Pendahuluan
Ekstrak etanol daun gedi telah diidentifikasi memiliki kandungan senyawa flavonoid (Pine et al 2011; Mandey et al. 2014). Menurut Lako et al (2007) daun gedi yang diekstrak dengan cara dikukus memiliki kandungan total flavonoid sebesar 1mg g-1 bahan dengan quercetin sebesar 80 µg g-1 bahan dan -karotin sebesar 280 µg g-1 bahan. Penelitian tersebut semakin memperkuat data bahwa esktrak daun gedi memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai salah satu sediaan obat yang berfungsi sebagai antioksidan. Namun dalam dosis yang terlalu tinggi, ekstrak etanol daun geni dilaporkan memiliki sifat toksik walaupun toksisitasnya tergolong dalam toksisitas rendah (Assagaf et al. 2013).
Flavonoid adalah kelompok terbesar dari fenolik dengan kapasitas antioksidan yang kuat (Aberoumand dan Deokule 2008). Flavonoid termasuk kelompok benzo- -piron dengan struktur umum difenilpropan (C6-C3-C6) terdiri dari 2 (dua) cincin aromatis yang dihubungkan oleh 3 (tiga) atom karbon membentuk heterosiklik teroksigenasi, ditandai dengan A, B, C (Filipiak 2001). Efektivitas flavonoid sebagai penangkap radikal dan pengkelat ion logam ditentukan oleh adanya struktur (katekol) ortho dihidroksi pada cincin B, ikatan rangkap pada C2-3 yang terkonjugasi dengan gugus fungsi C4 okso, gugus -OH pada C3 di cincin C, dan gugus -OH pada C5 di cincin A (Tapas et al. 2008). Kombinasi gugus C3-OH dan C5-OH dengan C4-karbonil dan ikatan rangkap C2-3 dapat meningkatkan aktivitas penangkap radikal bebas (Amic et al. 2003). Selain itu kemampuan senyawa flavonoid sebagai antioksidan juga ditentukan oleh potensial reduksinya, peningkatan aktivitas antioksidan flavonoid disebabkan karena terjadi penurunan potensial reduksinya (Rice-Evans et al. 1997).
Bioaviabilitas dari senyawa flavonoid cenderung rendah pada kondisi ukuran partikel yang besar. Hal ini dinyatakan oleh Lante dan Friso (2013) pada pengamatan ukuran partikel katekin, biovaliabilitas katekin mengalami penurunan pada saat ukuran partikel dan ikatan hydrogen yang semakin besar. Berdasarkan pada kondisi tersebut, untuk meningkatkan biovaiabilitas flavonoid ekstrak daun gedi perlu dilakukan pengecilan ukuran partikel. Nanoemulsi merupakan salah satu delivery system yang optimal, karena dapat diformulasikan dengan semua bahan alami, serta berpotensi meningkatkan bioaviabilitas dari flavonoid, sejalan dengan peningkatan aktivitas antioksidannya (Sessa et al. 2013).
Berdasarkan pada tingkat konsumsi energinya, nanoemulsi dapat diproduksi dengan menggunakan dua pendekatan, yaitu metode high energy dan metode low energy (Acosta 2009; Leong et al. 2009; Tadros et al. 2004). Menurut Tadros et al (2004) pembentukan nanoemulsi dengan pendekatan high-energy dan metode homogenisasi tekanan tinggi, masih kurang efisien karena energi yang dialokasikan untuk pembentukan nanoemulsi hanya 0,1% sedangkan 99,9% dialihkan untuk memanaskan larutan. Kondisi ini akan berpengaruh pada saat
28
menyebabkan bias yang sangat signifikan. Oleh karena itu, dalam penelitian ini dilakukan dengan dua pendekatan yaitu menggabungkan antara high energy dan low energy. Penggabungan kedua pendekatan tersebut, dimaksdukan agar, proses produksi nanoemulsi dapat dilakukan dengan efektif dan efisien. Oleh karena itu tujuan dari penelitian ini adalah 1) untuk mendapatkan kondisi proses terbaik berdasarkan pada ukuran partikel, flavonoid total dan aktivitas antioksidan, 2) mengetahui stabilitas nanoemulsi terhadap ukuran partikel, flavonoid total, dan akivitas antioksidan selama 14 hari. Beberapa parameter lain yang diteliti adalah pH, konduktivitas dan lama penyimpanan, karena parameter-parameter tersebut mempengaruhi sifat fisikokimia dari nanoemulsi (Ananingsih et al. 2013;. Heertje 2013).
