E. Waktu dan Tempat Penelitian
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
5. Analisis Histologi Jaringan Pankreas
Analisis histologi pankreas dilakukan dengan pewarnaan hematoksilin- eosin (HE) dan pewarnaan imunohistokimia terhadap sel pankreas penghasil insulin. Pewarnaan HE terhadap preparat memungkinkan pulau
Langerhans untuk dibedakan dengan sel-sel pankreas lainnya, sedangkan pewarnaan imunohistokimia terhadap insulin secara spesifik dapat menunjukkan sel-sel pankreas.
Pengamatan yang dilakukan terhadap preparat yang diberi pewarnaan HE adalah jumlah pulau Langerhans per lapang pandang dan pengukuran luasan pulau Langerhans. Pengamatan yang dilakukan terhadap preparat yang diwarnai imunohistokimia terhadap insulin adalah jumlah sel pankreas.
a. Pengamatan terhadap jaringan pankreas tikus 30 hari
Jumlah pulau Langerhans (PL) per lapang pandang pada jaringan pankreas tikus 30 hari dengan pembesaran 100x untuk masing-masing kelompok tersaji dalam Tabel 8. Terlihat bahwa pada tikus 30 hari, jumlah PL tertinggi hingga terendah secara berurutan adalah kelompok 128 mg, obat, 32 mg, kontrol negatif, 16 mg, 64 mg, 8 mg dan kontrol positif. Hasil perhitungan jumlah PL per lapang pandang 30 hari secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 19. Fotomikrograf pulau Langerhans tikus 30 hari hasil pewarnaan HE pada perbesaran 100x dapat dilihat pada Gambar 12.
Jumlah PL per lapang pandang kelompok kontrol positif paling rendah karena memang tikus-tikus kelompok tersebut masih mengalami diabetes melitus hingga akhir perlakuan. Injeksi alloxan pada awal perlakuan telah merusak sel-sel pada pankreas dan mereduksi jumlah dan ukuran PL-nya. Kondisi tersebut tidak berubah hingga akhir masa perlakuan karena tikus kelompok kontrol positif tidak diberi perlakuan ekstrak daun X maupun obat untuk menangani diabetes melitusnya.
Hasil uji statistik terhadap jumlah PL per lapang pandang pada tikus 30 hari (Lampiran 20) menunjukkan bahwa baik perlakuan ekstrak daun X maupun obat memberi pengaruh yang nyata terhadap jumlah PL per lapang pandang pada masing-masing kelompok (p < 0.05). Jumlah PL per lapang pandang kelompok 32 mg dan obat tidak berbeda nyata dengan kontrol negatif dan jumlah PL semua kelompok perlakuan
berbeda nyata dengan kontrol positif. Jumlah PL per lapang pandang kelompok perlakuan daun X (8 mg, 16 mg, 32 mg, 64 mg dan 128 mg) dan kelompok perlakuan obat lebih tinggi daripada jumlah PL kontrol positif. Hal ini menunjukkan bahwa pemberian ekstrak daun X ataupun obat selama perlakuan, dapat memicu proses penyembuhan terhadap diabetes melitus yang ditandai dengan peningkatan jumlah PL.
Perubahan jumlah PL pada penderita diabetes melitus dapat dimungkinkan terjadi secara kualitatif maupun kuantitatif, yang mencakup atropi, hipertropi, maupun degranulasi pada sel-sel pulau Langerhans (kualitatif) dan perubahan jumlah dan komposisi sel-sel pulau Langerhans (kuantitatif), terutama pada penderita diabetes melitus tipe 1 (Gepts, 1981).
