C. Metode Penelitian
1. Penelitian Pendahuluan
Penelitian pendahuluan yang dilakukan adalah pembuatan tepung ekstrak daun X serta analisis fisiko-kimia. Analisis fisiko-kimia hanya dilakukan terhadap tepung daun X sedangkan pelet ransum tikus hanya diujikan secara kimia. Analisis fisika yang dilakukan terhadap daun X meliputi penentuan rendemen, kapasitas pengikatan air dan indeks kelarutan air. Analisis kimia yang dilakukan meliputi kadar air, kadar abu, kadar protein, kadar lemak, kadar serat pangan dan kadar karbohidrat (by difference).
a. Pembuatan tepung ekstrak daun X
Daun X kering diblender kering dan ditimbang bobot awalnya. Daun X kemudian dimasukkan ke dalam gelas piala yang berisi akuades dan dipanaskan dengan pengadukan di atas penangas listrik selama dua jam hingga volumenya berkurang 50 %. Hasil pemanasan kemudian disaring menggunakan kertas saring untuk memperoleh filtratnya. Filtrat dipekatkan menggunakan rotary evaporator bersuhu 75 oC selama satu jam. Filtrat pekatan kemudian dikeringbekukan (freeze dried) menggunakan freeze dryer. Tepung yang diperoleh kemudian ditimbang untuk menentukan rendemen.
b. Analisis fisiko-kimia
Prosedur analisis fisika yang dilakukan terhadap daun X adalah sebagai berikut :
1) Penentuan rendemen daun X
Rendemen daun X dihitung berdasarkan bobot keringnya. Rendemen daun X dapat dihitung dengan rumus :
Bobot tepung ekstrak daun X
Rendemen (%) = --- x 100 % Bobot tepung daun X
2) Kapasitas Pengikatan Air dan Indeks Kelarutan Air, metode Anderson (Paton dan Spratt, 1984)
Sebanyak 2.5 gram sampel dimasukkan ke dalam tabung sentrifuse yang telah diketahui bobotnya (t), kemudian ditambahkan 25 ml akuades, divortex agar seluruh sampel terdispersi dalam air. Tabung berisi suspensi kemudian ditimbang untuk mengetahui bobot awalnya (a-t). Setelah itu, tabung disentrifusi dengan kecepatan 2000 rpm pada suhu ruang selama 15 menit. Supernatan yang diperoleh dituang secara hati-hati ke dalam wadah lain yang telah diketahui bobotnya untuk mengetahui bobot supernatan (b).
Sementara itu, 2 ml supernatan ditempatkan dalam cawan porselin yang telah diketahui bobotnya (x). Cawan tersebut kemudian dipanaskan dalam oven bersuhu 105 oC selama satu jam. Setelah satu jam, cawan dikeluarkan dari oven dan didinginkan dalam desikator kemudian ditimbang kembali (d). Indeks penyerapan air dan indeks kelarutan air ditentukan dengan rumus berikut :
(a-t) - b Indeks penyerapan air (g/g) = --- bobot sampel
d - x
Indeks kelarutan air (g/ml) = --- volume sampel
Prosedur analsis kimia yang dilakukan terhadap daun X dan pelet ransum tikus adalah sebagai berikut :
Pengukuran kadar air dilakukan dengan metode oven. Cawan aluminium dikeringkan dalam oven pada suhu 100 oC selama 15 menit, kemudian didinginkan dalam desikator hingga mencapai suhu ruang, kemudian ditimbang (A). Neraca di-nol-kan lalu sebanyak + 5 gram sampel dimasukkan ke dalam cawan kemudian ditimbang kembali (B). Cawan berisi sampel dikeringkan dalam oven bersuhu 100 oC selama enam jam. Selanjutnya cawan berisi sampel dikeluarkan dari oven dan didinginkan dalam desikator selama 15 menit. Setelah itu dilakukan penimbangan akhir hingga bobotnya konstan (C).
B - ( C – A )
Kadar air (% b/b) = --- x 100 % B - A
2) Kadar Abu (AOAC, 1995)
Cawan porselin dikeringkan dalam tanur bersuhu 500 oC, kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang (A). Sebanyak 3-5 gram sampel dimasukkan ke dalam cawan kemudian ditimbang kembali (B). Cawan berisi sampel kemudian dibakar di atas hotplate hingga tidak berasap lagi, lalu dilakukan pengabuan di dalam tanur listrik pada suhu 500 oC selama enam jam hingga diperoleh abu berwarna putih. Selanjutnya cawan berisi sampel dikeluarkan dari tanur dan didinginkan dalam desikator selama 15 menit. Setelah itu dilakukan penimbangan akhir (C).