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah Homogenizer IKA Ultra- Turax Model T25 Digital dengan speed range antara 3.000-25.000 rpm dan diameter 13 mm, Particle Size Distribution CILAS 1090 Liquid, Rotary Evaporator IKA RV 10 Digital, Accela LC system (Thermo)LC MS/MS, labu ukur, gelas piala, thermometer, spektofotometer UV-VIS. Sedangkan bahan yang digunakan adalah ekstrak daun gedi dalam bentuk cair, Tween® 80, aquades, dan etanol
Metode Pembuatan Nanoemulsi
Penelitian ini akan dilakukan dengan menggabungkan dua pendekatan yaitu high energy dan low energy. Untuk metode high energy yang digunakan adalah menggunakan alat pendispersi dan metode low energy dengan menggunakan metode evaporasi. Metode yang digunakan berdasarkan pada hasil penelitian Silva et al. (2011) yang dimodifikasi. Hasil ekstrak daun gedi yang diperoleh dari maserasi dilarutkan kembali dalam etanol 96% dengan perbandingan ekstrak daun gedi dan etanol adalah 1:99 b/v yang nantinya disebut sebagai fase minyak. Sedangkan untuk fase air dilarutkan Tween 80 sebanyak 6% dan basa fosfat sebanyak 94%. Kedua fasa minyak dan air kemudian dicampurkan dengan perbandingan fase minyak dan air adalah 1:9. Larutan ini kemudian di homogenisasi menggunakan Ultra Turrax T25 dan divariasikan pada kecepatan putaran antara 5.000 – 20.000 rpm, sedangkan lama waktu homogenisasi divariasikan antara 5 - 10 menit. Pemilihan kedua faktor ini berdasarkan pada penelitian Silva et al. (2011) yang menyatakan bahwa ukuran partikel nano dan kestabilan ukuran partikel sangat dipengaruhi olah kecepatan putaran homogenisasi dan lama waktu homogenisasi. Setelah dihomogenisasi, larutan di evaporasi dengan tekanan rendah untuk menghilangkan etanol, setelah dievaporasi dilakukan pengamatan terhadap beberapa sifat fisik dan kimiawi nanoemulsi, diantaranya adalah ukuran partikel, pH, konduktivitas, kadar flavonoid total dalam emulsi dan aktivitas antioksidan. Stabilitas nanoemulsi juga diukur dengan parameter pada ukuran partikel, pH, konduktivitas, kadar flavonoid dan aktivitas antioksidan. Diagram alir penelitian disajikan dalam Gambar 5.
29
Gambar 5 Diagram alir proses pembentukan nanoemulsi senyawa flavonoid Ekstrak Daun Gedi (1%) Etanol 96% (99%) Pencampuran (Suhu 30oC) Larutan fase minyak Tween 80 (6%) Basa Fosfat pH 7 (94%) Pencampuran (Suhu 30oC) Larutan fase Air Pencampuran (Minyak : Air = 1 : 9) v/v Homogenisasi Kecepatan Homogenisisasi (5.000-20.000) rpm Lama Homogenisasi (5-10) menit Evaporasi (suhu 40oC, Tekanan
vacuum, 30 menit) Etanol
Nanoemulsi Ekstrak Daun Gedi
Uji Ukuran Partikel
Uji Stabilitas partikel nano emulsi
pH
Konduktivitas
Uji flavonoid total
30
Analisis Distribusi Ukuran Partikel
Distribusi ukuran nanoemulsi ekstrak etanol daun gedi diukur menggunakan alat pengukur partikel nano (Particle Size Distribution CILAS 1090). Prinsip kerja dari CILAS 1090 menggunakan laser diffraction sebanyak 2 buah, kemudian diolah dengan dengan menggunakan software, untuk lebih jelasnya skema dari prinsip kerja CILAS 1090 disajikan dalam Lampiran 10. Nanoemulsi hasil perlakuan diukur distribusi sebaran partikel yang terbentuk (dalam satuan nm). Sebanyak 2 ml larutan nanoemulsi tanpa pengenceran dimasukkan kedalam kuvet, kemudian dimasukkan kedalam alat dan diukur distribusi partikelnya. Pengambilan sample dilakukan pada hari ke 0, 5, 9 dan 14. Sebaran distribusi ukuran partikel dipetakan dalam bentuk grafik.
