Analisis Molekuler Uji Kualitas DNA

HASIL DAN PEMBAHASAN

4. Analisis Molekuler Uji Kualitas DNA

Uji kualitas DNA dilakukan untuk mengetahui tingkat keberhasilan ekstraksi DNA. Profil pita DNA untuk uji kualitas dapat dilihat pada Gambar 4.

Hasil pengamatan kualitas DNA memperlihatkan pola pita yang tebal yang menunjukkan bahwa pada pita tersebut terdapat DNA lalat buah sehingga dapat dianalisis dengan menggunakan PCR. Terlihat juga kondisi smear hasil ekstraksi yang ditunjukkan oleh beberapa pita, hal ini disebabkan oleh keberadaan kontaminan, proses ekstraksi yang belum maksimal, atau merupakansisa larutan-larutan yang terbawa selama isolasi. Mulyani et al. (2011) menyatakan bahwa

smear bisa merupakan sisa dari larutan-larutan yang terbawa selama proses isolasi atau juga dapat berupa DNA yang terdegradasi pada proses isolasi. Keberadaan senyawa tersebut dapat menjadi faktor yang menghambat keberhasilan proses ekstraksi DNA (Maftuchah & Zainuddin, 2013).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29

Gambar 4. Hasil uji elektroforesis 29 sampel DNA lalat buah di lima lokasi pertanaman jambu biji merah

Ket: (1) B.umbrosa Sawit Rejo; (2) B. umbrosa Kolam; (3) B. umbrosa Namoriam; (4) B. umbrosa Sei Mencirim; (5) B. umbrosa Sei Beras Sekata; (6) B.curcubitae Sawit Rejo; (7) B.curcubitae Kolam; (8) B.curcubitae Namoriam; (9) B.curcubitae Sei Mencirim; (10) B.curcubitae Sei Beras Sekata; (11) B.caudata Sawit Rejo; (12) B.caudata Kolam; (13) B.caudata Namoriam; (14) B.caudata Sei Mencirim; (15) B.caudata Sei Beras Sekata; (16) B.carambolae Sawit Rejo; (17) B.carambolae Kolam;

(18) B.carambolae Namoriam; (19) B.carambolae Sei Mencirim; (20) B.carambolae Sei Beras Sekata;

(21) B.papayae Sawit Rejo; (22) B.papayae Kolam; (23) B.papayae Namoriam; (24) B.papayae Sei Mencirim; (25) B.papayae Sei Beras Sekata; (26) B.tau Kolam; (27) B.albistrigataKolam;

(28)B.KinabaluKolam; (29) B.sp.Sawit Rejo.

Uji Kuantitas DNA

Hasil uji kuantitas dengan menggunakan nanofotometer menunjukkan pendekatan terhadap konsentrasi DNA yang telah diekstraksi dari DNA sampel.

Hasil pengecekan kuantitas dengan nanofotometer yang terlihat pada Tabel 5 terdapat DNA sampel yang memiliki tingkat kemurnian yang tidak sesuai dengan rasio perbandingan Sambrook et al. (1989) yaitu 1.80 – 2.00. Hal tersebut menunjukkan bahwa tingkat kemurnian di luar batas rasio tersebut berarti masih terdapat kontaminan yang berupa fenolik, karbohidrat, protein dan RNA.Menurut

Zein & Prawiradilaga (2013) jika konsentrasinya terlalu rendah, maka primer tidak dapat menemukan target. Sebaliknya bila konsentrasi cetakan DNA terlalu tinggi akan meningkatkan kemungkinan salah target (mispriming). Selain itu kemurnian cetakan DNA juga penting, karena dapat mempengaruhi hasil reaksi.

Tabel 5. Hasil uji kuantitas dan konsentrasi DNA lalat buah populasi Kabupaten Deli Serdang dengan nanofotometer 10. Sei Beraskata Bactrocera curcubitae Cu5 1.31 250 11. Sawit Rejo Bactrocera caudata Ca1 2.00 280

18. Namoriam Bactrocera carambolae Cb3 1.59 670 19. Sei Mencirim Bactrocera carambolae Cb4 1.23 310 20. Sei Beraskata Bactrocera carambolae Cb5 1.33 240 21. Sawit Rejo Bactrocera papayae P1 2.50 1150

1500

600

100

Profil Pita DNA Hasil PCR Dengan Marka RAPD

Penggunaan teknik RAPD sebagai penanda molekuler pada penelitian ini, memperlihatkan dari 5 primer yang digunakanbahwa tidak semua primer dapat menunjukkan hasil amplifikasi pada lalat buah.Profil pita yang dihasilkan dari kelima primer yang telah diuji, dapat digunakan untuk tujuan analisis keragaman genetik lalat buah karena pita yang dihasilkan cukup jelas (Gambar 5-9).

