DAFTAR PUSTAKA
II. TINJAUAN PUSTAKA
3.2 Alat dan Bahan Penelitian .1 Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain laminar air flow,
autoclave, oven, mikroskop, spektrofotometer, refrigerator, inkubator, alat pengocok, timbangan, cawan petri, pipet, jarum ose, erlenmeyer, gelas ukur, tabung reaksi, kertas saring, aluminium foil, karet gelang, spidol, plastik, polibag, dan pot.
3.2.2 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain contoh tanah dari lahan milik CV. Meori Agro untuk mendapatkan isolat bakteri pelarut fosfat dari tanah, isolat bakteri koleksi CV. Meori Agro (Tabel 1), media SPA ( Sucrose Potatoes Agar ) sebagai media biakan isolat bakteri koleksi, media Pikovskaya, media Nutrient Broth, aquades, larutan fisiologis, larutan PB dan PC, larutan standar 50 ppm P, alkohol, bibit tanaman sawi sendok berumur 2 minggu, dan pupuk kandang.
Tabel 1. Asal Isolat Bakteri Pelarut Fosfat Koleksi
Kode Bakteri Asal Isolat
Burkholderia sp. PS4 Rizosfer Tanaman Nilam
Pseudomonas aeruginosa P2 Rizosfer Tanaman Kacang Tanah
3.3Metode Penelitian
3.3.1 Pengambilan Contoh Tanah
Pengambilan contoh tanah dilakukan di sekitar rizosfer tanaman jagung (± 2 kg) dengan metode komposit yang kemudian tanah tersebut dikeringudarakan.
3.3.2 Isolasi dan Pemurnian Bakteri Pelarut Fosfat dari Tanah
Tahapan isolasi dilakukan dengan memasukkan 10 gram tanah ke dalam tabung erlenmeyer yang berisi 90 ml larutan fisiologis, dikocok (120 rpm) selama 30 menit pada suhu ruang yang kemudian dibuat seri pengenceran sampai 10-5. Sebanyak 1 ml dari seri pengenceran 10-3 , 10-4 dan 10-5 dituang di atas permukaan media Pikovskaya padat, kemudian disebar secara merata menggunakan batang penyebar dan diinkubasi selama 2-3 hari. Selanjutnya tahap pemurnian dilakukan dengan memurnikan antara koloni bakteri dengan koloni fungi yang tumbuh dengan menggoreskan koloni bakteri pada media Pikovskaya padat yang baru pada cawan petri dengan menggunakan metode gores. Isolat bakteri yang telah dimurnikan kemudian diinkubasi selama 3-4 hari.
3.3.3 Peremajaan Isolat Bakteri Pelarut Fosfat Koleksi
Ketiga isolat bakteri koleksi CV. Meori Agro digoreskan pada media SPA menggunakan jarum ose. Perlakuan tersebut dilakukan di dalam laminar air flow
agar tidak terjadi kontaminasi.
3.3.4 Pengujian Kualitatif Isolat Bakteri Pelarut Fosfat dari Tanah dan Isolat Bakteri Pelarut Fosfat Koleksi
Isolat bakteri pelarut fosfat koleksi yang telah diremajakan diuji kemampuannya dalam melarutkan fosfat. Pengujian pelarutan fosfat menggunakan media Pikovskaya. Bahan-bahan yang digunakan untuk membuat media Pikovskaya dicampur, dan diberi aquades sampai batas volume yang diinginkan kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 1210C tekanan 1 atm selama 15 menit. Setelah media dingin, kemudian dituangkan ke cawan petri dan ditunggu hingga membeku, perlakuan ini dilakukan di dalam laminar air flow. Isolat yang telah diremajakan diambil koloninya dengan menggunakan jarum ose
kemudian digoreskan pada media Pikovskaya. Pengamatan dilakukan sampai terbentuknya zona bening di sekitar bakteri yang menandakan terjadinya pelarutan fosfat. Isolat bakteri pelarut fosfat dari tanah yang telah diinkubasi 3-4 hari diamati pertumbuhannya. Uji kualitatif dilakukan dengan cara menghitung besarnya zona bening yang terbentuk dengan menggunakan Indeks Pelarutan (IP) (Gambar 1).