Pengukuran pH
Pengukuran pH dilakukan dengan mengambil nanoemulsi hasil pengukuran kemudian di uji nilai pH dengan alat pH meter ( C861 multi-parameter analyser Consort United Kingdom ) pada suhu 27 ± 1oC. Pengukuran pH dilakukan secara periodik pada hari ke-0, 5, 9 dan 14.
Analisis Konduktivitas
Analisis konduktivitas digunakan untuk mengetahui jumlah ion yang terdapat didalam cairan atau larutan. Konduktivitas listrik diukur secara langsung dengan menggunakan konduktivitas meter (C861 multi-parameter analyser Consort United Kingdom ) pada suhu 27 ± 1oC. Pengukuran konduktivitas dilakukan secara periodik pada hari ke- 0, 5, 9 dan 14.
Penentuan Flavonoid Total Ekstrak Daun Gedi
Penentuan kadar flavonoid total dengan menggunakan metode yang digunakan oleh Wan et al. (2014) seperti yang telah dijelaskan pada Bab II
Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Gedi
Aktivitas antioksidan ekstrak daun gedi ditentukan dengan menggunakan metode yang dikembangkan oleh Locatelli et al. (2004) seperti yang telah dijelaskan pada Bab II
Rancangan Percobaan
Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan rancangan acak lengkap faktorial dan dievaluasi secara statistik dengan menggunakan ANOVA α = 0,05. Terdapat 2 variabel perlakuan yang digunakan dalam proses produksi nanoemulsi yaitu kecepatan homogenisasi (A), dan lama waktu homogenisasi (B). Kecepatan homogenisasi dinyatakan dalam 5 taraf yaitu
a. Perlakuan A1 = 5.000 rpm b. Perlakuan A2 = 10.000 rpm c. Perlakuan A3 = 15.000 rpm d. Perlakuan A4 = 20.000 rpm
dan perlakuan untuk lama waktu homogenisasi dilakukan dalam 2 taraf yaitu : a. Perlakuan B1 = 5 menit
31 b. Perlakuan B2 = 10 menit
Setiap kombinasi perlakuan di ulang sebanyak 3 kali, model matematik yang digunakan adalah (Montgomery et al. 2012) :
Dimana :
Yij = Variabel respon (ukuran partikel, konduktivitas, pH, flavonoid total dan aktivitas antioksidan) karena pengaruh faktor A taraf ke- i, faktor B taraf ke- j dan ulangan ke-k
μ = Pengaruh rata-rata sebenarnya
Ai = Pengaruh faktor A (kecepatan homogenisasi) taraf ke-i Bj = Pengaruh faktor B (lama waktu homogenisasi) taraf ke-j
ABij = Pengaruh interaksi antar faktor A taraf ke-i dan faktor B taraf ke-j ijk = Pengaruh galat faktor A taraf ke-i, faktor B taraf ke-j dan ulangan
ke-k
i = Jumlah taraf A = 6 j = Jumlah taraf B =2 Perhitungan G-Force Homogenisasi
Perhitungan G-force homogenisasi dilakukan dengan menggunakan metode yang dikembangkan oleh Gleason (2012). Menurut Gleason (2012) Sebuah gaya yang diberikan pada partikel dalam sentrifugasi adalah fungsi sederhana dari kecepatan rotasi sentrifugasi dan jari-jari rotasi. Berdasarkan pada manual Homogenizer IKA Ultra-Turax Model T25 Digital (www.ika.com) peralatan homogenizer yang digunakan memiliki diameter 13 mm, sehingga nilai r adalah 6,5 mm, maka G-force homogenisasi dapat di tentukan dengan persamaan :
G-force= 1.12 x R x (RPM/1000)²
Dimana : R = Jari-jari dari homogenizer (mm) RPM = Kecepatan putar (rpm)
Hasil Dan Pembahasan Karakteristik Nanoemulsi Ekstrak Daun Gedi