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29

Gambar 5. Profil PCR primer OPC-01 dengan (M) Marker 100 bp DNA ladder; (1) B.umbrosa Sawit Rejo; (2) B. umbrosa Kolam; (3) B. umbrosa Namoriam; (4) B. umbrosa Sei Mencirim; (5) B. umbrosa Sei Beras Sekata; (6) B.curcubitae Sawit Rejo; (7) B.curcubitae Kolam; (8) B.curcubitae Namoriam; (9) B.curcubitae Sei Mencirim; (10) B.curcubitae Sei Beras Sekata; (11) B.caudata Sawit Rejo; (12) B.caudata Kolam;

(13) B.caudata Namoriam; (14) B.caudata Sei Mencirim; (15) B.caudata Sei Beras Sekata; (16) B.carambolae Sawit Rejo; (17) B.carambolae Kolam; (18) B.carambolae Namoriam; (19) B.carambolae Sei Mencirim; (20) B.carambolae Sei Beras Sekata;

(21) B.papayae Sawit Rejo; (22) B.papayae Kolam; (23) B.papayae Namoriam; (24) B.papayae Sei Mencirim; (25) B.papayae Sei Beras Sekata; (26) B.tau Kolam; (27) B.albistrigata Kolam; (28) B.Kinabalu Kolam; (29) B.sp.Sawit Rejo.

Pada Gambar 5 amplifikasi primer OPC-01pada no. pita 1-5 (B. umbrosa) menghasilkan 6 fragmen DNA dan 5 pita polimorfis dengan kisaran 564-1.739 bp.

No. pita 6-10 (B. curcubitae) menghasilkan 4 fragmen DNA dan 3 pita polimorfis dengan kisaran 426-1.630 bp. No. pita 11-15 (B. caudata) menghasilkan 5 fragmen DNA dan 5 pita polimorfis dengan kisaran 271-1.565 bp. No. pita 16-20 (B. carambolae) menghasilkan 5 fragmen pita dan 5 pita polimorfis dengan

1500

600

100

kisaran 317-977 bp. No. pita 21-25 (B. papayae) menghasilkan 4 fragmen pita dan 3 pita polimorfis dengan kisaran 186-1.291 bp. No. pita 26 (B. tau) menghasilkan 1 fragmen pita dengan kisaran 522 bp. No. pita 27 (B. albistrigata) menghasilkan 1 fragmen pita dengan kisaran 1.750 bp.No. pita 28 (B. kinabalu) menghasilkan 1 fragmen pita dengan kisaran 474 bp. No. pita 29 (Bactrocera sp.) menghasilkan 2 fragmen pita dengan kisaran 491-1.033 bp.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29

Gambar 6. Profil PCR primer OPL-07 dengan (M) Marker 100 bp DNA ladder; (1) B.umbrosa Sawit Rejo; (2) B. umbrosa Kolam; (3) B. umbrosa Namoriam; (4) B. umbrosa Sei Mencirim; (5) B. umbrosa Sei Beras Sekata; (6) B.curcubitae Sawit Rejo; (7) B.curcubitae Kolam; (8) B.curcubitae Namoriam; (9) B.curcubitae Sei Mencirim; (10) B.curcubitae Sei Beras Sekata; (11) B.caudata Sawit Rejo; (12) B.caudata Kolam;

Pada Gambar 6 amplifikasi primer OPL-07 pada no. pita 1-5 (B. umbrosa) menghasilkan 8 fragmen DNA dan 6 pita polimorfis dengan kisaran 211-946 bp.

No. pita 6-10 (B. curcubitae) menghasilkan 8 fragmen DNA dan 6 pita polimorfis dengan kisaran 308-1.319 bp. No. pita 11-15 (B. caudata) menghasilkan 9 fragmen DNA dan 8 pita polimorfis dengan kisaran 223-1.291 bp. No. pita 16-20 (B.carambolae) menghasilkan 7 fragmen pita dan 7 pita polimorfis dengan kisaran

1500

600

100

212-1.109 bp. No. pita 21-25 (B. papayae) menghasilkan 8 fragmen pita dan 7 pita polimorfis dengan kisaran 212-1.153 bp. No. pita 26 (B. tau) menghasilkan 4 fragmen pita dengan kisaran 308-900 bp. No. pita 27 (B. albistrigata) menghasilkan 2 fragmen pita dengan kisaran 253-594 bp. No. pita 28 (B.