IP =
A BGambar 1. Indeks Pelarutan Fosfat Keterangan :
A = diameter zona bening B = diameter koloni bakteri
Koloni-koloni bakteri pelarut fosfat yang diinginkan selanjutnya dimurnikan dengan metode gores pada cawan petri dan disimpan di dalam medium agar miring Pikovskaya. Kemampuan mikrob melarutkan fosfat dijadikan dasar untuk pemilihan mikrob unggul. Mikrob pelarut fosfat yang paling unggul digunakan untuk pengujian selanjutnya.
3.3.5 Pengujian Kuantitatif Isolat Bakteri Pelarut Fosfat dari Tanah dan Isolat Bakteri Pelarut Fosfat Koleksi
Pengujian kuantitatif dilakukan menggunakan media Pikovskaya cair. Isolat koleksi yang telah diremajakan serta isolat bakteri tanah diambil koloninya sebanyak 1 ml kemudian ditumbuhkan pada media Pikovskaya cair dan diinkubasi selama 5 hari. Kultur diinkubasi dengan pengocokan 100 rpm secara periodik. Setelah masa inkubasi, isolat bakteri yang telah tumbuh diambil koloninya kemudian disentrifugasi 1048 x g selama 20 menit. Supernatan yang
diperoleh lalu ditambahkan 5 ml larutan PB dan 5 tetes larutan PC. Selain itu juga mempersiapkan larutan standar 50 ppm P (0 ppm – 10 ppm) dan ditambahkan pula 5 ml larutan PB dan 5 tetes larutan PC kemudian diukur dengan menggunakan spektrofotometer. Supernatan yang dihasilkan dari hasil sentrifus diukur pelarutan fosfatnya dengan menggunakan spektrofotometer dan dibandingkan dengan kontrol. Masing-masing perlakuan dilakukan dengan ulangan sebanyak tiga kali.
3.3.6 Metode Pengukuran P dalam Larutan
Supernatan yang dihasilkan diencerkan hingga 50 kali kemudian dianalisis P terlarut dengan menggunakan metode Bray-1. Analisis yang digunakan menggunakan larutan standar 50 ppm dengan seri pengenceran 0-10 ppm P. Larutan ini dibuat dari larutan baku yang mempunyai konsentrasi lebih tinggi kemudian diencerkan dengan larutan Bray-1. Sebanyak 5 ml larutan PB dan 5 tetes larutan PC ditambahkan ke dalam 5 ml supernatan. Jumlah P larut diidentifikasi melalui intensitas warna biru dari larutan dengan metode kolorimetri (fosfomolibdat). Intensitas warna biru dari larutan dibaca pada gelombang 660 nm dengan spektrofotometer (Sulaeman et al., 2005).
3.3.7 Uji Antagonis Isolat Bakteri Pelarut Fosfat dari Tanah dan Isolat Bakteri Pelarut Fosfat Koleksi jika dikombinasikan secara in vitro Bakteri-bakteri yang digunakan untuk uji antagonis yaitu isolat koleksi CV. Meori Agro (Burkholderia sp. PS4, Pseudomonas aeruginosa P2, Bacillus subtilis
J2) dan isolat bakteri pelarut fosfat dari tanah (IS9). Satu koloni bakteri yang tumbuh terpisah pada media SPA di cawan petri diambil dengan menggunakan jarum ose dan digoreskan pada media SPA yang telah disiapkan. Pengujian antagonis empat isolat bakteri dilakukan dengan metode uji berpasangan pada media SPA (Gambar 2, 3 dan 4). Pengamatan dilakukan setiap hari dengan cara mengamati pertumbuhan empat bakteri secara bersama-sama. Masing-masing perlakuan dilakukan dengan ulangan sebanyak tiga kali.
