METODE PENELITIAN
3.5. Analisa Data
Analisa data dilakukan dengan menggunakan perhitungan statistik komputerisasi program SPSS 17 for windows. Gambaran karakteristik kelompok SM dan Obesitas disajikan dalam bentuk tabulasi dan dideskripsikan. Kemaknaan perbedaan konsentrasi hs-CRP diantara kelompok SM dengan Obesitas dilakukan uji independent sample t test.
Untuk melihat korelasi komponen sindrom metabolik dengan hs-CRP dipakai uji korelasi Pearson. Untuk melihat hubungan komponen sindrom metabolik dengan hs-CRP digunakan uji korelasi pearson. 4
3.6. Bahan dan Cara Kerja 3.6.1. Bahan yang diperlukan
Bahan yang diperlukan pada penelitian ini adalah darah EDTA dan darah tanpa antikoagulan.
3.6.2. Anamnese dan Pemeriksaan Fisik
Anamnesa dilakukan pada kedua kelompok yang akan diteliti dengan cara wawancara berpedoman pada daftar pertanyaan dan keterangan yang ada pada status. Pemeriksaan fisik dilakukan pada kedua kelompok yang diteliti. Pengukuran tekanan darah diukur dengan alat
sphygmomanometer (nova), dimana pasien dibaringkan selama 5 menit kemudian dipasang manset pada lengan kanan dan dilakukan pengukuran sebanyak 2 kali dan diambil nilai reratanya. Seluruh data dan hasil pemeriksaan dicatat dalam status khusus penelitian.
3.6.3. Pengukuran Antropometrik
Pengukuran berat badan (kg) dilakukan dengan menggunakan timbangan berat badan merk Camry, dimana pasien berpakaian minimal tanpa memakai alas kaki. Pengukuran tinggi badan (m) dilakukan dengan memakai alat pengukur tinggi badan Microtoise dengan kapasitas ukur 2 meter dengan ketelitian 0,1 cm. Subjek dalam posisi berdiri tegak tanpa memakai alas kaki dan topi.
Lingkar pinggang diukur ( tanpa ada penghalang seperti tali pinggang, korset) dalam keadaan akhir ekspirasi dengan posisi berdiri tegak tanpa alas kaki dengan jarak kedua tungkai 25-30 cm. Pengukuran dilakukan melingkar secara horizontal dari titik tengah antara puncak krista iliaca dan tepi bawah kosta terakhir pada garis axilaris medialis. Hasil pengukuran dinyatakan dengan sentimeter.
3.6.4. Pengambilan dan Pengolahan Sampel
Subjek yang akan diambil darahnya telah berpuasa (tidak makan dan minum) selama 10 - 12 jam. Sampel darah diambil melalui vena punksi dari vena mediana cubiti tanpa stasis vena yang berlebihan. Tempat vena punksi terlebih dahulu dibersihkan dengan alkohol 70% dan dibiarkan kering. Darah diambil dengan menggunakan venoject sebanyak
5cc darah, kemudian dimasukkan 2cc ke dalam tabung plastik EDTA untuk pemeriksaan darah lengkap dan 3cc ke dalam tabung plastik tanpa antikoagulan.
Untuk pemeriksaan darah lengkap segera diperiksa dengan memakai alat Sysmex XT 2000i. Sampel darah beku setelah dibiarkan membeku selama 20 menit pada suhu ruangan, dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 20 menit, serum dipisahkan dan dimasukkan ke dalam tabung plastik (microtube) masing-masing 1 ml. Tabung microtube pertama untuk pengukuran kadar hs-CRP disimpan dalam freezer -38º C sampai waktu pemeriksaan yang telah ditentukan (maksimum 6 bulan)2. Tabung aliquot kedua untuk pemeriksaan KGDP, HDL-C, TG, SGOT, SGPT.
3.6.5. Pemeriksaan laboratorium
Untuk pengukuran KGDP, TG, HDL-C, SGOT, SGPT, dilakukan segera setelah sampel terkumpul. Sedangkan untuk pengukuran kadar hs-CRP dilakukan serentak setelah sejumlah sampel terkumpul.
3.6.5.1. Pemeriksaan darah lengkap
Untuk mengukur jumlah leukosit subjek dipakai alat Sysmex XT 2000i, dengan metode flowcitometri.