Tabel 8. Jumlah*, luasan** pulau Langerhans dan jumlah sel β*** tikus 30 hari Kelompok Jumlah Pulau Langerhans (buah) Luasan Pulau Langerhans (μm2) Jumlah Sel β (buah) K(-) 4.05 ± 1.1c 12823.28 ± 4035.8c 64.20 ± 18.2c K(+) 1.10 ± 0.8a 8214.54 ± 3164.5ab 7.80 ± 3.3a A 2.60 ± 1.8b 10898.23 ± 3861.3c 26.80 ± 10.4b B 3.05 ± 1.7b 9301.25 ± 2104.8b 16.60 ± 13.0ab C 4.05 ± 1.6c 9510.70 ± 3415.8b 12.60 ± 3.4a D 2.85 ± 1.4b 9488.67 ± 3547.9b 9.60 ± 4.5a E 5.05 ± 1.7d 6085.85 ± 3686.4a 11.00 ± 4.0a F 4.35 ± 0.9cd 5417.94 ± 3835.7a 13.80 ± 5.7a Keterangan : huruf yang sama pada setiap nilai menunjukkan tidak
adanya perbedaan yang nyata (p > 0.05) *
Jumlah : Jumlah pulau Langerhans per lapang pandang dengan perbesaran 100x
**
Luasan : Luasan pulau Langerhans per lapang pandang dengan perbesaran 400x
***
Sel : Jumlah Sel per lapang pandang dengan perbesaran 100x
Keterangan : K(-) : kontrol negatif, K(+) : kontrol positif, A, B, C, D, E (8, 16, 32, 64, 128 mg ekstrak daun X/ekor/hari), F (obat)
PL = Pulau Langerhans ; 50 μm
Gambar 12. Fotomikrograf pulau Langerhans tikus 30 hari hasil pewarnaan hematoksilin-eosin pada perbesaran 100x
K(-) K(+) A B C D E F PL PL PL PL PL PL PL PL 50 μm 50 μm 50 μm 50 μm 50 μm 50 μm 50 μm 50 μm
Parameter kuantitatif lainnya yang dapat diamati dari pulau Langerhans (PL) adalah luasnya. Perbaikan ukuran dari pulau Langerhans dapat mengindikasikan adanya penyembuhan terhadap diabetes melitus selama masa perlakuan yang diintervensi oleh pemberian ekstrak daun X maupun obat diabetes melitus.
Pengamatan terhadap luasan PL per lapang pandang pada jaringan pankreas tikus 30 hari pada perbesaran 400x menunjukan bahwa kelompok kontrol positif memiliki luasan PL yang jauh lebih kecil daripada kelompok kontrol negatif. Sebagian besar kelompok perlakuan daun X (8 mg, 16 mg, 32 mg dan 64 mg) memiliki luasan PL yang relatif lebih besar daripada kontrol positif.
Tabel 8 menunjukkan bahwa luasan PL per lapang pandang dengan perbesaran 400x tertinggi dimiliki oleh kelompok kontrol negatif dan kelompok 8 mg memiliki luasan PL yang paling mendekati. Luasan PL terendah dimiliki oleh kelompok obat. Hal ini mungkin disebabkan oleh efek obat yang tidak ditujukan untuk memperbaiki jaringan pankreas, jumlah serta luasan PL-nya. Mekanisme kerja obat lebih dipusatkan pada regulasi kadar glukosa darah melalui peningkatan sensitivitas insulin pada reseptor. Hal ini berarti ekstrak daun X mungkin memiliki daya regenerasi yang tinggi terhadap pulau Langerhans.
Hasil uji statistik pada Lampiran 21 menunjukkan bahwa pemberian ekstrak daun X pada tikus selama 30 hari memberikan pengaruh yang nyata terhadap luasan PL per lapang pandang. Hasil uji lanjut Duncan menunjukkan bahwa luasan PL kelompok kontrol positif berbeda sangat nyata terhadap kontrol negatif. Hal ini menunjukkan adanya degenerasi dan penurunan massa total sel pada PL tikus diabetes melitus.
Luasan PL per lapang pandang kelompok 16 mg dan 64 mg lebih besar daripada kontrol positif tetapi kelompok 128 mg dan obat memiliki luasan yang lebih kecil daripada kontrol positif. Hal ini mungkin disebabkan oleh efek toksik yang ditimbulkan oleh ekstrak daun X apabila dikonsumsi dalam dosis tinggi. Efek toksik menyebabkan regenerasi PL menjadi terhambat. Obat yang diberikan juga tidak
berfungsi sebagai pemicu penyembuhan pulau Langerhans, sehingga luasannya tidak bertambah.
