1 PENDAHULUAN
3.2 Bahan dan Alat
3.4.3 Analisis kimia
1) Analisis kadar air (AOAC 2005)
Cawan porselen dikeringkan dalam oven pada suhu 105 oC selama 1 jam. Cawan tersebut diletakkan ke dalam desikator (kurang lebih 15 menit) dan dibiarkan sampai dingin kemudian ditimbang. Cawan tersebut ditimbang kembali hingga beratnya konstan. Sebanyak 5 gram contoh dimasukkan ke dalam cawan tersebut, kemudian dikeringkan dengan oven pada suhu 105 oC selama 5 jam, kemudian cawan dimasukkan ke dalam desikator sampai dingin dan selanjutnya ditimbang kembali.
Perhitungan kadar air:
% kadar air B A B C %
Keterangan:
A = Berat cawan kosong (gram)
B = Berat cawan dengan sampel (gram)
C = Berat cawan dengan sampel setelah dikeringkan (gram)
2) Analisis kadar abu (AOAC 2005)
Cawan pengabuan dikeringkan di dalam oven selama 1 jam pada suhu 600 oC, kemudian didinginkan selama 15 menit di dalam desikator dan ditimbang hingga didapatkan berat yang konstan. Sampel sebanyak 5 gram dimasukkan ke dalam cawan pengabuan dan dipijarkan di atas nyala api hingga tidak berasap lagi. Setelah itu dimasukkan ke dalam tanur pengabuan dengan suhu 600 oC selama 1 jam, kemudian ditimbang hingga didapatkan berat yang konstan.
Perhitungan kadar abu:
% kadar abu C AB A %
Keterangan:
A = Berat cawan abu porselen kosong (gram)
B = Berat cawan abu porselen dengan sampel (gram)
3) Analisis kadar protein (AOAC 2005)
Tahap-tahap yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari tiga tahap, yaitu destruksi, destilasi, dan titrasi. Pengukuran kadar protein dilakukan dengan metode mikro Kjeldahl. Sampel ditimbang sebanyak 0,25 gram, kemudian dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl 100 ml, lalu ditambahkan satu butir kjeltab dan 3 ml H2SO4 pekat. Contoh didestruksi pada suhu 410 oC selama kurang lebih 1 jam sampai larutan jernih lalu didinginkan. Setelah dingin, ke dalam labu Kjeldahl ditambahkan 50 ml akuades dan 20 ml NaOH 40 %, kemudian dilakukan proses destilasi dengan suhu destilator 100 oC. Hasil destilasi ditampung dalam labu Erlenmeyer 125 ml yang berisi campuran 10 ml asam borat (H3BO3) 2 % dan 2 tetes indikator bromcherosol green-methyl red yang berwarna merah muda. Setelah volume destilat mencapai 40 ml dan berwarna hijau kebiruan, maka proses destilasi dihentikan. Lalu destilat dititrasi dengan HCl 0,1 N sampai terjadi perubahan warna merah muda. Volume titran dibaca dan dicatat. Larutan blanko dianalisis seperti contoh. Kadar protein dihitung dengan rumus sebagai berikut :
% N ml HCl ml Blankomg sampelN HCl fp %
% kadar protein % N fk
Keterangan:
fp = Faktor pengenceran = 10 fk = Faktor konversi = 6,25
4) Analisis kadar lemak (AOAC 2005)
Contoh seberat 5 gram dimasukkan ke dalam kertas saring pada kedua ujung bungkus ditutup dengan kapas bebas lemak dan selanjutnya sampel yang telah dibungkus dimasukkan ke dalam labu lemak yang sudah ditimbang berat tetapnya dan disambungkan dengan tabung Soxhlet. Selongsong lemak dimasukkan ke dalam ruang ekstraktor tabung Soxhlet dan disiram dengan pelarut lemak (n-heksana), kemudian dilakukan refluks selama 6 jam. Pelarut lemak yang ada dalam labu lemak didestilasi hingga semua pelarut lemak menguap. Pada saat destilasi pelarut akan tertampung di ruang ekstraktor, pelarut dikeluarkan
sehingga tidak kembali ke dalam labu lemak, selanjutnya labu lemak dikeringkan dalam oven pada suhu 105 oC, setelah itu labu didinginkan dalam desikator sampai beratnya konstan.
Kadar lemak dihitung dengan rumus sebagai berikut :
% Kadar lemak W WW % Keterangan :
W1 = Bobot sampel (gram)
W2 = Bobot labu lemak kosong (gram) W3 = Bobot labu lemak dengan lemak (gram)
5) Analisis asam lemak (AOAC 2005)
Metode analisis yang digunakan memiliki prinsip mengubah asam lemak menjadi turunannya, yaitu metil ester sehingga dapat terdeteksi oleh alat kromatografi. Gas Chromatography (GC) memiliki prinsip kerja pemisahan antara gas dan lapisan tipis cairan berdasarkan perbedaan jenis bahan (Fardiaz 1989). Jenis alat kromatografi yang digunakan dalam penelitian ini adalah SupelcoTM 37 Component FAME Mix. Hasil analisis akan terekam dalam suatu lembaran yang terhubung dengan rekorder dan ditunjukkan melalui beberapa puncak pada waktu retensi tertentu sesuai dengan karakter masing-masing asam lemak. Sebelum melakukan injeksi metil ester, terlebih dahulu lemak diekstraksi dari bahan lalu melakukan metilasi sehingga terbentuk metil ester dari masing-masing asam lemak yang didapat.
a. Tahap ekstraksi
Tahap pertama dilakukan ekstraksi soxhlet untuk memperoleh asam lemak, dan ditimbang sebanyak 20-30 mg lemak dalam bentuk minyak.
b. Tahap metilasi
Tahap metilasi dimaksudkan untuk membentuk senyawa turunan dari asam lemak menjadi metil esternya. Asam-asam lemak diubah menjadi ester-ester metil atau alkali yang lainnya sebelum disuntikkan ke dalam kromatografi gas (Fardiaz 1989).