kinabalu) menghasilkan 7 fragmen pita dengan kisaran 162-781 bp. No. pita 29 (Bactrocerasp.) menghasilkan 4 fragmen pita dengan kisaran 286-7649 bp.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29

Gambar 7. Profil PCR primer OPL-08 dengan (M) Marker 100 bp DNA ladder; (1) B.umbrosa Sawit Rejo; (2) B. umbrosa Kolam; (3) B. umbrosa Namoriam; (4) B. umbrosa Sei Mencirim; (5) B. umbrosa Sei Beras Sekata; (6) B.curcubitae Sawit Rejo; (7) B.curcubitae Kolam; (8) B.curcubitae Namoriam; (9) B.curcubitae Sei Mencirim; (10) B.curcubitae Sei Beras Sekata; (11) B.caudata Sawit Rejo; (12) B.caudata Kolam;

Pada Gambar 7 amplifikasi primer OPL-08 pada no. pita 1-5 (B. umbrosa) menghasilkan 7 fragmen DNA dan 7 pita polimorfis dengan kisaran 340-1.366 bp.

No. pita 6-10 (B. curcubitae) menghasilkan 4 fragmen DNA dan 4 pita polimorfis dengan kisaran 365-865 bp. No. pita 11-15 (B. caudata) menghasilkan 6 fragmen DNA dan 6 pita polimorfis dengan kisaran 270-1.473 bp. No. pita 16-20

1500

600

100

358-664 bp. No. pita 21-25 (B. papayae) menghasilkan 7 fragmen pita dan 6 pita polimorfis dengan kisaran 259-1.000 bp. No. pita 26 (B. tau) menghasilkan 5 fragmen pita dengan kisaran 358-1.172 bp. No. pita 27 (B. albistrigata) menghasilkan 1 fragmen pita dengan kisaran 347 bp. No. pita 28 (B. kinabalu) menghasilkan 4 fragmen pita dengan kisaran 359-714 bp. No. pita 29 (Bactrocerasp.) menghasilkan 3 fragmen pita dengan kisaran 391-800bp.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29

Gambar 8. Profil PCR primer OPL-16 dengan (M) Marker 100 bp DNA ladder; (1) B.umbrosa Sawit Rejo; (2) B. umbrosa Kolam; (3) B. umbrosa Namoriam; (4) B. umbrosa Sei Mencirim; (5) B. umbrosa Sei Beras Sekata; (6) B.curcubitae Sawit Rejo; (7) B.curcubitae Kolam; (8) B.curcubitae Namoriam; (9) B.curcubitae Sei Mencirim; (10) B.curcubitae Sei Beras Sekata; (11) B.caudata Sawit Rejo; (12) B.caudata Kolam;

Pada Gambar 8 amplifikasi primer OPL-16 pada no. pita 1-5 (B. umbrosa) menghasilkan 5 fragmen DNA dan 5 pita polimorfis dengan kisaran 274-1.477 bp.

No. pita 6-10 (B. curcubitae) menghasilkan 7 fragmen DNA dan 7 pita polimorfis dengan kisaran 259-1.272 bp. No. pita 11-15 (B. caudata) menghasilkan 7 fragmen DNA dan 7 pita polimorfis dengan kisaran 222-1.410 bp. No. pita 16-20 (B.carambolae) menghasilkan 8 fragmen pita dan 7 pita polimorfis dengan kisaran

1500

600

100

272-1.146 bp. No. pita 21-25 (B. papayae) menghasilkan 5 fragmen pita dan 4 pita polimorfis dengan kisaran 319-1.116 bp. No. pita 26 (B. tau) menghasilkan 2 fragmen pita dengan kisaran 637-574 bp. No. pita 27 (B. albistrigata) menghasilkan 4 fragmen pita dengan kisaran 443-1.500 bp. No. pita 28 (B.

kinabalu) menghasilkan 2 fragmen pita dengan kisaran 359-491 bp. No. pita 29 (Bactrocerasp.) menghasilkan 3 fragmen pita dengan kisaran 300-531bp.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29

Gambar 9. Profil PCR primer OPI-17 dengan (M) Marker 100 bp DNA ladder; (1) B.umbrosa Sawit Rejo; (2) B. umbrosa Kolam; (3) B. umbrosa Namoriam; (4) B. umbrosa Sei Mencirim; (5) B. umbrosa Sei Beras Sekata; (6) B.curcubitae Sawit Rejo; (7) B.curcubitae Kolam; (8) B.curcubitae Namoriam; (9) B.curcubitae Sei Mencirim; (10) B.curcubitae Sei Beras Sekata; (11) B.caudata Sawit Rejo; (12) B.caudata Kolam;

Pada Gambar 9 amplifikasi primer OPI-17 pada no. pita 1-5 (B. umbrosa) menghasilkan 5 fragmen DNA dan 5 pita polimorfis dengan kisaran 248-1.071 bp.