Nanoemulsi dapat dibuat dengan dua pendekatan yang berbeda, yang biasanya dikategorikan sebagai metode energi tinggi atau rendah energi (Tadros et al 2004). Metode energi tinggi memanfaatkan perangkat mekanik yang mampu mengganggu dan membaurkan minyak dan fase air menjadi tetesan minyak kecil tersebar di dalam air. Saat ini metode ini paling banyak digunakan untuk memproduksi makroemulsi dalam industri dengan menggunakan peralatan homogenizer katup tekanan tinggi, mikrofluidizer dan sonikator (Tadros et al. 2004; Date et al. 2010). Metode rendah energi mengandalkan kontrol fenomena batas antarmuka antara fase air dan minyak serta sangat bergantung pada sifat permukaan dari setiap molekul aktif, seperti kelarutan dan geometri molekul (Date et al. 2010). Metode ini tidak banyak digunakan dalam industri karena kurangnya
32
informasi mengenai kinerja dari sistem ini. Walaupun beberapa penelitian menunjukkan bahwa sistem ini lebih efisien dibandingkan dengan metode energi tinggi (Tadros et al. 2004; Anton et al. 2008; Anton dan Vandamme 2009).
Pada penelitin ini, proses pembuatan nanoemulsi ekstrak daun gedi dilakukan dengan kombinasi antara metode energi tinggi dan metode energi rendah. Kombinasi ini dilakukan untuk mengefisienkan energi yang dibutuhkan untuk membentuk droplet dalam ukuran nano. Penambahan etanol 96% sebanyak 99% pada 1 % ekstrak daun gedi, berfungsi untuk menurunkan tegangan permukaan yang terdapat didalam esktrak daun gedi (Saberi et al. 2013) pada fase ini yang terjadi hanya penurunan viskositas dari larutan dan konduktivitasnya (Silva et al. 2011).
Berdasarkan pada tahapan penelitian (Gambar 5) terdapat 3 (tiga) mekanisme terbantuknya nanoemulsi ekstrak daun gedi. Mekanisme pertama adalah pencampuran ekstrak daun gedi dengan menggunakan pelarut etanol (co- solvent), pada tahap ini mekanisme yang terjadi adalah co-solvent mengadsorsi ekstrak daun gedi pada antarmuka minyak dan air, yang berdampak pada penuruan tegangan permukaan ekstrak daun gedi, sehingga ekstrak daun gedi terlarut dalam co-solvent etanol. Menurut Wang dan Pal (2015) co-solvent etanol dapat mendorong molekul-molekul ekstrak untuk terpisah sehingga terpecah dalam partikel-partikel yang lebih kecil. Mekanisme kedua adalah pembentukan fase air, dimana surfaktan Tween 80 yang terlarut dalam basa fosfat pH 7. Tween 80 merupakan molekul amfifilik yang memiliki afinitas ganda (Rosen dan Kunjapa 2012), dimana pada satu sisi bersifat polar dan pada sisi yang lain bersifat non polar, ketika diinteraksikan dengan basa fosfat, maka sisi polar akan berikatan dengan molekul basa fosfat, sehingga terdispersi dalam basa fosfat, terdispersinya Tween 80 ini menjadi monomer-monomer aktif pada sisi non polar, hal inilah yang biasa disebut sebagai misela (Wang dan Pal 2015). Mekanisme ketiga adalah pencampuran antara fase minyak dan fase air, fase pembentukan partikel nano diawali pada saat fase minyak dilarutkan pada fase air yang telah bercampur dengan surfaktan (Tween 80), pada tahap ini surfaktan bergerak kearah fase minyak untuk membentuk keseimbangan (Tadros et al. 2004), hal ini menyebabkan terbentuknya partikel-partikel kecil yang membawa fase minyak (Bouchemal et al. 2004). Proses homogenisasi dilakukan untuk mempercepat dan mengurangi tegangan permukaan antar fase minyak dan air, sehingga ukuran nano dapat dibentuk dengan cepat (Silva et al. 2011).