Gambar 2. Metode Uji Antagonistik Dua Isolat Bakteri
Gambar 3. Metode Uji Antagonistik Tiga Isolat Bakteri Isolat Bakteri 2 Petridisk Isolat Bakteri 1 Isolat Bakteri 2 Isolat Bakteri 1 Isolat Bakteri 3 Petridisk
Gambar 4. Metode Uji Antagonistik Empat Isolat Bakteri
3.3.8 Pengaruh Bakteri Pelarut Fosfat serta Kombinasinya pada Pertumbuhan Sawi Sendok
1. Persiapan Inokulan
Isolat koleksi maupun isolat asal tanah yang terpilih masing-masing dipindahkan ke dalam 100 ml media Nutrient Broth dengan menggunakan jarum ose untuk dibiakan di atas mesin pengocok selama 3 hari. Pada hari ketiga diukur nilai rapat optis suspensi tersebut dengan menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 660 nm untuk memperoleh jumlah sel per milimeter suspensi. Penentuan populasi sel ini dilakukan dengan memasukkan nilai rapat optis pada persamaan kurva baku masing-masing bakteri. Kurva baku ini digunakan untuk menghitung jumlah sel isolat yang akan diinokulasikan.
2. Penanaman dan Perlakuan Bibit Tanaman Sawi Sendok
Benih sawi sendok ditumbuhkan pada media tanah dan menggunakan pupuk kandang (5 g /polibag) hingga berumur dua minggu di persemaian. Kemudian bibit tanaman sawi sendok dipindahkan ke polibag dan diberi perlakuan bakteri dengan kepadatan bakteri 108 sel/ml dengan cara menuangkan suspensi pada permukaan tanah, lalu diletakkan di dalam rumah kaca dan diamati pertumbuhannya. Penyiraman dilakukan setiap hari dengan mempertahankan
Isolat Bakteri 3 Petridisk
Isolat Bakteri 1 Isolat Bakteri 2
kadar air tanah pada keadaan 80% kapasitas lapang. Pertumbuhan tanaman sawi sendok di rumah kaca diamati selama lima minggu. Kombinasi perlakuan bakteri dengan pupuk SP-36 dapat dilihat di Tabel Lampiran 21.
3. Pengamatan Pertumbuhan Tanaman Sawi Sendok di Rumah Kaca
Setelah tanaman sawi sendok mencapai masa akhir vegetatif (5 minggu setelah tanam), tanaman diambil untuk pengamatan tinggi tanaman, lebar daun, jumlah daun, biomassa segar dan kering serta kandungan P di dalam jaringan tanaman.
3.4 Rancangan Penelitian
Rancangan yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap dengan dua faktor perlakuan, yaitu :
1. Pemberian isolat bakteri pelarut fosfat, terdiri dari 16 taraf, yaitu isolat bakteri kode IS9, J2, P2, PS4, J2+IS9, J2+PS4, P2+IS9, P2+J2, P2+PS4, PS4+IS9, J2+PS4+IS9, P2+J2+IS9, P2+J2+PS4, P2+PS4+IS9, P2+J2+PS4+IS9, dan kontrol (tanpa isolat bakteri pelarut fosfat).
Keterangan : IS9 (Burkholderia sp.), P2 (Pseudomonas aeruginosa), J2 (Bacillussubtilis), dan PS4 (Burkholderia sp.).
2. Pemberian dosis pupuk SP-36, terdiri dari 3 taraf, 50% dosis pupuk SP-36 (0,059 g/polibag), 75% dosis pupuk SP-36 (0,089 g/polibag), dan 100% dosis pupuk SP-36 (0,118 g/polibag).
Percobaan diulang sebanyak 3 kali, sehingga diperoleh 16 x 3 x 3 = 144 satuan percobaan.
