaø laùch (15/gram) coù theå laø do keát quaû cuûa vieäc söû duïng nöôùc thaûi ñeå töôùi.
Trong nghieân cöùu ôû xaõ Nhaät Taân, nöôùc uoáng laø nöôùc möa saïch ban ñaàu vaø nöôùc röûa ñöôïc laáy töø caùc gieáng khoan. Caùc maãu nöôùc töø caùc nguoàn naøy vöôït quaù möùc giaù trò colifom tieâu chuaån ñoái vôùi nöôùc sinh hoaït nhöng khoâng chöùa E. coli. Ñieàu naøy coù theå giaûi thích laø do quaù trình kieåm soaùt veä sinh chöa ñuùng daãn ñeán laøm taùi nhieãm nguoàn nöôùc.
Caùc chuûng E. coliphaân laäp coù söï töông ñoàng vaø ñoàng nhaát cao ñaõ ñöôïc xaùc ñònh töø nhieàu maãu khaùc nhau. Nhoùm caùc maãu phaân laäp töø caùc nôi khaùc nhau trong chu trình nöôùc /nöôùc thaûi - thöïc phaåm (rau) - con ngöôøi cho thaáy coù söï lan truyeàn cuûa caùc chuûng E. colitrong chu trình naøy do vieäc xöû lyù maàm beänh chöa trieät ñeå hoaëc chöa coù xöû lyù. Vieäc tìm thaáy caùc chuûng töông ñoàng hay ñoàng nhaát töø nöôùc chöa xöû lyù hoaëc ñaõ xöû lyù töø beänh vieän cho thaáy heä thoâng xöû lyù nöôùc thaûi chöa ñaït yeâu caàu ñeå loaïi boû vi sinh vaät.
Trong caùc chuûng phaân laäp töø maãu phaân vaø maãu nöôùc thaûi beänh vieän tröôùc vaø sau xöû lyù cuõng ñeàu tìm thaáy nhoùm töông ñoàng hay ñoàng nhaát. Do nöôùc thaûi ñaõ qua xöû lyù cuûa beänh vieän ñöôïc thaûi vaøo töï nhieân, söï lan truyeàn cuûa caùc chuûng vi khuaån ñöôøng ruoät töø con ngöôøi ra ngoaøi moâi tröôøng töï nhieân laø hieän töôïng ñang dieãn ra vaø laø nguy cô cho söùc khoûe coäng ñoàng, ñaëc bieät laø nhöõng ngöôøi tieáp xuùc vôùi loaïi nöôùc thaûi naøy.
Choïn 32 chuûng E. coliphaân laäp laøm ñaïi dieän ñeå xaùc ñònh caùc ñaëc ñieåm töông ñoàng vôùi caùc chuûng phaân laäp khaùc trong nhoùm phaân tích ñaàu tieân, nhoùm laïi vôùi nhau vôùi ít nhaát 1 chuûng khaùc trong boä cuøng möùc ñoàng nhaát trong phaân tích ñoái chöùng ñaõ ñöôïc laäp. Muïc ñích cuûa phaân tích naøy ñeå ñaûm baûo caùc chuûng phaân laäp ñöôïc nhoùm cuøng nhau trong möùc ñoàng nhaát vôùi cuøng caùc ñaïi dieän. Hai trong soá 15 maãu ñaïi dieän, ñöôïc choïn cho phaân tích tính khaùng khaùng sinh, chuùng ñöôïc choïn qua moâi tröôøng sinh maøu vaø baèng heä thoáng PhP, chæ ra caùc ñaëc tính khoâng phuø hôïp vôùi E. coli. Nhöõng chuûng phaân laäp naøy töø maãu nöôùc hoà caù vaø maãu phaân (ñöôïc ñaùnh daáu sao* ôû hình 3) khoâng leân men ñöôøng lactose ôû laàn nuoâi caáy sau treân thaïch CLED. Ñieàu naøy khoâng phuø hôïp vôùi E. colivaø caùc khuaån laïc vôùi nhöõng hình daïng khaùc so vôùi nhöõng khuaån laïc phuø hôïp vôùi E.coli.
Khoâng coù caùc phaân tích tieáp theo ñeå xaùc ñònh caùc loaøi naøy, nhöng chuùng toâi cho raèng ñaây coù theå laø moät soá loaïi coliform.
So saùnh caùc chuûng phaân laäp vôùi 19 chuûng E. coli tham chieáu cuûa MTC, Stockholm, ñaõ ñöôïc thöïc hieän ñeå xaùc ñònh caùc type huyeát thanh. Khoâng coù söï töông ñoàng naøo trong möùc ñoàng nhaát ñöôïc phaùt hieän, ñieàu naøy coù theå laø keát quaû cuûa söï toàn taïi caùc gen khaùc nhau giöõa caùc chuûng coù quan heä xa cuûa cuøng moät loaøi.