Sistem nanoemulsi esktrak etanol daun gedi adalah sistem nanoemulsi minyak dalam air, oleh karena itu untuk menstabilkan larutan diperlukan surfaktan. Devarajan dan Ravichandran (2011) menyatakan bahwa surfaktan yang sesuai dengan sistem nanoemulsi minyak dalam air adalah surfaktan yang memiliki hydrophilic-hydrophobic balance (HLB) yang tinggi, yaitu berkisar antara 8-18. Dalam penelitian ini surfaktan yang digunakan adalah Tween 80, karena surfaktan ini memiliki HLB pada suhu 25oC sebesar 15 (Bouchemal et al. 2004) yang sesuai dengan karakteristik sistem nanoemulsi minyak dalam air. Fase air yang digunakan dalam penelitian ini adalah buffer fosfat dengan pH 7, tujuan dari penggunaan buffer fosfat pH 7 adalah untuk menghindari terjadinya proses penyabunan pada Tween 80 ketika dicampur dengan larutan. Menurut Rowe et al. (2009) Tween 80 merupakan elektrolit yang stabil pada kondisi larutan asam dan
33 basa rendah, namun akan mengalami penyabunan pada kondisi larutan asam dan basa kuat.
Ukuran Partikel Nanoemulsi Ekstrak Etanol Daun Gedi
Hasil pembuatan nanoemulsi ekstrak daun gedi yang dilakukan dengan dua tahap yaitu dilusi dan homogenisasi memberikan hasil ukuran partikel yang berkisar antara 100 ± 4 nm hingga 385 ± 7 nm pada nilai D90. Menurut McClement (2005) ukuran partikel yang dihomogenisasi dengan kecepatan tinggi memiliki ukuran partikel berkisar antara 2.000 nm hingga 10.000 nm, sementara itu Ultra Turrax pada proses homogenisasi hanya mampu menghasilkan ukuran partikel sebesar 1µm (Benita dan Levy 1993; Sing et al. 1999), ini menunjukkan bahwa teknik dilusi dengan menggunakan etanol 96% mampu membantu proses difusi fase minyak kedalam fase air.
(a)
(b)
Gambar 6. Rata-rata ukuran partikel nanoemulsi ekstrak etanol daun gedi pada kombinasi kecepatan homogenisasi (a) dan lama waktu homogenisasi
34
Ukuran partikel yang paling kecil (100 ± 4 nm) didapatkan pada perlakuan homogenisasi pada kecepatan homogenisasi sebesar 20.000 nm dan lama waktu homogenisasi selama 10 menit, sedangkan ukuran partikel yang paling besar (385 ± 7 nm) didapatkan pada proses homogenisasi dengan kecepatan 5.000 rpm dan dilakukan selama 5 menit. Lee dan McClement (2010) menyatakan bahwa salah satu faktor yang mempengaruhi terbentuknya nanoemulsi adalah kecepatan homogenisasi dan lama waktu homogenisasi.
Berdasarkan pada Gambar 6a dan 6b terlihat bahwa homogenisasi yang dilakukan selama 5 menit memiliki ukuran partikel yang lebih besar jika dibandingkan dengan ukuran partikel yang dihomogenisasi selama 10 menit. Sedangkan kecepatan homogenisasi berpengaruh terhadap penurunan ukuran partikel nanoemulsi ektrak daun gedi. Silva et al. (2011) menyatakan bahwa pada produksi nanoemulsi -karotin dengan homogenizer tekanan tinggi, faktor yang paling dominan adalah lama waktu homogenisasi dan kecepatan homogenisasi.
