Waktu dan Tempat
Penelitian ini telah dilaksanakan pada bulan Aprilsampai November 2017.Pengumpulan sampel lalat buah dilakukan di 5 lokasi pertanaman jambu biji merah di Kabupaten Deli Serdang (Tabel 1) (peta pengumpulan sampel lalat buah Lampiran 1).Identifikasi morfologi lalat buah dilakukan di Laboratorium Hama Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara, Medan, serta di Laboratorium Pusat Penelitian Biologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong.
Karakteristik molekuler lalat buah dilakukan di Laboratorium Genetika dan Biologi Molekuler FMIPA Universitas Sumatera Utara, Medan.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah atraktan (ME) metil eugenol sintetis dan (OLK) olahan limbah kakao, papain, natrium hidroksida, alkohol 70%, pasir, kapas, buah yang terserang, madu, wizard genomic DNA, go taq green master mix, agarose, 100bp DNA ladder, buffer TAE, ethidium bromide.
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu: mikroskop hirox, pinset, kuas, gunting, kamera, kawat tipis, wadah plastik, botol specimen, kain kasa, alat tulis, gelas ukur, pengaduk, pipet tetes, kertas label, pH meter, tube, micropipette, micropestle, incubator, sentrifuge, PCR, eletroforesis, UV Iluminator, GPS, thermohigrometer.
Metode Penelitian
Penelitian ini dilakukan sesuai metode Rahmawati (2014) dengan menggunakan RAK Faktorial dengan 2 faktor dan 3 ulangan, bagan penelitian terlampir pada Lampiran 2.
Faktor 1: Atraktan Lalat Buah
A1 = Methyl Eugenol sintetis 1 ml (Pembanding) A2 = Olahan limbah kakao 1 ml
A3 = Methyl Eugenol sintetis+ Olahan limbah kakao 1ml : 1 ml Faktor 2: Lokasi Pertanaman Jambu Biji Merah
L1 = Desa Kolam
L2 = Desa Sei Beras Sekata L3 = Desa Sawit Rejo L4 = Desa Sei Mencirim L5 = Desa Namoriam Kombinasi Perlakuan:
A1L1 A1L2 A1L3 A1L4 A1L5
A2L1 A2L2 A2L3 A2L4 A2L5
A3L1 A3L2 A3L3 A3L4 A3L5
Data ketertarikan lalat buah Bactrocera spp. dianalisis dengan uji lanjutDuncan untuk mengetahui interaksi perlakuan.Perhitungan analisis data ini menggunakan software SPSS 16.
Tabel 1. Lokasi Pengambilan Sampel Lalat Buah Di Pertanaman Jambu Biji Merah Kabupaten Deli Serdang Lokasi
Ketinggian Luas Jumlah Pemeliharaan Ordinat
m dpl Lahan
± 2500 90 Pemupukan, Pemangkasan, Insektisida,
Herbisida, Pembungkusan Buah 3°31’1” 98°35’27”
Desa Sei Mencirim ± 34
±3.000 100 Pemupukan, Pemangkasan,Insektisida,
Herbisida, Pembungkusan Buah, 3°33’8” 98°33’38”
Kec. Kutalimbaru:
Desa Sawit Rejo ±52
± 2500 92 Pemupukan, Pemangkasan,Insektisida,
Lem Perekat,Pembungkusan Buah 3°32’30” 98°32’58”
Kec. Pancur Batu:
Pelaksanaan Penelitian 1. Penentuan Lokasi
Metode penentuan daerah penelitian ditetapkan secara purposive sampling (sampling dengan maksud dan tujuan tertentu). Daerah lokasi pertanaman jambu biji merah di Desa Kolam, Sei Beras Sekata, Sawit Rejo, Sei Mencirim, dan Namoriam yang sebelumnya sudah dilakukan survei pendahuluan (Tabel 1). Desa – desa tersebut ditentukan secara sengaja dengan pertimbangan bahwa desa tersebut merupakan desa sentra pertanaman jambu biji merah di Kabupaten Deli Serdang. Setiap lokasi sampel memiliki bentuk dan luas lahan yang berbeda, maka ditetapkan untuk menyamakan semua ukuran luas lahan setiap lokasi sampel pengambilan lalat buah yakni 2500 m2.