7 maãu phaân laäp ñoái chöùng ñöôïc nhoùm laïi vôùi nhau trong möùc ñoàng nhaát vôùi moät maãu tham chieáu töø beänh vieän Yeân Sôû ôû Haø Noäi vaø 4 chuûng ñoái chöùng
ñöôïc nhoùm laïi vôùi nhau vôùi 3 chuûng khaùc töø beänh vieän Haø Noäi. Caùc chuûng beänh vieän ñöôïc phaân laäp töø caùc maãu tieâu chaûy, vaø neáu phaùt hieän thaáy caùc chuûng töông ñoàng hay ñoàng nhaát trong nöôùc thaûi chöa qua xöû lyù töø beänh vieän vaø ôû nöôùc soâng, thì ñieàu naøy chæ ra raèng ñaõ coù söï lan truyeàn cuûa E. colitrong trong chu trình nöôùc /nöôùc thaûi - thöïc phaåm (rau) - con ngöôøi nhö ñaõ trình baøy ôû treân.
Tính toaùn veà söï ña daïng, ñaõ cho giaù trò cao ñoái vôùi taát caû ba nhoùm phaân tích (taát caû caùc chuûng phaân laäp, hình 3: 0,965, caùc ñoái chöùng, hình 4: 0,927 vaø so saùnh vôùi tham chieáu, hình 5: 0.973), chæ ra raèng caùc chuûng E. coli phaân laäp phaân boá ñeàu vaø bao goàm nhieàu loaïi khaùc nhau trong caùc quaàn theå nghieân cöùu.
Keát quaû naøy phuø hôïp vôùi Vilanova vaø coäng söï (2004) phaùt hieän thaáy raèng söï ña daïng cao thöôøng laø caùc tröôøng hôïp caùc maãu thu thaäp trong moâi tröôøng [5].
15 chuûng E. coliphaân laäp ñaïi dieän ñaõ cho thaáy nhìn chung coù tyû leä khaùng cao ñoái vôùi taát caû caùc loaïi khaùng sinh ñöôïc kieåm tra. Tyû leä khaùng cao coù theå laø do keát quaû cuûa vieäc laïm duïng caùc khaùng sinh vaø xöû lyù nöôùc thaûi chöa ñuû quy trình. Caùc tröôøng hôïp ngoaïi leä laø caùc ñaïi dieän trong nhoùm cao nhaát ôû hình 4, do khoâng chaéc chaén veà söï töông ñoàng trong möùc ñoàng nhaát vaø 2 ñaïi dieän khoâng phaûi laø E. coli trong phaân tích sau ñoù.
5. Keát luaän
Caùc ñöôøng truyeàn laây cuûa vi khuaån ñöôøng ruoät E. coli coù theå ñöôïc thaáy ôû nhieàu keát quaû trong nghieân cöùu naøy. Caùc chuûng töông ñoàng hay ñoàng nhaát veà sinh hoùa, trong soá ñoù laø caùc maãu tieâu chaûy ñöôïc phaân laäp töø caùc beänh nhaân trong beänh vieän, vaãn coù theå ñöôïc tìm thaáy ôû nhieàu ñieåm trong chu trình dinh döôõng töø nöôùc - thöïc phaåm - con ngöôøi.
Caùc chuûng phaân laäp töø caùc maãu khaùc nhau cuûa ngöôøi, thöïc phaåm vaø nöôùc ñaõ cho thaáy söï töông ñoàng hay ñoàng nhaát veà kieåu hình trong caùc nghieân cöùu nhoùm cuûa döõ lieäu chung PhP. Thöïc teá naøy chöùng toû söï lan truyeàn cuûa nhieàu kieåu hình khaùc nhau töø nöôùc thaûi chöa qua xöû lyù hay xöû lyù chöa kyõ ñeán caùc saûn phaåm cuoái cuøng nhö moâi tröôøng nöôùc, caùc loaïi rau vaø tôùi con ngöôøi. Caùc vi khuaån gaây beänh vaø khaùng thuoác coù theå ñöôïc truyeàn sang ngöôøi thoâng qua vieäc söû duïng caùc nguoàn nöôùc thaûi ñeå töôùi caùc loaïi caây troàng vaø tieáp xuùc tröïc tieáp vôùi nöôùc bò nhieãm baån.
Söï phoå bieán cao veà tính khaùng khaùng sinh ñaõ ñöôïc thaáy töø nghieân cöùu caùc chuûng phaân laäp ñaïi dieän, nhö ôû treân ñeàu höôùng khaùng Ampicillin, Erythromycin vaø Trimethoprim. Nhöõng phaùt hieän naøy, cuøng vôùi löôïng lôùn caùc coliform vaø E.coli tìm thaáy trong caùc maãu, nhaán maïnh söï quan troïng cuûa vieäc xöû lyù nöôùc thaûi ñeå giaûm thieåu caùc nguy cô ñoái vôùi ngöôøi daân ôû ñòa baøn nghieân cöùu.
