Amplifikasi gen GDF9 pada ruas promotor (5’flanking region) dilakukan dengan mesin TaKaRa Thermal Cycler menggunakan primer AF 211 forward CCTCAGTCTTCTCCTCGGTTCC dan AF 212 reverse CTGGAAGTGG GAGAAGTGG yang mengacu pada Dong et al. (2005). Amplifikasi gen GDF9 menghasilkan ruas DNA dengan panjang 1972 pb berdasarkan penempelan primer pada sekuen DNA Capra hircus dengan kode accession number EF446168.
Reaksi PCR dilakukan dalam volume 12 µl, yang terdiri atas sampel DNA sekitar 10 ng, primer forward dan reverse masing-masing 1 ng, dan KAPA Taq Ready Mix DNA polymerase (KAPATaq DNA polymerase 1 unit, bufer polimerase dengan Mg2+.25 mM dan setiap dNTP masing-masing 0,4 mM). Kondisi PCR, yaitu predenaturasi 940C selama 5 menit, (denaturasi 940C selama 60 detik, penempelan primer 58 0C selama 90 detik, pemanjangan 720C 90 detik) sebanyak 30 siklus, pemanjangan akhir pada suhu 720 C selama 10 menit, dan penyimpanan dilakukan pada suhu 40C. Amplikon dideteksi dengan
elektroforesis gel poliakrilamida 6% yang dilanjutkan dengan pewarnaan perak (Byun et al. 2009).
Perunutan DNA
Untuk mengetahui posisi dan jenis nukleotida yang mengalami mutasi maka dilakukan perunutan DNA (sekuensing). Beberapa amplikon gen GDF9 pada setiap sub populasi dicampur menjadi satu berdasarkan sifat prolifikasi induk kambing. Campuran amplikon selanjutnya disekuensing menggunakan primer yang sama dengan amplifikasi awal. Teknik ini dilakukan untuk memindai adanya mutasi dengan lebih cepat. Hal ini dilakukan atas dasar laju mutasinya sangat rendah.
Analisis Data
Runutan nukleotida yang diperoleh kemudian diedit secara manual dengan bantuan program Bio Edit versi 6.0.7. Urutan DNA yang telah diedit disejajarkan dengan beberapa runutan DNA dari kelompok Capra hircus yang
dipublikasikan dalam GenBank
menggunakan Clustal W versi 8.1 yang ada dalam program MEGA 4 (Tamura et al. 2007) yang kemudian diedit lagi secara manual. Analisis yang dilakukan meliputi penghitungan komposisi nukleotida, laju mutasi delesi dan substitusi. Proses menentukan struktur gen yang diperoleh untuk mencari situs yang homolog dengan program BLASTN versi 2.2.25 dan dianalisis dengan menggunakan program MEGA versi 4.
Hasil dan Pembahasan
Amplifikasi gen GDF9 menggunakan primer AF 211 dan AF 212 menghasilkan fragmen DNA dengan panjang 1296 pb. Mutasi pada gen GDF9 dapat meningkatkan laju tingkat ovulasi dan litter size. Ruminansia kecil dengan genotip heterozigot carier akan meningkatkan laju ovulasinya rata-rata 1.5 dengan rata-rata litter size 1.0. Sedangkan genotip homozigot carrier akan meningkatkan laju ovulasi rata-rata 3.0 dengan rataan litter size 1.5 (Davis 2005). Jika hasil amplikon gen GDF9 sudah dipotong dengan enzim masih meragukan, dapat diverifikasi dengan metode sekuensing.
Hasil sekuensing pada gen GDF9 menunjukkan adanya polimorfisme satu pasang basa nukleotida berupa mutasi substitusi G – A pada posisi basa nukleotida ke 836 pada Kambing Kacang dan PE, serta mutasi substitusi G – C pada Kambing Kacang di situs ke 1019 (Gambar 18).
Gambar 18 Mutasi nukleotida gen GDF9 ruas promotor pada kelompok induk prolifik (mutan) dan induk non-prolifik (wild) pada Kambing Kacang dan Peranakan Etawah (Tiga baris pertama dibaca secara vertikal merupakan posisi nukleotida).