C - A
Kadar abu (% b/b) = --- x 100 % B - A
3) Kadar Protein Kasar (metode Kjeldahl) (AOAC, 1995)
Sampel sebanyak 0.1-0.15 gram ditimbang, kemudian dimasukan ke dalam labu Kjeldahl. Ditambahkan 2 ml H2SO4 pekat, 1.9 gram
K2SO4, 40 mg HgO dan beberapa batu didih. Sampel didestruksi hingga larutan berwarna jernih. Setelah dingin, ditambahkan sejumlah kecil air secara perlahan-lahan dan kemudian didinginkan. Isi labu dipindahkan ke dalam alat destilasi, labu dicuci dan dibilas 2-3 kali dengan akuades dan air cuciannya dipindahkan ke dalam alat destilasi dengan ditambahkan 8-10 ml larutan NaOH-Na2S2O3. Labu Erlenmeyer 125 ml yang berisi larutan 5 ml H3BO3 dan 2-4 tetes indikator (campuran 1 bagian metil merah 0.2 % dalam alkohol dengan 1 bagian metilen blue 0.2 % dalam alkohol) dihubungkan dengan destilator, dimana ujung saluran destilator harus terendam di dalam larutan H3BO3. Selanjutnya dilakukan destilasi hingga tertampung kira-kira 15 ml destilat berwarna hijau dalam Erlenmeyer. Selanjutnya destilat dititrasi dengan larutan HCl 0.02 N hingga terjadi perubahan warna hijau menjadi ungu dan dilakukan juga titrasi blanko.
(ml HCL – ml blanko)
% N = --- x N x 14.007 x 100 mg sampel
% protein = % N x 6.25
4) Kadar Lemak Kasar Metode Soxhlet (AOAC, 1995)
Labu lemak dikeringkan dalam oven bersuhu 100 oC, kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang (A). Sebanyak + 5 gram sampel dibungkus kertas saring dan dimasukkan ke dalam tabung Soxhlet. Kondensor dirangkaikan pada bagian atas dan bagian bawahnya dihubungkan dengan labu lemak yang berisi 30 ml pelarut heksana di atas heating mantle. Refluks dilakukan selama kira-kira enam jam.
Setelah itu, sampel dikeluarkan dari tabung Soxhlet dan dilakukan destilasi heksana. Labu lemak yang berisi lemak sampel hasil ekstraksi kemudian dipanaskan dalam oven bersuhu 105 oC selama 30 menit hingga pelarut menguap seluruhnya. Setelah dikeluarkan
dari oven, labu lemak didinginkan dalam desikator selama 15 menit dan kemudian ditimbang (B).
B - A
Kadar lemak (%) = --- x 100 %
Bobot sampel
5) Kadar serat pangan, metode enzimatik
Sebanyak 2 gram sampel diekstrak lemaknya dengan petroleum eter selama 15 menit. Kemudian diambil 1 gram dan dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer dan ditambahkan 25 ml 0.1 M buffer fosfat pH 6.0 serta dicampur secara menyeluruh. Lalu ditambahkan 0.1 ml alpha amylase (termamyl 120 l) dan labu ditutup dengan aluminium foil. Diinkubasi dalam penangas air panas (80 oC) bergoyang selama 15 menit. Selanjutnya dibiarkan dingin dan ditambahkan 20 ml air destilata, pH diatur menjadi 1.5 dengan HCl dan elektroda dibersihkan dengan beberapa ml air. 0.1 gram pepsin ditambahkan, ditutup dengan aluminium foil dan diinkubasi dalam penangas air bergoyang pada suhu 40 oC selama 60 menit, kemudian ditambahkan 20 ml air destilata dan diatur pH menjadi 6.8 dengan NaOH dan elektroda kembali dibersihkan dengan 5 ml air.
Selanjutnya ditambahkan 0.1 gram pankreatin, kemudian labu ditutup dengan aluminium foil dan kembali diinkubasi dalam penangas air bergoyang pada suhu 40 oC selama 60 menit, serta pH diatur menjadi 4.5 dengan HCl. Kemudian disaring dengan crucible, dicuci dengan 2 x 10 ml air destilata.
Residu (Insoluble fiber).
Residu dalam crucible dicuci dengan 2 x 10 ml etanol 90 % dan 2 x 10 ml aseton. Crucible dikeringkan pada suhu 105 oC sampai bobot tetap dan ditimbang setelah didinginkan dalam desikator (D1). Kemudian diabukan pada suhu 550 oC selama 5 jam, lalu didinginkan dalam desikator dan ditimbang (L1).
Filtrat (Soluble fiber).
Volume filtrat diatur dan dicuci dengan air sampai 100 ml, kemudian ditambahkan 400 ml etanol 95 % hangat (60 oC) dan dibiarkan presipitasi selama satu jam (waktu dapat diperpendek). Lalu disaring dengan crucible yang kering (porositas 2) yang mengandung 0.5 gram celite, selanjutnya dicuci berturut-turut dengan 2 x 10 ml etanol 78 %, 2 x 10 ml etanol 95 % dan 2 x 10 ml aseton.
Setelah filter gelas dikeringkan dalam desikator (D2), dan terakhir diabukan pada suhu 550 oC selama 5 jam serta ditimbang setelah pendingingan dalam desikator (L2). Dilakukan pula perhitungan nilai serat blanko dengan menggunakan prosedur di atas tetapi tanpa menggunakan sampel.
Perhitungan:
% serat pangan tak larut = [ (D1-L1-B1) / W] x 100% ….(1) % serat pangan larut = [ (D2-L2-B2) / W] x 100% ….(2) % Total serat pangan = (1) + (2)
Keterangan:
W = berat sampel (gram)
D = berat setelah pengeringan (gram) L = berat setelah pengabuan (gram) B = berat blanko bebas abu (gram) 6) Kadar karbohidrat (by difference)
Perhitungan kadar karbohidrat dilakukan dengan metode pengurangan (by difference) sebagai berikut :
Kadar karbohidrat (%) = 100%--(kadar air + abu + protein + lemak) %