Penambahan surfaktan Tween 80 juga memberikan kontribusi terhadap pembentukan ukuran partikel nanoemulsi, karena surfaktan mampu mengurangi tegangan permukaan antara fase minyak dan fase cair (Shah dan Moudgil 2003). Penurunan tegangan antar muka ini akan memudahkan deformasi partikel menjadi lebih kecil, sehingga dengan menggunakan homogenizer sudah mampu membentuk partikel dalam ukuran nano (Fernandez et al. 2004). Hal ini sesuai dengan yang diungkapkan oleh Morales et al. (2003) yang menyatakan bahwa penambahan surfaktan Tween 80 sebesar 4% telah mampu merubah ukuran partikel dari 2 µm menjadi 80 nm dengan teknik homogenisasi.
Tabel 10 Hasil Uji lanjut Tukey ukuran partikel nanoemulsi ekstrak daun gedi pada berbagai perlakuan
Kecepatan Homogenisasi (rpm) Lama Waktu Homogenisasi (menit) Ukuran Partikel (nm) 5.000 5 385 ± 7a 5.000 10 348 ± 14a 10.000 5 287 ± 16b 10.000 10 225 ± 16c 15.000 5 203 ± 22cd 15.000 10 182 ± 9cd 20.000 5 175 ± 9d 20.000 10 100 ± 4e
Keterangan : huruf superskrip berbeda pada kolom yang sama menunjukkan nilai berbeda nyata (P-value < 0,05)
Hasi analisis ANOVA dengan parameter P-value, menunjukkan bahwa kecepatan homogenisasi, lama homogenisasi dan interaksi keduanya memiliki P- value < 0,05 (Lampiran 12). Kondisi ini menunjukkan bahwa interaksi antara faktor kecepatan homogenisasi dan lama waktu homogenisasi memberikan pengaruh yang nyata terhadap ukuran partikel. Hasil uji lanjut Tukey (Tabel 10) menunjukkan bahwa kondisi terbaik diperoleh pada kondisi kecepatan homogenisasi sebesar 20.000 rpm atau setara dengan nilai G-force sebesar 2.912
35 × g dengan lama waktu 10 menit dinama ukuran partikel yang dihasilkan sebesar 100 ± 4 nm (Lampiran 13). Ukuran partikel tersebut masih lebih kecil jika dibandingkan dengan yang dihasilkan oleh Deepa et al. (2012) yang menghasilkan nanoemulsi ekstrak Phyllantus amarus sebesar 213 nm, namun masih lebih besar dari yang dihasilkan oleh Wang et al. (2008) yang menghasilkan nanoemulsi ekstrak kurkumin dengan ukuran partikel sebesar 79,5 nm.
Konduktivitas Nanoemulsi Ekstrak Etanol Daun Gedi
Konduktivitas merupakan parameter fisik yang digunakan untuk menentukan pelapasan elektrolit yang terdapat didalam larutan (Gadkari dan Balaraman 2015). Parameter konduktivitas telah banyak digunakan sebagai salah satu bentuk perubahan fisik dari larutan makroemulsi menjadi nanoemulsi (Rao dan McClement 2012; Mayer et al. 2013; Gadkari dan Balaraman 2015). Perubahan didasarkan pada jumlah ion dan konsentrasi padatan yang terlarut didalamnya, sebagai perbandingan nilai konduktivitas air murni adalah 0,055 µS cm-1, sementara itu air minum sebesar 500 µS cm-1 dan air laut adalah 5 mS cm-1. Ini menunjukkan bahwa semakin kecil ukuran partikel akan merubah sifat konduktivitas emulsi menjadi lebih rendah.