1nt 1260nt 2170 nt 4258 nt Exon 1 Exon 2 5515 nt Nt 863 (G-A) Nt 1019 (G-C) Intron 3294 nt Promotor 3’UTR 5’UTR 23nt wild wild 1111111111 8888888888 0000000000 6666666667 1111111112 1234567890 1234567890 KACANG-tunggal(08-K1) CAGAGGCAAG ATGAATGAGC KACANG-kembar(07-K2) ..A... ...C. PE-tunggal(04-PE1) ... ... PE-kembar(15-PE3) ..A... ... MUARA-tunggal(06-R1) ... ... MUARA-kembar(05-R2) ... ... SAMOSIR-tunggal(14-S1) ... ... SAMOSIR-kembar(12-S2) ... ... mutan mutan
Keragaman gen GDF9 dengan sifat prolifik pada kambing bervariasi dan dipengaruhi oleh rumpun ternak dan posisi ruas DNA yang diidentifikasi. GDF9 ruas ekson 1 dan ekson 2 pada Kambing Black Bengal yang dikenal prolifik adalah monomorfik, tetapi pada Kambing Jining Grey dilaporkan polimorfik (Feng et al. 2010).
Hasil penelitian ini hampir sama dengan penelitian Polley et al. (2009). Adanya alel-alel mutasi nukleotida gen GDF9 di ruas promotor pada Kambing Kacang dan PE dapat menambah temuan identifikasi keragaman gen GDF9 untuk keperluan seleksi calon induk yang prolifik pada ternak domba dan kambing, seperti yang tertera pada Tabel 18.
Tabel 17 Jenis-jenis mutan gen GDF9 pada ternak domba dan kambing
Mutasi DNA
Ekson Mutasi asam amino Jenis ternak Referensi G 260 A 2 Arginin-Histidin Domba Hanrahan et al. 2004 G 471 T Tidak ada mutasi Domba Hanrahan et al. 2004 G 477 A Tidak ada mutasi Domba Hanrahan et al. 2004 G 721 A Glutamin-Lys Domba Hanrahan et al. 2004 G 978 G Tidak ada mutasi Domba Hanrahan et al. 2004 G 994 A Val - Ile Domba Hanrahan et al. 2004 G 1111 A Val - Met Domba Hanrahan et al. 2004 G 1184 T Ser - Phe Domba Hanrahan et al. 2004 A 562 C 2 Glutamin-Prolin Kambing Qianbei
pockmarked
Ren et al. 2010 G 26 A 1 Tidak ada mutasi Kambing Jining Grey Wu et al. 2010 G 792 A 2 Valine - Isoleusine Kambing Jining Grey Wu et al. 2010 A 183 C 1 Tidak ada mutasi Kambing Jining Grey Chu et al. 2011 C 336 T 2 Valine - Isoleusine Kambing Jining Grey Chu et al. 2011 Kambing Jining Grey Feng et al. 2011
Runutan nukleotida gen GDF9 bersifat polimorfik dan diduga berhubungan dengan pengaturan sifat prolifikasi pada Kambing White goat (Xu- qin et al. 2009), Jining Grey (Feng et al. 2010), sementara gen ini juga bersifat monomorfik pada Kambing Black Bengal (Polley et al. 2009), Boer dan Huanghuai Goats (He 2010). Fenomena tersebut juga dijumpai pada penelitian ini, yaitu fenomena keragaman mutasi gen GDF9 di ruas promotor pada keempat sub populasi kambing lokal yang diamati bervariasi. Berdasarkan hasil penelitian tersebut dapat ditarik kesimpulan bahwa ada atau tidaknya polimorfisme nukleotida gen-gen fekunditas pada kambing masih sangat bervariasi antar rumpun-rumpun kambing dan hubungan gen tersebut dengan pengaturan tingkat prolifikasi pada induk kambing. Temuan alel-alel mutasi gen ini diduga dapat
digunakan sebagai salah satu parameter atau metode dalam upaya seleksi calon induk bibit kambing yang prolifik untuk meningkatkan produktivitas dan efisiensi pemeliharaan ternak kambing.
Berdasarkan kejadian mutasi yang bersifat parsimony runutan nukleotida gen GDF9 ruas promotor (Lampiran 7) menunjukkan bahwa kambing lokal Indonesia berada dalam satu klaster dan lebih dekat dengan Kambing Jining grey dari Cina (Gambar 19).
Gambar 19 Dendogram kambing lokal Indonesia berdasarkan runutan nukleotida ruas promotor gen GDF9 metode NJ bootstrap 1000x
Simpulan
Mutasi gen GDF9 ruas promotor bersifat polimorfik yang mengekpresikan adanya hubungan mutasi gen GDF9 dengan sifat prolifik pada Kambing Kacang dan PE. Keragaman gen GDF9 pada induk Kambing Muara dan Samosir bersifat monomorfik. KACANG-tunggal KACANG-kembar C.hircus PE-kembar MUARA-tunggal MUARA-kembar PE-tunggal SAMOSIR-tunggal SAMOSIR-kembar 100 91 62 60 29 26 0.01