Luasan PL kelompok 8 mg tidak berbeda nyata dengan kontrol
negatif. Hal ini berarti pemberian ekstrak daun X dengan dosis 8 mg/ekor/hari dapat memberikan kesembuhan terhadap tikus diabetes
melitus, baik secara aktivitas hipoglikemik maupun regenerasi PL.
Pemberian ekstrak daun X dalam dosis tinggi (64 dan 128 mg) memberikan efek hipoglikemik yang cukup baik terhadap tikus-tikus perlakuan. Kadar glukosa darah kelompok 64 dan 128 mg telah mencapai kisaran normal pada hari ke-28, namun karena penurunannya yang cukup drastis dan efek regenerasi PL yang kurang memuaskan, maka penggunaan dosis 64 dan 128 tidak disarankan. Disamping itu, toksisitas dari ekstrak daun X dosis tinggi belum diteliti secara jelas. Pemberian ekstrak daun X dalam dosis 16 dan 32 mg, meskipun memberikan regenerasi PL yang cukup baik, dalam hal jumlah maupun luas, tetapi belum memperlihatkan efek hipoglikemik yang mencapai normal.
Sel merupakan sel penghasil insulin yang mendominasi sekitar 60- 70 % dari sel-sel pulau Langerhans (Gepts, 1981). Jumlah sel yang terkandung dalam PL juga dapat menjadi parameter yang menentukan tingkat kesembuhan diabetes melitus. Pengamatan terhadap jumlah sel tikus 30 hari pada perbesaran 100x dapat dilihat pada Tabel 8.
Sel pankreas penderita diabetes melitus dapat mengalami penurunan kemampuan sekresi hingga 80 % dan juga dapat mengalami destruksi cepat setelah kondisi diabetes. Fotomikrograf sel pulau Langerhans pada jaringan pankreas tikus 30 hari hasil pewarnaan imunohistokimia pada perbesaran 100x tersaji dalam Gambar 13.
Hasil uji statistik pada Lampiran 22 menunjukkan bahwa pemberian ekstrak daun X pada tikus selama perlakuan (30 hari) memberikan pengaruh yang sangat nyata dalam membantu peningkatan jumlah sel per lapang pandang pada tikus diabetes melitus. Hasil uji lanjut Duncan menunjukkan bahwa jumlah sel kelompok kontrol positif berbeda sangat nyata dengan kontrol negatif. Kontrol positif memiliki jumlah sel
yang terendah. Kondisi diabetes melitus yang tidak ditangani pada kontrol positif menyebabkan tidak terjadinya perbaikan sel-sel , bahkan destruksi yang terjadi adalah yang paling besar. Kontrol positif memiliki sel yang hanya sekitar 12 % dari jumlah sel normal (kontrol negatif). Hal ini mendekati teori Gepts (1981), yang mengungkap bahwa jumlah sel penderita diabetes melitus hanya berjumlah 10 % dari kondisi normalnya.
Jumlah sel kelompok-kelompok perlakuan daun X (8 mg, 16 mg, 32 mg, 64 mg dan 128 mg) dan kelompok perlakuan obat memiliki jumlah sel yang lebih tinggi daripada kontrol positif. Pengaruh pemberian ekstrak daun X yang paling nyata terlihat pada kelompok 8 dan 16 mg, dimana jumlah sel per lapang pandang yang tertinggi diantara kelompok perlakuan yang menderita diabetes melitus dicapai oleh kelompok 8 mg dan diikuti oleh 16 mg. Meskipun jumlah sel kelompok 8 mg masih belum menyamai jumlah normalnya (kontrol negatif), namun perbaikan yang terjadi telah mencapai 40 % atau meningkat empat kali lipat dibanding kondisi awalnya (kontrol positif). Hal ini menunjukkan kemungkinan bahwa konsumsi ekstrak daun X sejumlah 8 mg/hari telah dapat memberikan efek positif terhadap regenerasi sel dan aktivitas hipoglikemik.