2. Persiapan Atraktan Olahan Limbah Kakao
Pengolahan Limbah kakao cair mengacu pada metode Lloyd & Drew (1997) dan Indriyanti et al. (2014) yang dimodifikasi.Limbah kakao cair dikumpulkan dari Perkebunan Rakyat di Kecamatan Sibiru-biru. Limbah kakao cair berasal dari pulp buah kakaoyang meluruh akibat fermentasi alami.Limbah kakao cair diambil sebanyak 300 ml kemudian dipanaskan sambil diaduk hingga volume menjadi setengahnya.Limbah diukur pH-nya menggunakan pH meter, lalu dinetralkan dengan larutan natrium hidroksida (NaOH) sampai pH mendekati 6-7.
Ditambahkan 0.3% NaCl sebagai pengawet dan0.1%enzim papain untuk mendegradasi protein. Limbah diaduk hingga rata kemudian dipanaskan di dalam oven pada suhu 50°C selama 2 jam.
3. Uji Kadar Protein dan Glukosa Olahan Limbah Kakao
Limbah kakao yang telah diolah kemudian diuji kadar protein dan glukosa di Laboratorium Biokimia FMIPA USU (Lampiran 4), dengan metode Kjeldahl untuk pengujian protein, yaitu dimasukkan sampel ke dalam DigiTube, kemudian ditambahkan 15 ml H2SO4 98% dan 0.2 g selenium mixture. Didestruksi dengan DigiPREP HT selama 2 jam sampai diperoleh larutan bening. Didestilasi hasil destruksi dengan DigiPREP Distillation System.Dititrasi dengan HCL 0.1 N sampai diperoleh warna ungu. Titrasi blanko asam borat dengan HCL 0.1 N dilakukan sampai diperoleh warna ungu. Kemudian dicatat volume yang terpakai dan dihitung kadar protein dengan rumus:
% Protein =(V. titrasi − V. blanko) X NHCL X 14.008 X 6.25
massa sampel X 100%
MetodeLuff Schoorl untuk pengujian glukosa, yaitu ditimbang sampel sebanyak 2 gram.Lalu larutkan sampel dengan aquades dalam labu takar 50 ml.
Diambil 10 ml larutan dengan pipet volume kemudian masukkan dalam Erlenmeyer.Ditambahkan 25 ml reagent Luff Schoorl dan air suling, kemudian dipanaskan selama 3 menit dan dibiarkan selama 10 menit.Ditambahkan 15 ml KI 20% dan 25 ml H2SO4 25% perlahan, kemudian dititrasi dengan larutan Na2SO3
0.1 N sampai kuning pucat. Ditambahkan indikator amilum 0.5% dititrasi lagi sampai putih susu. Dicatat volume titrasi kemudian dihitung kadar glukosa dengan rumus:
% Glukosa =Angka Tabel X Faktor Pengenceran
massa sampel X 1000 X 100%
Kapas Atraktan 4. Pengumpulan Sampel Lalat Buah Di Lapangan
Pengumpulan sampel lalat buah dengan menggunakan perangkap Steiner yang dimodifikasi dan diberi atraktan.Perangkap dibuat dengan menggunakan wadah plastik (1 kg)dicat kuning, dan didalamnya diletakkan kapas untuk tempat atraktan.Pemberian atraktanpada kapas dengan jarum suntik sesuai masing-masing perlakuan danakan diulang setiap pengambilan sampel.Bentuk perangkap dapat dilihat pada Gambar 2.
(a) (b)
Gambar 2. (a). Bentuk perangkap yang terlihat dari sisi luar; (b) Bentuk perangkap yang terlihat dari sisi dalam.
Pemasangan perangkap dilakukan pada pukul 07.00 WIB.Perangkap dipasang dengan metode irisan diagonal zig zag yakni menentukan secara acak tempat perangkap lalat buahpada pertanaman jambu biji merah disetiap lokasi pengambilan sampel (Lampiran 5), jarak antar perangkap± 20 m disesuaikan dengan jarak tanam yang berbeda ditiap lokasi. Jumlah perangkap yang akan dipasang disetiap lokasi sampel sebanyak 9 buah dan total perangkap diseluruh lokasi sampel adalah 45 perangkap. Perangkapdigantungkan padacabangpohon yang ternaungi (kanopi) pada ketinggian ± 1 – 1.5 m di atas permukaan tanah.
