BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.3 Analisis Rifampisin, Isoniazid dan Pirazinamid
Menurut organisasi kesehatan dunia (world health organization (WHO)) tahun 2006, tablet campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid dapat ditentukan kadarnya secara kromatografi cair kinerja tinggi. Untuk isoniazid dan pirazinamid dapat ditentukan kadarnya secara kromatografi cair kinerja tinggi menggunakan kolom L1 (oktadesil silana yang terikat secara kimiawi pada partikel mikro keramik) diameter kolom 4,6 mm, panjang kolom 15 cm, diameter ukuran partikel 5 µm dengan campuran fase gerak, yakni: 50 g amonium asetat dalam 1000 mL air yang kemudian ditambahkan asam asetat glasial sampai pH 5 (fase gerak A) dan metanol (fase gerak B) dengan perbandingan kedua campuran 94:6 yang laju alir (flow rate) 2 mL/menit dan deteksi dilakukan pada panjang gelombang 240 nm. Ekstraksi sampel dilakukan dengan menggunakan air. Untuk rifampisin ditentukan kadarnya secara terpisah secara kromatografi cair kinerja tinggi menggunakan kolom L1 (oktadesil silana yang terikat secara kimiawi pada partikel mikro keramik) diameter kolom 4,6 mm, panjang kolom 25 cm, diameter ukuran partikel 5 µm dengan campuran fase gerak, yakni: dapar fosfat pH 7 (kalium dihidrogen fosfat (0,1 mol/L) yang disesuaikan pH dengan natrium hidroksida (0,01 mol/L)) (fase gerak A) dan metanol (fase gerak B) dengan perbandingan kedua campuran 4:6 yang laju alir (flow rate) 1 mL/menit dan deteksi dilakukan pada panjang gelombang 254 nm. Ekstraksi sampel dilakukan dengan menggunakan metanol.
Menurut Farmakope Amerika Serikat edisi ketiga puluh (United States Pharmacopoeia 30th Edition (USP XXX)) tahun 2007, tablet campuran rifampisin, isoniazid dan pirazinamid dapat ditentukan kadarnya secara
kromatografi cair kinerja tinggi. Untuk Rifampisin, Isoniazid, Pirazinamid dapat ditentukan kadarnya secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi menggunakan kolom L1 (oktadesil silana yang terikat secara kimiawi pada partikel mikro keramik) diameter kolom 4,6 mm, panjang kolom 25 cm, diameter ukuran partikel 5 µm dengan fase gerak campuran larutan dapar fosfat pH 6,8 dan asetonitril (96:4) (fase gerak A) dan campuran larutan dapar fosfat pH 6,8 dan asetonitril (55:45) (fase gerak B) dengan perbandingan kedua campuran yang berubah-ubah (sistem gradien) (dapat dilihat pada Tabel 2.1) yang laju alir (flow rate) 1,5 mL/menit dan deteksi dilakukan pada panjang gelombang 238 nm. Ekstraksi sampel dilakukan dengan menggunakan dapar fosfat pH 6,8.
Tabel 2.1. Perubahan perbandingan fase gerak (USP XXX, 2007).
Waktu (menit) Fase Gerak A Fase Gerak B Elusi
0 100 0 setimbang
0-5 100 0 isokratik
5-6 100→0 0→100 gradien linear
6-15 0 100 isokratik
Menurut Dorneanu tahun 2010, campuran rifampisin, isoniazid dan etambutol dapat ditentukan dengan dapat ditentukan kadarnya secara kromatografi cair kinerja tinggi fase balik dengan menggunakan kolom Phenomenex Luna 100-5 C18, diameter kolom 4,6 mm, panjang kolom 2100-5 cm, diameter ukuran partikel 100-5 µm dengan fase gerak campuran larutan dapar asetat pH 5 dan metanol (80:20) (fase gerak A) dan campuran larutan asam oksalat 0,01 M dan asetonitril (30:70) (fase gerak B) dengan perbandingan kedua campuran fase gerak tersebut yang berubah-ubah (sistem gradien) (dapat dilihat pada Tabel 2.2) yang laju alir (flow rate) 1 mL/menit dan deteksi dilakukan pada panjang gelombang 270 nm (untuk isoniazid dan etambutol) selama 9 menit dan diubah menjadi 320 nm (untuk
rifampisin) hingga selesai analisis. Perubahan panjang gelombang dilakukan pada waktu 9 menit hingga 9,1 menit. Analisis untuk setiap sampel memerlukan waktu 30 menit dan untuk menyetimbangkan sistem diperlukan waktu 8 menit. Sampel diektraksi, dengan cara: sediaan dilarutkan dengan 10 mL metanol dalam labu tentukur 50 mL, disonikasi selama 10 menit, didinginkan, ditambahkan dengan air hingga garis tanda dan dikocok. Campuran disaring, dipipet filtrat 5 mL, dimasukkan kedalam labu tentukur 25 mL, diencerkan dengan air hingga garis tanda, dikocok dan kemudian sampel dapat dianalisis. Metode divalidasi dengan beberapa pengujian, antara lain: uji akurasi dengan parameter persentase perolehan kembali (recovery percentage (% recovery)), uji presisi dengan parameter simpangan baku relatif (relative standard deviation (RSD)), linearitas, batas deteksi, batas kuantitasi, rentang, selektivitas dan kekuatan.
Tabel 2.2. Perubahan perbandingan fase gerak (Dorneanu, 2010).
