BAB I. PENDAHULUAN
BAB 2. TINJAUAN KEPUSTAKAAN
2.2. Agregasi Trombosit
Tahun 1962 O`Brien dan Born menemukan instrument untuk mengukur agregasi trombosit yang memakai dasar turbidimetri. Alat ini distandarisasi memakai plasma kaya trombosit (PRP) sebagai 0% agregasi dan plasma miskin trombosit (PPP) sebagai 100% agregasi. Dicatat transmisi cahaya yang melalui cuvet berisi suspensi trombosit yang diaduk pada suhu 37°C. Bila terbentuk aggregate setelah penambahan agonis, dijumpai peningkatan transmisi cahaya. Respon agregasi trombosit dihitung dengan membagi jarak dari baseline ke agregasi maksimal dengan jarak dari baseline ke agregasi 100%. Agonis yang berbeda menghasilkan pola agregasi yang berbeda. Pola agregasi trombosit dikenal respon primer terhadap penambahan agonis eksogen seperti ADP, diikuti respon sekunder dari pelepasan
adenine nukleotida yang terdapat dalam granula padat trombosit. Respon tersebut dikenal sebagai gelombang pertama dan kedua. Respon bifasik ini dapat tidak terlihat pada penambahan agonis konsentrasi tinggi. Dengan agonist kolagen, pola agregasi menggambarkan adhesi trombosit dengan fibril kolagen diikuti agregasi trombosit. Aspirin dapat menghambat agregasi trombosit dengan agonis kolagen dosis rendah, tetapi pada dosis yang lebih tinggi agregasi masih terjadi. 19,36,37
2.2.1.Variabel Pemeriksaa Agregasi trombosit19,36,38,39
2.2.1.1.Venapunksi
Sampel pasien dewasa diambil dengan jarum 18-21 G dan syringe plastic. Untuk kasus pediatric, dipakai jarum 23-25 G.
2.2.1.2.Antikoagulan
Sitrat
Sodium sitrat (0,102 M, 0,129 M sitrat buffered dan non buffered) dengan rasio 9 bagian darah dengan 1 bagian antikoagulan merupakn antikoagulan pilihan untuk pemeriksaan agregasi trombosit. Sebaiknya tidak memakai Vacutainer karena dikhawatirkan dapat terjadi aktivasi trombosit oleh tekanan shear vakum. Beberap laboratorium mengkoreksi hematokrit, terutama bila nilai hematokritnya terlalu tinggi atau rendah. Hardisty dkk menemukan bahwa pada orang dengan nilai hematokrit yang tinggi, diperlukan lebih banyak agonist oleh karena kurangnya jumlah kalsium bebas yang terdapat di plasma.
Heparin
Heparin menghambat pembentukan dan aktivitas thrombin melalui ikatan dengan antitrombin III. Dapat dipakai untuk pemeriksaan trombosit, tetapi pada banyak pasien, jumlah trombosit PRP lebih rendah. Dpat dijumpai agregasi spontan
dengan adanya heparin, oleh karena itu heparin buka merupakan pilihan untuk pemeriksaan agregasi trombosit.
EDTA
Agregasi trombosit tergantung adanya kalsium bebas di plasma, EDTA tidak cocok untuk pemeriksaan agregasi.
PPACK
d-phenylalanine-proline-arginine chloromethyl ketone (PPACK), suatu
antitrombin, mulai dipakai untuk pemeriksaan inhibisi trombosit oleh antagonist Gp IIb/IIIa.
ACD
Antikoagulan ini menurunkan ph PRP 6,5; karena itu tidak sesuai untuk pemeriksan agregasi.
ACD-A
Mempertahankan pH PRP 7,3; dapat dipakai untuk pemeriksaan agregasi.
2.2.1.3.Tabung kaca vs plastic
Penyiapan trombosit untuk pemeriksaan agregasi harus dilakukan dengan memakai tabung plastic atau tabung kaca yang dilapisi silicon. Bila memakai tabung yang tidak dilapisi, akan terjadi aktivasi trombosit.
2.2.1.4.Koreksi Jumlah Trombosit
Ada berbagai pendapat mengenai perlunya standarisasi jumlah trombosit PRP. Respon agregasi dapat bervariasi berhubungan dengan jumlah trombosit.
2.2.1.5. Kontaminasi sel darah medah dan lipemia
Pemeriksaan agregasi trombosit berdasarkan transmisi optick adanya bahan kontaminan seperti sel darah merah atau lemak, dapat mempengaruhi kemampuan agregometer untuk mengukur agregasi trombosit. Sel darah meah yang lisis akan
melepaskan ADP, menyebabkan trombosit menjadi refrakter setelah penambahan ADP eksogen.