Menurut Gaspersz (1991) model statistika untuk percobaan dengan menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) faktorial adalah sebagai berikut :
Yijk = µ + αi + βj + (αβ)ij + E(ij)k
Di mana : µ : Rata-rata (nilai tengah) respon
βj : Efek dari pengaruh faktor perlakuan pada taraf ke-j
(αβ)ij : Pengaruh interaksi antara faktor perlakuan ke-i dan faktor perlakuan ke-j
Eij : Pengaruh komponen galat atau error dari faktor perlakuan ke-i dan faktor perlakuan ke-j pada ulangan ke-k
Yijk : Respon terhadap perlakuan faktor ke-i dan faktor ke-j pada ulangan ke-k
Data diolah dengan menggunakan analisis sidik ragam, apabila hasil uji F hitung lebih besar dari F tabel, maka analisis dapat dilanjutkan dengan menggunakan uji beda nyata Duncan.
Gambar 1. Diagram Alir Pembiakan Bakteri Pelarut Fosfat serta Aplikasinya ke Isolasi Isolat BPF Tanah
Pelarut Fosfat
Pemurnian Isolat BPF Tanah
Pengujian Bakteri Pelarut Fosfat dalam Melarutkan P Penyimpanan Isolat BPF
Tanah
Uji Kualitatif Uji Kuantitatif Peremajaan Tiga Isolat BPF
Koleksi Pengambilan Sampel Tanah
Uji Antagonis
Pemindahan Isolat Terpilih ke Media NB Pemindahan Isolat
Terpilih ke Media NB Pupuk Kandang dan Pupuk SP-36
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Analisis Tanah
Hasil analisis sifat-sifat kimia dan fisik tanah awal (Inceptisol) disajikan pada Tabel 2 dan kriteria penilaian analisis sifat kimia tanah (PPT 1983) yang digunakan disajikan pada Tabel Lampiran 1.
Tabel 2. Sifat Inceptisol yang digunakan sebagai media
Jenis Analisis Metode/ Alat Analisis
pH H2O pH-meter 5,2
pH KCl 1 M pH-meter 4,77
C-organik (%) Walkey & Black 1,27
N-total (%) Kjeldahl 1,75
C/N ratio - 0,72
P tersedia (ppm) Bray I 5,17
Ca-dd (cmol(+)/kg) Perkolasi dengan amonium asetat 1 M (pH 7) 8,51 Mg-dd (cmol(+)/kg) Perkolasi dengan amonium asetat 1 M (pH 7) 2,43 K-dd (cmol(+)/kg) Perkolasi dengan amonium asetat 1 M (pH 7) 0,19 Na-dd (cmol(+)/kg) Perkolasi dengan amonium asetat 1 M (pH 7) -
Fe (%) AAS 1,18
P total (%) Spektrofotometer 0,08
Berdasarkan Tabel 2, Inceptisol menunjukkan reaksi masam dengan nilai pH yaitu sebesar 5,2 serta memiliki kandungan C-organik yang tergolong rendah yaitu sebesar 1,27 %. Menurut Sanchez (1992), hal ini diduga karena tanah-tanah tersebut telah mengalami pencucian dan pelapukan lanjut serta
berada pada daerah dengan curah hujan dan suhu yang relatif tinggi sehingga lapisan yang kaya bahan organik hilang tererosi.
Kandungan N-total pada tanah ini tergolong sangat tinggi, hal ini diduga karena terjadinya mineralisasi unsur N yang tinggi. Kandungan P-tersedia pada tanah ini sangat rendah diduga karena pH tanahnya rendah. Pada tanah masam, P difiksasi oleh Al dan Fe membentuk senyawa Al-P dan Fe-P yang tidak larut. Semakin rendah pH maka semakin tinggi jumlah konsentrasi ion Al, Fe, dan Mn yang dapat larut. Akibatnya semakin tinggi jumlah P yang diikat oleh Al dan Fe.
Nilai kandungan K dan Na pada tanah ini rendah karena adanya pencucian basa-basa yang relatif tinggi akibat adanya curah hujan yang tinggi. Nilai kandungan Ca tergolong sedang, sedangkan nilai kandungan Mg tergolong tinggi.
4.2 Isolasi Bakteri Pelarut Fosfat dan Uji Kemampuan Pelarutan Fosfat