Tabel 11 Hasil Uji lanjut Tukey konduktivitas nanoemulsi ekstrak daun gedi pada berbagai perlakuan Kecepatan Homogenisasi (rpm) Ukuran Partikel Rata-rata (nm) Konduktivitas rata-rata (µS cm-1) 5.000 367 ± 21 264,838a 10.000 256 ± 34 263,737ab 15.000 193 ± 19 262,362b 20.000 138 ± 38 259,417c
Keterangan : huruf superskrip berbeda pada kolom yang sama menunjukkan nilai berbeda nyata (P-value < 0,05)
Ekstrak daun gedi sebelum dibentuk menjadi nanoemulsi memiliki nilai konduktivitas sebesar 325 mS cm-1, namun setelah dilakukan proses dilusi dan homogenisasi mengalami perubahan nilai konduktivitas berkisar antara 259,55 ± 0,59 µS cm-1 hingga 265,32 ± 0,71 µS cm-1 (Gambar 7). Hal ini menunjukkan bahwa secara fisik larutan tersebut telah mengalami perubahan jumlah ion dan total padatan terlarut yang terdapat didalamnya. Perubahan ini disebabkan karena adanya pengaruh ukuran dari partikel yang terbentuk (Masmoudi et al. 2005). Menurut Lee et al. (2011) nilai konduktivitas pada nilai pH yang sama berkorelasi dengan kekuatan ion, jadi semakin tinggi konduktivitas memberikan nilai kekuatan ion semakin tinggi. Namun, peningkatan kekuatan ion akan menurunkan zeta potensial dari larutan (McClement 2005). Hal ini dapat disimpulkan bahwa semakin tinggi nilai konduktivitas akan memberikan nilai zeta potensial yang semakin rendah, sehingga nilai konduktivitas telah mampu digunakan sebagai salah satu parameter untuk menentukan perubahan sifat listrik dari larutan
36
Gambar 7. Hubungan antara ukuran partikel dengan konduktivitas nanoemulsi ekstrak daun gedi
pH Nanoemulsi Ekstrak Daun Gedi
pH emulsi dalam makanan maupun minuman bervariasi tergantung pada sifat produknya (Lee et al. 2011). Menurut Debnath et al. (2011) pada nanoemulsi yang digunakan sebagai sediaan obat, pH sangat menentukan dalam interaksi dengan lingkungan, terutama jika mekanisme yang digunakan adalah Self-nanoemulsifying Drug Delivery Systems (SNEDDS). Hasil penelitian menunjukkan bahwa pH yang dihasilkan berkisar antara 6,67 ± 0,01 hingga 6,86 ± 0,01. Nilai pH terendah didapatkan pada kondisi operasi kecepatan homogenisasi sebesar 5.000 rpm dengan lama waktu 10 menit, sedangkan pH tertinggi pada kondisi operasi kecepatan homogenisasi sebesar 10.000 rpm selama 5 menit. Tabel 12 Hasil Uji lanjut Tukey pH nanoemulsi ekstrak daun gedi pada berbagai
perlakuan Kecepatan Homogenisasi (rpm) Lama Waktu Homogenisasi (menit) Ukuran Partikel (nm) pH 5.000 5 385 ± 7 6,77 ± 0,01c 5.000 10 348 ± 14 6,67 ± 0,01e 10.000 5 287 ± 16 6,86 ± 0,01a 10.000 10 225 ± 16 6,77 ± 0,01c 15.000 5 203 ± 22 6,83 ± 0,01b 15.000 10 182 ± 9 6,78 ± 0,00c 20.000 5 175 ± 9 6,75 ± 0,01cd 20.000 10 100 ± 4 6,73 ± 0,00d
Keterangan : huruf superskrip berbeda pada kolom yang sama menunjukkan nilai berbeda nyata (P-value < 0,05)
y = -0.0001x2 + 0.086x + 249.77 R² = 0.976 255 260 265 0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 K on d u k tivitas (µ S /cm ) Ukuran Partikel (nm) Konduktivitas Poly. (Konduktivitas)
37 Hasil analisis ANOVA menunjukkan bahwa kecepatan homogenisasi, lama waktu homogenisasi dan interaksi keduanya memberikan P-value < 0,05 (Lampiran 16), sehingga dapat disimpulkan bahwa interaksi antara kecepatan homogenisasi dan lama waktu homogenisasi memberikan pengaruh yang nyata. Hasil uji lanjut Tukey (Tabel 12) menunjukkan bahwa perlakuan dibagi menjadi 6 kelompok yang berbeda nyata yaitu kelompok a, b, c, cd, d dan e (Lampiran 17). Kelompok yang memiliki pH paling kecil adalah kelompok e (5.000 rpm, 10 menit) dengan nilai pH sebesar 6,67 dan yang paling besar adalah kelompok a dengan nilai pH sebesar 6,86 (10.000 rpm, 5 menit). Fluktuasi nilai pH hingga saat ini masih belum teridentifikasi dengan jelas, menurut Rocha-Filho et al. (2014) pH nanoemulsi merupakan hasil dari disosiasi ion antar bahan penyusunnya dengan lingkungan, sehingga pengaruh perlakuan yang bersifat fisik tidak dapat digunakan sebagai acuan untuk mendeteksi pengaruhnya, termasuk ukuran partikel dari nanoemulsi.