3.6.5.2. Pemeriksaan KGDP
Menggunakan alat Cobas C 501 Analyzer , dengan metode enzimatik kolorimetrik berdasarkan reaksi:
D-Glukosa-6-pospat + NADP+ G6PDH D-6-Phosphoglukonat + NADPH + H+
Konsentrasi NADPH yang dibentuk secara langsung menjadi konsentrasi glukosa, absorbsinya diukur pada panjang gelombang 340 nm.
3.6.5.3. Pemeriksaan Trigliserida
Menggunakan alat Cobas C 501 Analyzer dengan metode enzimatik kolorimetrik, dengan reaksi :
Trigliserida lipoprotein lipase Gliserol + Asam lemak Gliserol + ATP Gliserolkinase Gliserol-3-pospat + ADP
Gliserol-3-pospat + O2 Gliserol pospat oxidase Dihidroksiaseton pospat + H2O2
2H2O2 + 4-aminophenazon + 4-kloropenol Peroxidase quinoneimine dye + 4H2O
Absorbsi warna merah quinoneimine dye diukur pada panjang gelombang 512 nm.
3.6.5.4. Pemeriksaan HDL-C
Menggunakan alat Cobas C 501 Analyzer dengan metode enzimatik kolorimetrik, dengan reaksi :
HDL-C ester + H2O detergent cholesterol esterase kolesterol + Asam lemak bebas
HDL-C + O2Cholesterol oxidase ∆4-cholestenone + H2O2
2H2O2 + 4-aminoantipyrine + HSDA + H+ + H2O Peroxidase Purple blue pigment + 5H2O Absorbsi warna Purple blue diukur pada panjang gelombang 583 nm.
3.6.5.5. Pemeriksaan SGOT
Menggunakan alat Cobas C 501 Analyzer dengan metode enzimatik kolorimetrik, dengan reaksi :
L-aspartate + 2-oxoglutarae aspartate aminotransferase oksaloasetat+ L-glutamat
Laju oksidasi NADH secara langsung merupakan proporsi aktivitas aspartat aminotransferase yang absorbsinya diukur pada panjang gelombang 340 nm
3.6.5.6. Pemeriksaan SGPT
Menggunakan alat Cobas C501 Analyzer dengan metode enzimatik kolorimetrik, dengan reaksi :
L-alanine + 2-oxoglutarate alanin aminotransferase pyruvat + L-glutamat
Pyruvat + NADH + H+ lactate dehydrogenase L-laktat + NAD+
Laju oksidasi NADH secara langsung merupakan proporsi aktivitas alanin aminotransferase, absorbsinya diukur pada panjang gelombang 340 nm.
3.6.5.7. Pemeriksaan hs-CRP
Prinsip pemeriksaan: particle-enhanced immuno turbidimetric assay.
CRP pasien akan beraglutinasi dengan partikel latex yang dilapisi dengan antibodi monoklonal. Presipitasinya diukur secara turbidimetri.
Reagent-working solutions:
R1: TRIS (tris hydroxymethyl-aminomethane) buffer dengan serum bovine albumin dan imunoglobulin (tikus); bahan pengawet; stabilizers
R2: Partikel latex yang dilapisi dengan anti-CRP (tikus) dalam buffer glycine ; bahan pengawet; stabilizers
Penyimpanan dan stabilitas:
CRPHS dan diluent NaCl 9% disimpan pada temperatur 2-80C, stabil hingga sampai batasan waktu di pack label.
Sampel: Serum dan plasma (Li-heparin dan K2-EDTA)
Kalibrator: Kalibrasi menggunakan larutan Calibrator for Automated System (c.f.a.s) protein Cat. No. 11355279 216 kode 656.
Kontrol: Larutan kontrol menggunakan Precinorm protein (3x1mL) Cat. No. 10557897 122 kode 302.29
Cara kerja: Sampel yang beku dicairkan pada suhu ruang, kemudian disamaratakan dengan vortex. Larutan kontrol juga disamakan dengan suhu ruang (20-25̊ C). Sampel ditambah dengan Reagen R1( buffer) kemudian ditambah R2 ( latex Antibodi Anti CRP ).Reaksi dimana antibody anti CRP yang berikatan dengan micropartikel latex akan bereaksi dengan antigen dalam sampel untuk membentuk kompleks Ag-Ab. Presipitasi dari kompleks Ag-Ab ini diukur secara turbidimetrik.
Batasan pengukuran: 0,15-20,0 mg/L. Pada sampel dengan kadar yang tinggi, dilakukan pengenceran secara otomatis dengan perbandingan 1:15. Hasilnya kemudian secara otomatis dikalikan dengan 15.