2.2.1.6.pH
Agregasi trombosit adalah pH sensitif. Ketika mempersiapkan bahan untuk pemeriksaan agregasi, pH harus dipertahankan antara 7,2 dan 8,0. Bila pH plasma dibawah 6,4 tidak terjadi agregasi; dan pada pH diatas 8,0 dapat terjadi agregasi spontan. Perubahan pH terjadi melaui difusi CO2 dari plasma; karena itu tabung PRP harus ditutup. Saline isotonic merupakan diluents pilihan utnuk agonist.
2.2.1.7.Temperatur
Pemeriksaan agregasi harus dilakukan pada suhu 37°C agar menyerupai suasana in vivo.
2.2.1.8.Kecepatan Putaran Agregometer
Supaya terjadi agregasi, trombosit harus kontak satu sama lain. Bila ditambahkan agonis pada trombosit yang tidak diputar, tidak akan terjadi agregasi. Kecepatan putaran optimal berdasarkan tinggi kolum PRP, diameter kuvet dan ukuran stir bar yang dipakai. Tiap pabrik memilki rekomendasi kecepatan putaran optimal masing-masing.
2.2.1.9. Waktu Pemeriksaan
Sebaiknya pemeriksaan agregasi trombosit dikerjakan dalam 3 jam setelah sampel diambil.
2.2.2.AGONIST19,36-39
2.2.2.1.ADP
Kadar 1-10 µM ADP sering dipakai pada pemeriksaan agregasi trombosit. Kadar ADP yang rendah (1-3 µM) menghasilkan kurva tunggal (monofasik) atau kurva bifasik. Pada kadar yang rendah, ikatan fibrinogen biasanya reversible dan
trombosit disagregasi. Kadar ADP yang lebih tinggi (10 atau 20 µM) dapat menutupi respon bifasik oleh pelepasan ADP endogen. Ini masih dianggap respon bifasik karena terjadi pelepasan ADP tetapi tidak tampak pada kurva. Aspirin akan menghambat respon agregasi ADP kadar rendah, karena hambatan jalur sikooksigenase dan pelepasan isi granul.19,36,39
2.2.2.2.Epinefrin
Biasanya dipakai epinefrin 5-10 µM untuk pemeriksaan agregasi. Dijumpai gelombang pertama yang kecil, kadang diikuti respon sekunder yang lebih besar. Gelombang kedua ini dihambat oleh aspirin, obat anti inflamasi non steroid, antihistamin, beberapa antibiotik.19,36,37
2.2.2.3.Kolagen
Biasanya dipakai kadar 1-5 µg/ml. Kolagen adalah agonist yang paling kuat. Agregasi trombosit yang diinduksi kolagen menunjukkan lag phase sekitar 1 menit, dimana pada saat itu trombosit berikatan pada fibril kolagen, mengalami perubahan bentuk dan reaksi pelepasan. Respon agregasi yang diukur adalah gelombang kedua setelah aktivasi dan pelepasan trombosit. Pada kadar kolagen yang rendah, respon agregasi trombosit dapat dihambat aspirin dan obat anti trombosit lain.19,37,38
2.2.2.4.Asam Arakidonat
Dengan siklooksigenase, asam arakidonat diubah menjadi tromboksan A2. Aspirin menghambat jalur siklooksigenase dan respon agregasi terhadap asam arakidonat. Pasien yang mengkonsumsi aspirin atau anti trombosit lain, penderita gangguan pelepasan atau Glanzman tromboastenia akan memberikan hasil abnormal agregasi trombosit yang diinduksi asam arakidonat. Pasien dengan SPD menunjukkan respon agregasi asam arakidonat yang normal 19,37
2.2.2.5.Ristocetin
Pada trombosit normal, antibiotic ristocetin dengan kadar 1,5 mg/ml, menyebabkan agregasi trombosit yang trgantung GpIb/VWF. Bila responnya abnormal, dicurigai penyakit von Willebrand atau sindroma Bernard Soulier (tidak ada kompleks GpIb-IX-V)19,37
2.2.2.6.Trombin
Trombin adalah agonist trombosit yang sangat poten. Peptida sintetik Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) menghambat polimerisasi fibrin yang diinduksi thrombin, sehingga dapat terjadi agregasi trombosit yang diinduksi thrombin. α-trombin dengan kadar 0,1-0,5 U/ml dapat dipakai untuk mengakivasi trombosit, baik yang washed atau gel-filtered.19,37,38
2.2.2.7. TRAP
Thrombin receptor activating peptide (TRAP) adalah peptide sintetik yang