Pada dosis di atas 8 mg (16, 32, 64, 128 mg) hanya sedikit terjadi perbaikan jumlah sel . Perbaikan jumlah sel cenderung meningkat seiring dengan menurunnya dosis. Hal ini menimbulkan dugaan bahwa dosis yang tinggi mungkin justru menghambat perbaikan jaringan pankreas, terutama sel . Sementara itu, perbaikan jumlah sel pada kelompok obat mungkin disebabkan oleh lebih terkontrolnya kadar glukosa darah, sehingga kebutuhan insulin berkurang dan kerja sel dalam menghasilkan insulin menjadi lebih ringan. Dengan demikian, sel
Keterangan : K(-) : kontrol negatif, K(+) : kontrol positif, A, B, C, D, E (8, 16, 32, 64, 128 mg ekstrak daun X/ekor/hari), F (obat)
sel ; 50 μm
Gambar 13. Fotomikrograf sel β pulau Langerhans pada jaringan pankreas tikus 30 hari hasil pewarnaan imunohistokimia pada perbesaran 100x K(-) 50 μm K(+) A B C D E F 50 μm 50 μm 50 μm 50 μm 50 μm 50 μm 50 μm
b. Pengamatan terhadap jaringan pankreas tikus 60 hari
Jumlah pulau Langerhans (PL) per lapang pandang pada jaringan pankreas tikus 60 hari dengan pembesaran 100x tersaji dalam Tabel 9. Hasil perhitungan jumlah PL per lapang pandang 60 hari secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 23. Jumlah PL tikus 60 hari cenderung mengalami penurunan dibandingkan jumlah PL tikus 30 hari. Penurunan jumlah PL pada kelompok 16 mg, 32 mg, 64 mg, 128 mg dan obat berturut-turut adalah 8.2, 16.0, 36.8, 38.6 dan 18.4 %.
Penurunan jumlah PL per lapang pandang yang terjadi pada 30 hari kedua dapat terjadi karena memburuknya kondisi diabetes melitus tikus karena tidak diberi penanganan. Destruksi PL kembali terjadi saat pemberian ekstrak daun X maupun obat dihentikan. Kondisi ini tercermin dari peningkatan kadar glukosa darah selama periode tersebut. Fotomikrograf pulau Langerhans tikus 60 hari hasil pewarnaan hematoksilin-eosin pada perbesaran 100x dapat dilihat pada Gambar 14.
Satu-satunya kelompok yang mengalami peningkatan jumlah PL per lapang pandang pada hari ke-60 adalah kelompok 8 mg. Peningkatan jumlah PL yang terjadi adalah sebesar 44.2 %. Hal ini dapat berarti regenerasi PL menuju penyembuhan terhadap diabetes melitus telah terjadi secara berkesinambungan sejak awal perlakuan pada tikus kelompok 8 mg. Penyembuhan mungkin dapat terjadi dengan diinduksi oleh aktivitas senyawa-senyawa biokimia aktif yang terkandung dalam ekstrak daun X dan masih terus berlanjut saat pemberian ekstrak daun X dihentikan.
Hasil uji statistik (Lampiran 24) terhadap jumlah PL per lapang pandang pada tikus 60 hari menunjukkan bahwa terdapat pengaruh nyata (p < 0.05) terhadap jumlah PL pasca perlakuan, baik pemberian ekstrak daun X maupun obat selama 30 hari kedua. Jumlah PL kontrol positif tetap berbeda nyata dengan kontrol negatif. Jumlah PL kelompok 64 mg tidak berbeda nyata dengan kontrol positif. Jumlah PL kelompok 16 mg, 32 mg, 128 mg dan obat berbeda nyata dengan kontrol positif dan kontrol negatif. Sedangkan jumlah PL kelompok 8 mg tidak berbeda nyata
dengan kontrol negatif. Hal ini membuktikan bahwa perbaikan jumlah PL pada kelompok 8 mg telah mencapai normal.