Tahap metilasi diawali dengan hidrolisis, yaitu dengan merefluks lemak di atas penangas air dengan menambahkan 1 ml NaOH 0,5 N dalam metanol dan
dipanaskan selama 20 menit. Tahap selanjutnya adalah proses metilasi dengan menambahkan 2 ml BF3 16 % dalam metanol kemudian dipanaskan kembali selama 20 menit dan didinginkan. Sampel yang telah didinginkan selanjutnya ditambahkan 2 ml NaCl jenuh dan 1 ml isooktan, kemudian dihomogenkan dan bagian atas lapisan isooktan dipindahkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 0,1 gram Na2SO4 anhidrat lalu dibiarkan 15 menit. Larutan disaring dengan mikrofilter untuk memisahkan fase cairnya sebelum diinjeksikan ke dalam kromatografi gas. Sampel sebanyak 1 µl selanjutnya diinjeksikan ke dalam kromatografi gas. Asam lemak yang ada dalam metil ester akan diidentifikasi oleh flame ionization detector (FID) atau detektor ionisasi nyala dan respon yang ada akan tercatat melalui kromatogram (peak).
c. Identifikasi asam lemak
Identifikasi asam lemak dilakukan dengan menginjeksikan metil ester pada kromatografi gas SupelcoTM 37 Component Fame Mix dengan kondisi sebagai berikut: gas yang digunakan sebagai fase bergerak adalah gas nitrogen dengan aliran bertekanan 20 ml/menit, sebagai bahan pembakar adalah hidrogen dengan aliran bertekanan 30 ml/menit, dan oksigen dengan aliran 200-300 ml/menit, kolom yang digunakan adalah kolom kapiler (capillary column) dB-23 berisi cyanopropil methylsil sepanjang 60 m dengan diameter dalam 0,25 mm, dengan tebal lapisan film 0,25 µm. Temperatur terprogram sebesar 125 oC, kemudian suhu dinaikkan 5 oC per menit hingga suhu akhir 225 oC, suhu injektor 220 oC, dan suhu detektor 240 oC. Alat kromatografi gas yang digunakan dalam penelitian ini disajikan pada Gambar 7.
a b
Gambar 7 (a) Kromatografi gas
d. Perhitungan jumlah asam lemak
Prinsip analisis komposisi asam lemak dengan kromatografi gas adalah dengan mengubah komponen asam lemak pada lemak/minyak menjadi senyawa volatil metil ester lemak yang akan dideteksi oleh detektor ionisasi nyala api dalam bentuk respon berupa peak kromatogram. Jenis dan jumlah asam lemak yang ada pada contoh dapat diidentifikasi dengan membandingkan peak kromatogram contoh dengan peak kromoatogram asam lemak standar yang telah diketahui jenis dan konsentrasinya, kemudian dihitung kadar asam lemaknya. Pengujian asam lemak ini menggunakan metode eksternal standar dimana pengukuran contoh dan standar dilakukan secara terpisah dan tanpa adanya penambahan larutan standar ke dalam contoh. Kadar asam lemak sampel dengan metode eksternal standar dapat dihitung sebagai berikut:
% asam lemak b/b
Area sampel
Area standar C V %
gram contoh lemak
6) Analisis kolesterol (Liebermann Burchard 1974)
Analisis kadar kolesterol dilakukan menggunakan spektrofotometer. Sampel keong mas sebanyak + 0,1 gram sampel dimasukkan ke dalam tabung sentrifuse ditambah 8 ml campuran etanol dan potreleum eter dengan perbandingan 3:1 dan diaduk sampai homogen. Pengaduk dibilas dengan larutan yang sama sebanyak 2 ml, kemudian disentrifuse 4.000 rpm selama 10 menit.
Supernatan dituang ke dalam beaker glass 100 ml dan diuapkan di penangas air. Residu dilarutkan dengan kloroform sedikit demi sedikit sambil dituangkan ke dalam tabung berskala hingga mencapai volume 5 ml. Selanjutnya ditambahkan 2 ml asetat anhidrat dan 0,2 ml H2SO4 pekat, lalu dihomogenkan dengan vorteks dan dibiarkan di tempat gelap selama 15 menit. Absorbansi dibaca menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 420 nm yang ditunjukkan dengan warna hijau tua. Kadar kolesterol dihitung dengan rumus:
3.5 Rancangan Percobaan
Rancangan percobaan dilakukan untuk mengamati dan mengidentifikasi perubahan yang disebabkan variabel atau perlakuan. Rancangan percobaan yang digunakan pada penelitian ini dibedakan atas rancangan percobaan untuk uji hedonik dan rancangan percobaan untuk analisis kimia.