No. pita 6-10 (B. curcubitae) menghasilkan 5 fragmen DNA dan 5 pita polimorfis dengan kisaran 292-1.500 bp. No. pita 11-15 (B. caudata) menghasilkan 6 fragmen DNA dan 6 pita polimorfis dengan kisaran 269-1.372 bp. No. pita 16-20 (B.carambolae) menghasilkan 5 fragmen pita dan 5 pita polimorfis dengan kisaran

300-978 bp. No. pita 21-25 (B. papayae) menghasilkan 6 fragmen pita dan 4 pita polimorfis dengan kisaran 300-1.583 bp. No. pita 26 (B. tau) menghasilkan 3 fragmen pita dengan kisaran 308-1.398 bp. No. pita 27 (B. albistrigata) menghasilkan 4 fragmen pita dengan kisaran 300-1.398 bp. No. pita 28 (B.

kinabalu) menghasilkan 2 fragmen pita dengan kisaran 367-520 bp. No. pita 29 (Bactrocerasp.) menghasilkan 4 fragmen pita dengan kisaran 300-661bp.

Penelitian ini juga menunjukkan bahwa polimorfisme juga dapat dilihat antar individu dalam satu populasi dan antar populasi.Berdasakan profil pita (Gambar 5-9) memperlihatkan bahwa ukuran pita DNA polimorfik yang dihasilkan dari setiap primer umumnya berbeda.Dari pita DNA yang diskor, tidak ada satu primer yang menunjukkan semua individu dari kelima populasi. Dengan kata lain,

RAPD menggunakan 5 primer ini menghasilkan 91.18% pita-pita DNA polimorfik. Total pola pita yang dihasilkan sebanyak 211 pola pita dengan jumlah total pita polimorfis sebanyak 138 pola pita. Hal ini menunjukkan potensi kemampuan metode RAPD dalam mendeteksi perbedaan genetik antar individu, artinya setiap individu mempunyai profil RAPD atau sidik jari yang berbeda berdasarkan primer tersebut.Spesies yang berbeda dapat menunjukkan tingkat polimorfisme yang berbeda, sebanding dengan variasi lokus RAPD dan jumlah lokus yang diamplifikasi (Jiang et al., 2014).

Gambar 5-9 menunjukkan bahwa dari hasil amplifikasi pita-pita yang muncul memiliki ukuran basa dan intensitas pita yang bervariasi, seperti terlihat pada primer OPC-01 nomor pita 1-5 memiliki kisaran pita 1.739-564 (Gambar 5).

Pramudi et al. (2013) menyatakan bahwa perbedaan intensitas pita DNA

tersebutdipengaruhi oleh sebaran situs penempelan primer pada genom, kemurnian dan konsentrasi genom dalam reaksi. Williams et al.(1990) menyatakan bahwa banyaknya pita yang dihasilkan oleh setiap primer tergantung pada sebaran situs yang homolog pada genom.

Beberapa sampel DNA lalat buah hasil amplifikasi juga terdapat pita yang tidak muncul, seperti terlihat pada Gambar 7, pada primer OPL-08 dengan nomor pita 3, 10, 12, 14, dan 15 tidak menunjukkan adanya pita DNA. Hal ini disebabkan tidak terjadinya amplifikasi karena diduga primer yang digunakan tidak sesuai dengan DNA cetakan. Azizah (2009) menyatakan bahwa primer yang tidak spesifik atau sesuai dapat menyebabkan teramplifikasinya daerahlain dalam genom yang tidak dijadikan sasaran atau sebaliknya tidak ada daerahgenom yang teramplifikasi. Beberapa bukti percobaan menunjukkan bahwa perbedaan satu pasang basa saja sudah cukup menyebabkan ketidaksesuaian cetakan primer yang kemudian mencegah amplifikasi (William et al., 1990; Asokan et al., 2007).