Pengumpulan lalat buah dilakukan seminggu sekali sebanyak 8x.Lalat buah Kait
gantungan
Lubang Masuk
70%,serta diberi nomor sampel,perlakuan, lokasi, tanggal pengambilan.Kemudian sampel dibawa ke laboratorium untuk diidentifikasi.
5. PengambilanBuah yang Terserang
Diambil 5 buah yang terserang secara purposive random sampling sebanyak 4x dengan interval waktu 2 minggu pada setiap lokasi sampel.Buah yang telah dikumpulkan dimasukkan dalam kantung plastik, diberi label lokasi, tanggal pengambilan dan dibawa ke laboratorium.Buah yang terserang dimasukkan ke dalam wadah plastik dengan media pasir dan ditutup kain kasa.Buah diamati setelah 7 hari, untuk mendapatkan pupa lalat buah maka pasir diayaksetiap dua hari sekaliselama 14 hari. Pupa lalat buah yang terkumpul ditempatkan pada wadahplastik lain yang ditutup dengan kain kasa (Astriyani, 2014).
Imago lalat buah dan parasitoid yang muncul diberipakan berupa larutan madu sampai imagoberumur tiga hari.Kemudian dimatikan dengan dimasukkan dalam lemari pendingin, selama 5-10 menit.Kemudian dikoleksi dalam botol yang berisi alkohol 70% dan diidentifikasi.
6. Identifikasi Morfologi
Imago lalat buah dan parasitoid yang telah ditemukandiidentifikasi secara morfologi meliputi caput, toraks, sayap, dan abdomen, dengan menggunakan mikroskop dan dibantu dengan buku identifikasi lalat buah, yakni: The Australia Handbook For The Identification Of Fruit Flies(Drew, 2016); Taksonomi dan Bioekologi Lalat Buah Penting Bactrocera spp. di Indonesia(Siwi et al., 2006);
Tephritid Flies(White, 1988), Hymenoptera Of The World An Identification Guide To Families(Goulet & Huber, 1993), serta agar identifikasi ini lebih akurat maka
untuk konfirmasi dilakukan juga identifikasi di Laboratorium Pusat Penelitian Biologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), Cibinong, Bogor.
7. Karakteristik Molekuler (PCR - RAPD) Imago Lalat Buah 7.1. Ekstraksi DNA
Untuk melihat karakteristik molekuler, pengambilan spesies lalat buah mengikuti penelitian sebelumnya oleh Pramudi et al. (2013) yakni diambil setiap spesies lalat buah sebanyak20 ekor secara acak dari setiap lokasi pertanaman sampel.Untukteknik ekstraksi DNA lalat buah berdasarkan metode yang tertera pada Wizard Genomic DNA (Lampiran 6), yakni: lalat buah digerus dalam Nuclei lysissolution dingin dengan menggunakan mortar sampai halus. Dimasukkan kedalam tube dan ditambahkan Nuclei Lysis Solution dan divortex 10 detik.Lalu diinkubasi pada suhu 650C selama 15-30 menit.Ditambahkan 3 μlRNase Solution kedalam nuclei lysate jaringan dan proteinase K 17.5 μl.Dicampurkan dengan membalik tabung 2-5 kali, kemudian diinkubasi pada suhu 370C selama 15-30 menit.Sampel dibiarkan dingin dalam suhu ruang.Protein Precipitation Solution 200 μl ditambahkan, divortex selama 20 detik.Lalu disentrifugasi selama 4 menit dengan kecepatan 14.000*g. Supernatan dibuang, pelet larutan dipindahkan kedalam tabung yang berisi 600 μl isopropanol suhu ruang.Larutan dicampurkan dengan perlahan.Kemudian disentrifugasi selama 3 menit dengan kecepatan 14.000*g.
Supernatan dibuang, ditambahkan 600 μl 70% ethanol pada suhu ruang dan campurkan perlahan.Selanjutnya disentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 14.000*g. Ethanol dibuang dan pellet dikeringkan selama 15
menit.DNA rehydration solution 100 μl ditambahkan dan diinkubasi pada suhu 650C selama 1 jam, DNA disimpan pada suhu 40C.