Flavonoid Total dan Aktivitas Antiosidan Nanoemulsi Ekstrak Daun Gedi Penggunaan homogenisasi dengan kecepatan tinggi akan menyebabkan peningkatan suhu larutan dan pergerakan partikel yang sangat cepat sehingga berdampak pada kerusakan flavonoid yang terdapat didalam larutan (Bidone et al. 2015). Hasil penelitian menunjukkan bahwa peningkatan kecepatan homogenisasi dan lama waktu homogenisasi dapat menurunkan kadar flavonoid total yang terdapat didalam larutan (Gambar 8). Flavonoid total yang paling tinggi (0,457 ± 0,004 mg ml-1) didapatkan pada kondisi operasi kecepatan homogenisasi 5.000 rpm dan lama waktu 5 menit, sedangkan flavonoid total yang paling rendah (0,396 ± 0,001 mg ml-1).
Gambar 8 Rata-rata kadar flavonoid total nanoemulsi ekstrak daun gedi pada kombinasi kecepatan homogenisasi dan lama waktu homogenisasi Hasil analisis ANOVA menunjukkan bahwa kecepatan homogenisasi, lama waku homogenisasi dan interaksi keduanya memberikan perbedaan yang nyata
y = -0.0164x + 0.4763 R² = 0.9423 y = -0.012x + 0.4455 R² = 0.8848 0.36 0.38 0.40 0.42 0.44 0.46 0.48 5,000 10,000 15,000 20,000 T ot al F lavonoid ( m g ml -1) Kecepatan Homogenisasi (rpm) 5 menit 10 menit
38
uji lanjut Tukey menunjukkan bahwa kadar flavonoid total yang paling tinggi didapatkan pada kondisi operasi kecepatan homogenisasi sebesar 5.000 rpm dengan lama waktu proses 5 menit (0,457 ± 0,004 mg ml-1) dan kadar terendah pada kondisi operasi kecepatan homogenisasi sebesar 20.000 rpm dengan lama waktu proses selama 10 menit (0,396 ± 0,001 mg ml-1) (Lampiran 19). Prediksi fungsi flavonoid pada lama waktu 5 menit adalah y = -0,0164x + 0,4763 dan lama waktu 10 prediksi fungsi liniernya adalah y= -0,012x + 0,4455. Hal ini mengindikasikan bahwa flavonoid total akan mengalami penurunan sejalan dengan peningkatan kecepatan homogenisasi. Penurunan total flavonoid paling besar terjadi pada lama waktu 5 menit karena memiliki nilai slope yang lebih besar.
Perubahan ukuran partikel ternyata berdampak pada aktivitas antioksidan nanoemulsi ekstrak daun gedi yang terbentuk. Hal ini dapat dilihat dari hasil penelitian seperti yang disajikan pada Gambar 9. Berdasarkan pada Gambar 9 terlihat bahwa kecenderungan nilai IC50 mengalami peningkatan, yang berarti bahwa aktivitas antioksidan mengalami penurunan sejalan dengan peningkatan ukuran partikel. Fungsi prediksi terhadap peningkatan IC50 adalah y = 0,0691x + 463,32. Menurut Sessa et al. (2013) ukuran partikel nanoemulsi berpengaruh terhadap aktivitas antioksidan, penurunan ukuran partikel akan meningkatkan kelarutan flavonoid dan memperbesar luas permukaan flavonoid per satuan volume untuk berinteraksi dengan radikal bebas DPPH. Kondisi ini dapat dilihat pada Gambar 9, dimana pada ukuran partikel 100 nm memiliki nilai IC50 sebesar 468 µg ml-1, sedangkan pada ukuran 385 nm nilai IC50 meningkat sebesar 491 µg