Menurut Pramudiet al. (2013) bahwa adanya perubahan sekecil apapundalam reaksi dapat mengubah jumlah dan intensitasproduk amplifikasi sehingga keterulangan sulit untuk dipertahankan.Muladno (2010) juga menambahkan RAPD tidak dapatmembedakan individu homozigot dan heterozigot karenabersifat sebagai penanda dominan serta sulit mendeteksiperubahan yang kecil pada struktur DNA.

Berdasarkan hasil amplifikasi dengan menggunakan 5 primer,diperoleh data berupa skoring untuk menentukan variasi genetik antar individu dalam 29 sampel lalat buah. Pengelompokan hasil analisis melalui pohonfilogenetik

III (dendogram),dapat mengetahui kekerabatan lalat buah di 5 lokasipertanaman jambu biji merah di Kabupaten Deli Serdang berdasarkan marka molekular RAPD. Pohon filogenetik dapat dilihat pada Gambar 10.

Gambar 10. Dendogram hubungan kekerabatan lalat buah di 5 lokasi pertanaman jambu biji merah berdasarkan marka RAPD.Angka di atas cabang adalah nilai bootstrap (%).

Keterangan : (1) Sawit Rejo; (2) Kolam; (3) Namoriam; (4) Sei Mencirim; (5) Sei Beras Sekata; B.

albistrigata - Kolam; Bactrocera sp. – Sawit Rejo; B. kinabalu – Kolam; B. tau – kolam.

Berdasarkan analisis pohon filogenetik menunjukkan hubungan kedekatan genetik antar spesies dari kelima populasi berdasarkan marka RAPD menghasilkan 3 Cluster yakni B. caudata (Kolam dan Namoriam) dan B. umbrosa (Kolam, Namoriam dan Sei Mencirim) karena berada dalam Kelompok yang sama (Cluster 1); B. curcubitae(Sei Beras Sekata), B. caudata (Sei Mencirim dan Sei Beras Sekata), B. umbrosa (Sei Beras Sekata), B. carambolae (Sei Mencirim dan Sei Beras Sekata), dan B. papayae (Kolam, Namoriam, Sei Mencirim dan Sei Beras Sekata) karena berada dalam kelompok yang sama (Cluster 2); B.

I II

kinabalu(Kolam), B. carambolae (Sawit Rejo, Kolam dan Namoriam), B. tau (Kolam), Bactrocerasp. (Sawit Rejo), B. papayae (Sawit Rejo), B. curcubitae (Sawit Rejo, Kolam, Namoriam dan Sei Mencirim), B. caudata (Sawit Rejo), B.umbrosa(Sawit Rejo) dan B. albistrigata (Kolam) karena berada dalam kelompok yang sama (Cluster 3).Berdasarkan dendogram dapat juga dilihat bahwa sampel lalat buah B. caudata 4 dan B. caudata 5 yang berada dalam cluster yang sama memiliki kisaran jarak genetik paling dekat yakni 0.13 (Lampiran 12) yang berarti kedua sampel tersebut memiliki hubungan kekerabatanlebih dekat bila dibandingkan dengan individu lain. Menurut Lucic et al. (2011) bahwakekerabatan antar individu yang ditunjukkan olehdendogram berkorelasi dengan jarak genetik individu.Kekerabatan yang dekat menunjukkan jarak genetik yangrendah dan kekerabatan yang jauh menujukkan jarakgenetik yang tinggi.

Kedekatan hubungan genetik antar individu dianalisis menggunakan Pairwise Distance Calculation yang menggambarkan jarak genetik antar spesies, hasilPairwise Distance Calculation berkisar antara 0.13-0.42 (Lampiran 12) menunjukkan bahwa spesies yang ditemukan masih memiliki hubungan kekerabatan yang dekat.Spesies yang memiliki nilai jarak genetik semakin rendah, memiliki hubungan kekerabatan semakin dekat, dan sebaliknya spesies yang memiliki nilai jarak genetik yang jauh, memiliki hubungan kekerabatan semakin jauh (Dharmayantiet al., 2010).Besarnya perbedaan jarak genetik dalam populasi dapat disebabkan oleh beberapa faktor seperti faktor isolasi oleh jarak, geografi, ekologi, dan reproduksi. Apabila hal ini terjadi maka akan muncul jenisbaru yang

mampu beradaptasi pada lingkungannya secara alami dalam waktu jangka panjang(Schmitt &Haubrich,2008).

Dalam dokumen KARAKTERISTIK MORFOLOGI DAN MOLEKULER LALAT BUAH Bactroceras pp. (DIPTERA: TEPHRITIDAE) PADA PERTANAMAN JAMBU BIJI MERAH KABUPATEN DELI SERDANG (Halaman 48-60)