7.2. Amplifikasi DNA
DNA hasil ekstraksi diamplifikasi dengan teknik PCR-RAPD, dengan menggunakan lima primerberdasarkan dari penelitian sebelumnya oleh Pramudi et al. (2013) yang berasal dari Macrogen, yaitu Primer OPC-01 (TTCGAGCCAG), OPI-17 (GGTGGTGATG), OPL-07 (AGGCGGGAAC), OPL-08 (AGCAGGTGGA), OPL-16 (AGGTTGCAGG). Campurkan 10 μl go taq green master mix, 2 μl primer, 2μl DNA lalat buah dan 6 μlnucleifreewaterke dalam PCR tube, kemudian dimasukkan ke dalam mesin PCR yang sudah diprogram untuk 45 siklus pada kondisi, yakni predenaturasi 940C selama 2 menit, denaturasi 940C selama 1 menit, annealing 370C selama 1 menit, extension 720C selama 1 menit, dan final extension 720C selama 5 menit.
7.3. Elektroforesis Gel Agarose
Sebanyak4 μl DNA lalat buah hasil PCR dicampur dengan 2 μlloading dye, kemudian dimasukkan juga 2 μl 100 bp DNA ladder kedalam gel agarose 1.5% yang diwarnai dengan etidium bromida dalam buffer TAE 1X.Selanjutnya dielektroforisispada 80 Volt selama 120 menit.Kemudian divisualisasi dalam UV-illuminator agar terlihat pita DNA yang dihasilkan.
7.4. Sekuensing
Spesies lalat buah yang masih ragu diidentifikasi secara morfologi, dilanjutkan dengan mengidentifikasi berdasarkan sekuen DNA.Sekuensing DNA dilakukan untuk mengetahui urutan nukleotida pada daerah cox1.Sekuensing dilakukan oleh Macrogendi Korea.
8. Peubah Amatan
8.1 Populasi Lalat Buah Dilapangan
Dihitung jumlah imago lalat buah yang terperangkap pada masing-masing perangkap di lima lokasi pertanaman jambu biji Kabupaten Deli Serdang.
8.2 Identifikasi Lalat Buah dan Parasitoid
Diidentifikasi imago lalat buah yang terperangkap, identifikasi dilakukan sampai tingkat spesies, menggunakan kunci identifikasi lalat buah yang dibantu dengan mikroskop.
8.3 Tingkat Parasitasi
Perhitungan tingkat parasitisasi setiap parasitoid yang berasosiasi dipertanaman jambu biji merah, menggunakan rumus (Herlianadewi, 2013).
TP = ∑ A
∑ B + Σ A X 100%
Keterangan : TP = Tingkat parasitisasi
A = Jumlah parasitoid yang muncul
B = Jumlah imago Lalat Buahyang muncul.
8.4 Analisis Secara Molekuler Lalat Buah
Data molekuler yang dianalisis diubah ke dalam bentuk data biner berdasarkan ada dan tidaknya pita hasil amplifikasi.Jika terdapat pita diberi nilai 1, sedangkan jika tidak ada diberi nilai 0.Matriks jarak atau ketidaksamaan genetik untuk semua kombinasi pasangan individu dapat dianalisis dengan Neighbour-Joining Tree (NJtree) untuk memperoleh gambaran dari kekerabatan diantara individu-individu.Perhitungan dan analisis deskriptif ini menggunakan software DARwin Softwere Versi 6 (Perreira dan Jacquemoud-Collet, 2014).
8.5 Analisis Sekuensing
Data hasil sekuensing berupa ABI file dari Bactrocera sp.dan B.kinabaludimasukkan dalam BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) NCBI untuk melihat homologi dengan spesies koleksi GenBank.
8.6 Data Pendukung
Data survei lahan petani jambu biji merah di Kabupaten Deli Serdang.Data analisis kadar protein dan glukosa dalam olahan limbah kakao sebagai atraktan.
Data suhu dan kelembaban yang diambil menggunakan alat thermohigrometer di lima lokasi pertanaman jambu biji merah Kabupaten Deli Serdang. Data curah hujan dari BMKG untuk wilayah Kabupaten Deli Serdang.
Rataan Jumlah Lalat Buah (ekor)