berikatan dengan sekuens asam amino N-terminal dari “tethered ligand” yand dibentuk setelah hidrolisis thrombin protease activatedreceptor (PAR1). Penambahan TRAP 10 µM menyebabkan aktivasi respon trombin yang sangat kuat tanpa pemecahan fibrinogen dan pembentukan clot. Pada umumnya trombosit menunjukkan respon agregasi normal terhadap TRAP kecuali pada Glanzmann thromboasthenia. Sekarang ini TRAP dipakai untuk memonitor efek farmakodinamik anti trombosit baru yang menghambat ikatan fibrinogen dengan trombosit atau yang mengganggu reseptor PAR di trombosit.19,37,38
2.2.3. Obatan-obatan Yang Mempengaruhi Agregasi Trombosit19,36,41,42
2.2.3.1.Antibiotik
Antibiotik yang memiliki struktur gugus β-lactam seperti penisilin dan sefalosporin, dapat mempengaruhi fungsi trombosit. Mekanismenya diduga akibat perubahan membrane yang menghambat interaksi reseptor-agonist atau mempengaruhi influks kalsium.19,36
2.2.3.2.Dipyridamole
Dipyridamole adalah pyrimidopyrimidine yang menghambat uptake adenosine dalam trombosit, sel endotel dan eritrosit. Hambatan ini menyebabkan peningkatan lokal kadar adenosine yang menstimulasi adenilat siklase trombosit dan meningkatkan kadar cyclic 3`,5`-adenosine monophosphate (cAMP). Peningkatan cAMP mengurangi kemampuan agregasi trombosit.19,36,41
2.2.3.3.Fibrinolitik
Fibrinolisis dan pembentukan fibrin degradation product (FDP) berhubungan dengan agregasi trombosit. FDP bersaing dengan fibrinogen untuk berikatan dengan membrane trombosit dan mengganggu agregasi trombosit. Satu penelitian pada pasien yang mendapat tenecteplase dan alteplase menunjukkan inhibisi bermakna agregasi trombosit pada pemeriksaan agregasi. Penelitian lain yang membandingkan reteplase, alteplase dan streptokinase, dijumpai inhibisi agregsi trombosit pada ketiga kelompok. Pengurangan kadar fibrinogen plasma dan gangguan ikatan fibrinogen-Gp IIb/IIIa berkorelasi dengan beratnya defek agregasi trombosit.19,36,41
2.2.3.4.Dextran
Pemeberian dekstran intravena dapat menyebabkan menurunnya fungsi trombosit. Pada pasien penyakit arteri perifer, Dextran 40 mengurangi agregasi
trombosit spontan dan yang diinduksi agonist serta ekspresi marker aktivasi seperti P-selectin.19,36,42
2.2.3.5.Anestesi
Anestesi seperti lidokain, dibukain, kokain menyebabkan efek langsung pada membrane trombosit. Penambahan kokain pada trombosit in vitro menyebabkan berkurangnya ikatan fibrinogen dengan reseptor Gp IIb-IIIa.19
2.2.3.6.Inhibitor Trombin
Trombin sangat penting dalam patofisiologi sindroma koroner akut. Trombin memperantarai perubahan fibrinogen menjadi fibrin, mengaktivasi F.XIII yang membantu stabilisasi clot, dan agonis trombosit yang poten. Generasi terbaru inhibitor thrombin direk yang bekerja pada antitrombin III dapat menghambat clot-bound thrombin dan aktivasi trombosit oleh thrombin19,36,41
2.2.3.7.Thienopyridines
ADP berikatan dengan reseptornya P2Y1 dan p2Y12. Reseptor P2Y12 adalah reseptor primer ADP yang memperantarai ikatan fibrinogen dan respon agregasi. Thienopyridines, ticlopidine dan clopidogrel secara irreversible mengikat reseptor ini dan menghambat agregasi trombosit.19,36,41
2.2.3.8.Antagonis GpIIb-IIIa
Antagonis GpIIb-IIIa berikatan dengan reseptor GpIIb-IIIa (integrin αIIbβ3) dan mencegah ikatan fibrinogen atau VWF pada trombosit. Eptifibatide, abciximab dan tirofiban menghambat agregasi trombosit dengan semua agonis (ADP, kolagen, TRAP).19,36
2.2.4.Pengukuran