6. Lôøi caûm ôn
Chuùng toâi caùm ôn Khoa Vi sinh y hoïc, U vaø sinh hoïc teá baøo (MTC), Vieän Karolinska vaø Patricia Colque-Navarro, Docent Inger Kuhn cuøng Daniel Reyes-Navarrete ñaõ trôï giuùp vaø höôùng daãn trong nghieân cöùu naøy. Caùm ôn Boä moân nhieãm truøng ñöôøng ruoät, Vieän Veä sinh dòch teã trung öông, Haø Noäi, BS. ThS. Phaïm Ñöùc Phuùc ñaõ giuùp ñôõ trong thu thaäp maãu, TS. Hoaøng Thò Thu Haø trong boá trí thí nghieäm, CN. Ñoã Bích Ngoïc, Nguyeãn Thò Beù vaø Nguyeãn Thò Gaám ñaõ giuùp ñôõ thí nghieäm veà nhieãm truøng ñöôøng ruoät vaø Nguyeãn Vaân Trang, Leâ Thò Hoàng Nhung vaø Leâ Kim Anh ñaõ trôï giuùp thí nghieäm veà sinh hoùa. Nghieân cöùu ñöôïc söï hoã trôï bôûi SIDA (Nghieân cöùu thöïc ñòa heïp) vaø Trung taâm NCCR North-South.
Taøi lieäu tham khaûo
1. Hunter, P. R. & Gaston, M. A. (1988), "Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of Simpson's index of diversity", J Clin Microbiol, 26(11), pp. 2465-6.
2. Khetan, S. K. & Collins, T. J. (2007), "Human pharmaceuticals in the aquatic environment: a challenge to Green Chemistry", Chem Rev, 107(6), pp. 2319-64.
3. Kuhn, I., Iversen, A., Burman, L. G., Olsson-Liljequist, B., Franklin, A., Finn, M., Aarestrup, F., Seyfarth, A.
M., Blanch, A. R., Vilanova, X., Taylor, H., Caplin, J., Moreno, M. A., Dominguez, L., Herrero, I. A. & Mollby, R. (2003), "Comparison of enterococcal populations in animals, humans, and the environment--a European study", Int J Food Microbiol, 88(2-3), pp. 133-45.
4. Sayah, R. S., Kaneene, J. B., Johnson, Y. & Miller, R.
(2005), "Patterns of antimicrobial resistance observed in Escherichia coli isolates obtained from domestic- and wild- animal fecal samples, human septage, and surface water", Appl Environ Microbiol, 71(3), pp. 1394-404.
5. Vilanova, X., Manero, A., Cerda-Cuellar, M. & Blanch, A. R. (2004), "The composition and persistence of faecal coliforms and enterococcal populations in sewage treatment plants", J Appl Microbiol, 96(2), pp. 279-88.
6. Kuhn, I., Allestam, G., Stenstrom, T. A. & Mollby, R.
(1991), "Biochemical fingerprinting as a tool to study the diversity and stability of intestinal microflora", Microecology and Therapy, 23pp. 140-148.
7. Massoud, M. A., Tarhini, A. & Nasr, J. A. (2009),
"Decentralized approaches to wastewater treatment and management: Applicability in developing countries", Journal of Environmental Management, 90(1), pp. 652-659.
8. Meisner, C., Carew-Reid, J., Nham, D. T., Lam, T. Q., Cole, B., Anh, L. T. H., Spickett, J., Bertolatti, D., Dunn, B., Ha, N. T., Dung, N. T. K. & Hiep, H. S. (2007), Improving water quality in the Day/Nhue river basin:
capacity building and pollution sources inventory, Red river basin sector project: Water resource management,
International Centre for Environmental Management.
9. Mollby, R., Kuhn, I. & Katouli, M. (1993),
"Computerised biochemical fingerprinting a new tool for typing of bacteria", Reviews in Medical Microbiology, 4(4), pp. 231-241.
10. Montgomery, M. A. & Elimelech, M. (2007), "Water and sanitation in developing countries: Including health in the equation", Environmental Science & Technology, 41(1), pp.
17-24.
11. Panisello, P. J. & Quantick, P. C. (1998), "Application of Food MicroModel predictive software in the development of Hazard Analysis Critical Control Point (HACCP) systems", Food Microbiology, 15(4), pp. 425-439.
12. Pham-Duc, P., Nguyen-Viet, H., Hattendorf, J., Zinsstag, J., Cam, P. D. & Odermatt, P. (2011), "Risk factors for Entamoeba histolytica infection in an agricultural community in Hanam province, Vietnam", Parasites &
Vectors, 4:102.
13. Pham, D. P. (2007), "Health risks related to wastewater reuse in Vietnam using quantitative microbial risk assessment".
14. Prescott, L. M., Harley, J. P. & Klein, D. A. (2005), Microbiology, sixth edition, McGraw-Hill / Higher Education, New York.
15. Rahman, M. (2005), Health hazards associated with dissemination of bacterial strains in wastewater recycling, Microbiology and Tumor Biology Center, Karolinska University Press, Stockholm.
16. Sneath, P. H. A. & Sokal, R. R. (1973), Numerical taxonomy: the principles and practice of numerical classification, W. H. Freeman.
17. Swedish Environmental Protection Agency (2004), Atgarder for att minska fosforutslappen fran befintliga enskilda avlopp.
18. WHO (2005), Enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC). Fact sheet 125, World Health Organization, Geneva.