Waktu (menit) Fase Gerak A Fase Gerak B Elusi
0 100 0 setimbang
0-6,5 100 0 isokratik
6,5-15 100→50 0→50 gradien linear
15-22 50→0 50→100 gradien linear
Menurut Dionex tahun 2010, untuk penetapan kadar rifampisin, isoniazid, pirazinamid dan etambutol secara kromatografi cair kinerja tinggi fase normal dengan menggunakan kolom Acclaim Polar Advantage II diameter kolom 4,6 mm, panjang kolom 15 cm, temperatur kolom 35oC, diameter ukuran partikel 3 µm dengan fase gerak campuran 8% asetonitril dalam larutan NaH2PO4 20 mM (1,5 mL trietilamin per liter) pH 6,8 (fase gerak A) dan 50% asetonitril dalam larutan NaH2PO4 20 mM (1,5 mL trietilamin per liter) pH 6,8 (fase gerak B) dengan perbandingan kedua campuran fase gerak tersebut yang berubah-ubah
(sistem gradien) (dapat dilihat pada Tabel 2.3) yang laju alir (flow rate) 1 mL/menit dan deteksi dilakukan pada panjang gelombang 200 nm dan 238 nm. Sampel diektraksi, dengan cara: satu tablet dimasukkan dalam gelas beker 50 mL, ditambahkan 5 mL asetonitil dan 20 mL fase gerak A, diaduk, disonikasi hingga larut, dimasukkan kedalam labu tentukur 100 mL, ditambahkan dengan fase gerak A hingga garis tanda dan dikocok. Campuran disaring, dipipet filtrat 0,75 mL, dimasukkan kedalam labu tentukur 10 mL, diencerkan dengan fase gerak A hingga garis tanda, dikocok dan kemudian sampel dapat dianalisis. Analisis untuk setiap sampel memerlukan waktu 10,5 menit. Metode divalidasi dengan beberapa pengujian, antara lain: uji akurasi dengan parameter persentase perolehan kembali (recovery percentage (% recovery)), uji presisi dengan parameter (simpangan baku relatif (relative standard deviation (RSD)) dan linearitas.
Tabel 2.3. Perubahan perbandingan fase gerak (Dionex, 2010).
Waktu (menit) Fase Gerak A Fase Gerak B Elusi
0 100 0 setimbang
3 100 0 isokratik
3-3,5 100→0 0→100 gradien linear
3,5-10,5 0 100 isokratik
Menurut Song dan kawan-kawan tahun 2007, rifampisin, isoniazid, pirazinamid, etambutol dan dua metabolit utamanya (yakni: asetilisoniazid dan 25-desasetilrifampisin) dapat ditentukan kadarnya dari dalam darah untuk monitoring terapi obat secara kromatografi cair kinerja tinggi tandem spektrometri massa (KCKT/SM/SM) menggunakan kolom Hydrosphere C18, diameter kolom 3 mm, panjang kolom 5 cm, diameter ukuran partikel 3 µm dengan fase gerak campuran asam format 0,3% dalam metanol (fase gerak A) dan asam format 0,3% dalam air (fase gerak B) dengan perbandingan kedua campuran fase gerak tersebut
yang berubah-ubah (sistem gradien) (dapat dilihat pada Tabel 2.4). Laju alir (flow rate) juga berubah-ubah selama analisis (sistem gradien), yakni: 0,15 mL/menit selama 1,8 menit kemudian berubah menjadi 0,4 mL/menit dalam waktu 0,2 menit (hingga 2 menit) selanjutnya dipertahankan selama 2 menit (hingga 4 menit). Deteksi dilakukan pada mode ion positif dan hanya memerlukan waktu 4 menit untuk analisis setiap sampelnya. Pada penelitian ini digunakan baku dalam (internal standard), yakni: rifabutin dan asam 6-aminonikotinat. Serta dilakukan uji validasi terhadap metode ini, yang mencakup: uji akurasi dengan parameter persentase perolehan kembali (recovery percentage (% recovery)), uji presisi dengan parameter simpangan baku relatif (relative standard deviation (RSD)), batas deteksi, batas kuantitasi dan linearitas. Sampel dipersiapkan dengan dua tahap pengendapan protein, yakni: metanol 50% selama 20 menit dan metanol 100% selama 20 menit selanjutnya dilakukan penyaringan kemudian filtrat yang diperoleh dapat digunakan dianalisis. Pada penelitian ini didapatkan bahwa puncak isoniazid, pirazinamid, etambutol, asetilisoniazid dan 6-aminonikotinat masih tumpang tindih. Begitu pula dengan puncak rifampisin dan 25-desasetilrifampisin juga masih tumpang tindih. Hanya puncak rifabutin yang terpisah dengan baik dengan puncak yang lainnya. Akan tetapi, dengan kromatografi cair kinerja tinggi tandem spektrometri massa (KCKT/SM/SM) dilakukan pendeteksian dengan mode pemantauan reaksi berganda (multiple reaction monitoring (MRM)), maka setiap senyawa akan dideteksi sebagai kromatogram yang terpisah (masing-masing).
Tabel 2.4. Perubahan perbandingan fase gerak (Song, 2007).
Waktu (menit) Fase Gerak A Fase Gerak B Elusi
0 60 40 setimbang
1,8 60 40 isokratik
1,8-2 60→80 40→20 gradien linear
2-3 80→60 20→40 gradien linear
3-4 60 40 isokratik