Luasan PL per lapang pandang pada tikus 60 hari (Tabel 9) yang mengalami perlakuan daun X maupun obat juga cenderung menurun apabila dibandingkan dengan tikus 30 hari. Penurunan luasan PL dapat terjadi akibat menyusutnya massa sel karena destruksi kembali yang dipicu oleh memburuknya kondisi diabetes melitus pasca perlakuan daun X maupun obat.
Tabel 9. Jumlah*, luasan** pulau Langerhans dan jumlah sel β*** tikus 60 hari Kelompok Jumlah Pulau Langerhans (buah) Luasan Pulau Langerhans (μm2) Jumlah Sel β (buah) K(-) 4.05 ± 1.1c 12823.28 ± 4035.8c 64.20 ± 18.2c K(+) 1.10 ± 0.8a 8214.54 ± 3164.5ab 7.80 ± 3.3a A 3.75 ± 1.9c 12096.71 ± 4445.1c 52.80 ± 42.4bc B 2.80 ± 1.6b 10038.03 ± 3210.1bc 9.00 ± 3.5a C 3.40 ± 1.8b 8382.84 ± 3434.8ab 29.40 ± 13.9ab D 1.80 ± 0.6a 5445.46 ± 2876.8a 14.00 ± 6.6a E 3.10 ± 1.5b 6729.40 ± 3691.2ab 6.20 ± 1.6a F 3.55 ± 1.8bc 7198.97 ± 3642.7ab 29.80 ± 14.1ab Keterangan : huruf yang sama pada setiap nilai menunjukkan tidak
adanya perbedaan yang nyata (p > 0.05) *
Jumlah : Jumlah pulau Langerhans per lapang pandang dengan perbesaran 100x
**
Luasan : Luasan pulau Langerhans per lapang landang dengan perbesaran 400x
***
Sel : Jumlah Sel per lapang pandang dengan perbesaran 100x
Keterangan : K(-) : kontrol negatif, K(+) : kontrol positif, A, B, C, D, E (8, 16, 32, 64, 128 mg ekstrak daun X/ekor/hari), F (obat)
PL = Pulau Langerhans ; 50 μm
Gambar 14. Fotomikrograf pulau Langerhans tikus 60 hari hasil pewarnaan hematoksilin-eosin pada perbesaran 100x
E F C D A B PL PL PL PL PL PL K(-) K(+) PL PL 50 μm 50 μm 50 μm 50 μm 50 μm 50 μm 50 μm 50 μm
Penurunan luasan PL per lapang pandang pada kelompok 32 mg dan 64 mg berturut-turut adalah 11.9 dan 42.6 %. Penurunan luasan PL berhubungan dengan peningkatan kadar glukosa darah yang mengindikasikan memburuknya kondisi diabetes melitus tikus pada 30 hari kedua. Sebaliknya luasan PL pada kelompok 8 mg, 16 mg, 128 mg dan obat mengalami peningkatan sebesar 9.9 %, 7.3 % 9.5 % dan 24.7 %. Perbaikan jaringan pankreas, terutama luasan PL mungkin disebabkan oleh efek penyembuhan jangka panjang dari senyawa-senyawa biokimia aktif dalam ekstrak daun X atau obat.
Hasil uji statistik pada Lampiran 25 menunjukkan bahwa terdapat pengaruh yang nyata terhadap luasan PL per lapang pandang pasca perlakuan. Hasil uji lanjut Duncan menunjukkan bahwa luasan PL kontrol negatif berbeda nyata dengan kontrol positif. Kelompok 32 mg, 64 mg, 128 mg dan obat memiliki luasan yang tidak berbeda nyata dengan kontrol positif. Kelompok 8 mg memiliki luasan tertinggi yang tidak berbeda nyata dengan kelompok kontrol negatif. Hal ini menunjukkan bahwa pada 30 hari kedua perbaikan terhadap luasan PL dapat dipertahankan dan ditingkatkan hingga tetap tidak berbeda dengan luasan normalnya (kontrol negatif).