Agregasi trombosit dapat diukur dengan menimbulkan kontak antara plasma kaya trombosit dengan suatu zat penginduksi agregasi. Sebagian besar zat penginduksi ini seperti kolagen, epinefrin dan thrombin bekerja melalui efek ADP yang dibebaskan sendiri oleh trombosit. Penambahan ADP eksogen menyebabkan agregasi secara langsung. Agregasi dikuantifikasi dengan menentukan apakah plasma kaya trombosit yang keruh menjadi jernih karena trombosit yang semula membentuk suspensi merata membentuk agregat berupa gumpalan-gumpalan besar yang kurang memendarkan cahaya sehingga transmisi sinar melalui tabung lebih mudah. Agregometer adalah suatu spektrofotometer yang diadaptasi untuk mencatat perubahan dalam transmisi sinar sementara mempertahankan suhu yang konstan dan pengocokan perlahan terhadap suspense trombosit.38,39,40
Setelah diperoleh suatu kurva normal transmisi cahaya, trombosit yang diperiksa dipajankan ke berbagai zat dan berbagai kondisi. Aspirin, obat antiinflamasi yang lain, dan banyak obat dari golongan fenotiazin sangat menghambat kemampuan kolagen dan epinefrin menimbulkan agregasi, tetapi tidak mengganggu efek langsung ADP. Gangguan konstitusional fungsi trombosit berbeda satu sama lain dalam sifat bahan yang gagal memicu agregasi. Pasien yang dicurigai mengidap gangguan gangguan ini harus bebas dari semua obat selama paling tidak 1 minggu sebelum pemeriksaan.36,37,40
Dalam melakukan uji, pungsi vena harus mulus (nontraumatik). Jumlah trombosit yang digunakan untuk uji harus distandarisasi karena respon agregasi dipengaruhi oleh jumlah trombosit. Hal inilah yang menyebabkan pasien trombositopenia sulit dievaluasi. Pemeriksaan agregasi harus dilakukan dalam 3 jam setelah pengambilan sampel. Sampel jangan pernah dimasukkan ke lemari
pendingin karena hal ini menghambat fungsi trombosit; karena itu, uji dilakukan pada suhu 37°C. Antikoagulan yang digunakan adalah natrium sitrat, dan sampel jangan dimasukkan ke wadah kaca karena bahan ini akan mengaktifkan trombosit. Sampel yang mengalami hemolisis atau lipemik dapat mengganggu interpretasi densitas optis.
2.2.5.Interpretasi
Bahan-bahan penginduksi agregasi yang paling sering digunakan adalah ADP dengan berbagai konsentasi, kolagen, epinefrin, ristosetin, thrombin dan asam arakidonat.
ADP konsentrasi rendah memicu agregasi bifasik dengan gelombang primer dan sekunder. ADP konsentrasi tinggi memicu hanya satu gelombang agregasi. Pasien dengan gangguan pembebasan trombosit gagal memperlihatkan gelombang agregasi kedua. Pasien dengan tromboastenia Glanzmann tidak memperlihatkan agregasi trombosit pada pemberian ADP.
Agregasi dengan kolagen menghasilkan suatu periode laten yang diikuti oleh sebuah gelombang agregasi. Penurunan agregasi terhadap kolagen terjadi pada pasien yang mendapat aspirin dan obat anti-inflamasi.
Agregasi dengan epinefrin biasanya bersifat bifasik. Agregasi yang dipicu oleh epinefrin ini juga terganggu pada pasien yang mendapat aspirin dan obat anti-inflamasi. Demikian juga, agregasi thrombin bersifat bifasik dan mungkin terganggu pada defek trombosit intrinsic tertentu.
Walaupun defek kongenital fungsi trombosit jarang dijumpai, banyak penyakit didapat yang menekan mekanisme pembebasan trombosit. Aspirin jelas merupakan obat yang paling sering menjadi penyebab, tetapi hanya sedikit pasien yang mengalami perdarahan yang cukup serius sehingga diperlukan pemeriksaan
trombosit. Pasien dengan uremia, penyakit hati yang parah atau penyakit terkait alkohol tahap lanjut sering mengalami gangguan perdarahan kompleks yang mencakup disfungsi trombosit. Ketiga penyakit ini menekan efek kolagen, epinefrin atau ADP eksogen yang ditambahkan langsung pada pembebasan ADP. Gangguan gangguan mieloproliferatif dan disproteinemia dapat menimbulkan kelainan serupa.