Jumlah sel per lapang pandang pada tikus 60 hari cenderung mengalami peningkatan dibanding pada tikus 30 hari (Tabel 9). Jumlah per lapang pandang tertinggi dicapai oleh kelompok 8 mg dengan 52.80 sel. Peningkatan jumlah sel per lapang pandang dialami oleh tikus kelompok 8 mg, 32 mg, 64 mg dan obat sebesar 97 %, 133.3 %, 45.8 % dan 115.9 %. Peningkatan jumlah sel mungkin disebabkan oleh adanya regenerasi jaringan akibat efek jangka panjang dari konsumsi ekstrak daun X maupun obat. Penurunan jumlah sel per lapang pandang terjadi pada kelompok 16 mg (45.8 %) dan 128 mg (43.6 %). Penurunan mungkin disebabkan oleh penurunan jumlah PL per lapang pandang akibat memburuknya kondisi diabetes melitus. Fotomikrograf sel pulau Langerhans pada jaringan pankreas tikus 60 hari hasil pewarnaan imunohistokimia pada perbesaran 100x tersaji dalam Gambar 15.
Keterangan : K(-) : kontrol negatif, K(+) : kontrol positif, A, B, C, D, E (8, 16, 32, 64, 128 mg ekstrak daun X/ekor/hari), F (obat)
sel ; 50 μm
Gambar 15. Fotomikrograf sel β pulau Langerhans pada jaringan pankreas tikus 30 hari hasil pewarnaan imunohistokimia pada perbesaran 100x A B C D E F K(-) 50 μm K(+) 50 μm 50 μm 50 μm 50 μm 50 μm 50 μm 50 μm
Hasil uji statistik (Lampiran 26) menunjukkan bahwa terdapat pengaruh yang nyata terhadap jumlah sel per lapang pandang pasca perlakuan ekstrak daun X maupun obat. Hasil uji Duncan memperlihatkan jumlah sel per lapang pandang kelompok 8 mg tidak berbeda nyata dengan kontrol negatif, sedangkan jumlah sel per lapang pandang kelompok 16 mg, 32 mg, 64 mg, 128 mg dan obat tidak berbeda nyata dengan kontrol positif. Jumlah sel per lapang pandang kelompok 8 mg telah mencapai jumlah normal pada akhir 30 hari kedua.
Penurunan kadar glukosa darah hingga kisaran normal, peningkatan jumlah dan luasan pulau Langerhans serta peningkatan jumlah sel hingga mendekati kelompok kontrol negatif merupakan parameter yang digunakan untuk mengukur kesembuhan tikus diabetes melitus. Semakin banyak dan luas pulau Langerhans, diharapkan jumlah sel yang terdapat di dalamnya akan semakin meningkat. Peningkatan jumlah dan luasan pulau langerhans serta jumlah sel berkaitan erat dengan regulasi penurunan kadar glukosa darah. Dengan demikian, insulin yang dihasilkan pun akan semakin meningkat. Insulin yang cukup akan berperan aktif dalam menjaga mekanisme regulasi kadar glukosa darah, sehingga kondisi hipoglikemia ataupun hiperglikemia dapat dihindarkan.
Peningkatan dosis konsumsi ekstrak daun X berpengaruh nyata terhadap penurunan kadar glukosa darah hari ke-28, peningkatan jumlah pulau Langerhans per lapang pandang 30 hari dengan pembesaran 100x, peningkatan luasan pulau Langerhans per lapang pandang 30 hari dengan pembesaran 400x, dan peningkatan jumlah sel per lapang pandang 30 hari dengan pembesaran 100x dibandingkan dengan kelompok kontrol positif. Berdasarkan hasil dari beberapa parameter, terdapat indikasi bahwa konsumsi ekstrak daun X dengan dosis yang tinggi (> 32 mg/hari) memberikan hasil yang kurang konsisten. Sebaliknya, dosis yang rendah memberikan hasil yang lebih konsisten dan positif. Dosis 8 mg ekstrak daun X per hari sudah dapat memberikan kesembuhan pada tikus yang menderita diabetes melitus.