BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.5 Kromatografi
2.5.1 Kromatografi Cair
2.5.1.3 Konsep Umum Kromatografi Cair
Komponen yang telah terpisah dalam sistem kromatografi cair kinerja tinggi akan dibawa oleh fase gerak menuju ke detektor dan sinyal yang terekam oleh detektor disebut sebagai puncak, sedangkan keseluruhan puncak yang direkam oleh detektor selama proses analisis dinamakan dengan kromatogram. Puncak yang direkam oleh detektor akan diperoleh selama analisis memiliki dua informasi yang sangat penting, yakni: informasi kualitatif dan juga informasi kuantitatif (Meyer, 2004).
2.5.1.3.1 Waktu Tambat (tR
Waktu tambat atau retention time (t
)
R
Sebuah puncak memiliki tinggi puncak (h) dan lebar puncak (W
) adalah periode waktu yang dilalui dari penyuntikan sampel hingga diperoleh rekaman signal maksimum. Waktu tambat suatu zat selalu konstan pada kondisi kromatografi yang sama. Hal ini dijadikan suatu dasar analisis kualitatif. Suatu puncak kromatografi dapat diidentifikasi dengan membandingkan waktu tambatnya terhadap baku (Meyer, 2004).
b). Lebar puncak yang diukur biasanya merupakan lebar pada 5% tinggi puncak (W0,05). Tinggi dan luas puncak berkaitan secara proporsional atas kadar ataupun jumlah analit tertentu yang terdapat dalam sampel (memiliki informasi kuantitatif). Namun demikian luas puncak lebih umum digunakan dalam proses analisis, karena lebih akurat dan lebih cermat daripada perhitungan menggunakan tinggi puncak (Ornaf dan Dong, 2005). Kromatogram dari kromatografi cair kinerja tinggi dapat dilihat pada Gambar 2.5.
Gambar 2.5. Kromatogram puncak tunggal yang diperoleh dari analisis kromatografi cair kinerja tinggi (Ornaf dan Dong, 2005).
Gambar 2.6. Kromatogram dua puncak yang diperoleh dari analisis kromatografi cair kinerja tinggi (Meyer, 2004).
Pada Gambar 2.6, dapat dilihat bahwa, w adalah lebar puncak dan t0 disebut waktu hampa (void time/dead time), yaitu: waktu tambat pelarut yang tidak tertahan atau waktu yang dibutuhkan oleh fase gerak untuk melewati kolom (breakthrough time) (Meyer, 2004).
Menurut Meyer tahun 2004, waktu tambat dipengaruhi oleh laju alir (μ) dan
panjang kolom (L). Jika laju alir lambat atau kolom panjang, maka tR
Waktu tambat dipengaruhi oleh laju alir (μ) dapat dihitung dengan menggunakan
rumus:
� = � ��
akan semakin besar dan sebaliknya.
2.5.1.3.2 Faktor Kapasitas (k’)
Menurut Ornaf dan Dong tahun 2005, Faktor kapasitas (k’) merupakan suatu ukuran derajat tambatan dari analit yang tidak dipengaruhi laju alir dan panjang kolom. Faktor kapasitas dihitung dengan membagi waktu tambat bersih (t’R) dengan waktu hampa (t0
Faktor kapasitas juga disebut sebagai faktor tambat (k) dalam beberapa literatur lainnya. Idealnya, analit yang sama jika diukur pada dua instrumen berbeda dengan ukuran kolom yang berbeda namun memiliki fase diam dan fase gerak yang sama, maka faktor kapasitas dari analit pada kedua sistem kromatografi cair kinerja tinggi tersebut secara teoritis adalah sama (Kazakevich dan LoBrutto, 2007).
) seperti yang dapat dilihat pada rumus berikut ini:
�′ = �′� �0 =
�� − �0
�0
Faktor kapasitas yang disukai berada diantara nilai 1 hingga 10. Jika nilai faktor kapasitas terlalu kecil menunjukkan bahwa analit terlalu cepat melewati kolom sehingga tidak terjadi interaksi antara analit dengan fase diam dan oleh karena itu, tidak akan muncul didalam kromatogram. Sebaliknya jika faktor
kapasitas terlalu besar maka akan mengindikasikan waktu analisis yang panjang (Meyer, 2004). Nilai faktor kapasitas dari analit yang lebih kecil dari 1 dan juga lebih besar dari 20 akan menjadi masalah dalam analisis menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi (Ornaf dan Dong, 2005)
2.5.1.3.3 Selektivitas (α)
Menurut Kazakevich dan LoBrutto tahun 2007, Selektifitas (α) adalah
kemampuan sistem kromatografi untuk membedakan analit yang berbeda. Selektifitas ditentukan sebagai rasio perbandingan faktor kapasitas (k’) dari analit yang berbeda:
� = �2
�1 =
��2 − �0
��1 − �0
Nilai selektifitas yang didapatkan dalam sistem kromatografi cair kinerja tinggi harus lebih besar dari 1. Seletivitas juga dikenal sebagai faktor pemisahan atau tambatan relatif (Ornaf dan Dong, 2005).
Proses pemisahan antara dua komponen dalam kromatografi cair kinerja tinggi hanya dimungkinkan bila kedua komponen memiliki kecepatan yang berbeda dalam melewati kolom (Ornaf dan Dong, 2005). Kemampuan sistem kromatografi dalam memisahkan atau membedakan analit yang berbeda dikenal sebagai selektivitas. Selektivitas umumnya bergantung kepada sifat analit tersebut dan interaksi antara analit dengan permukaan fase diam dan fase gerak. Jenis fase gerak seperti metanol dan asetonitril juga diketahui dapat mempengaruhi sifat selektivitas (Kazakevich dan LoBrutto, 2007).
Gambar 2.7. Kromatogram hasil analisis kromatografi cair kinerja tinggi dengan berbagai selektifitas dan efisiensi (Kazakevich dan LoBrutto, 2007).
2.5.1.3.4 Efisiensi Kolom (N)
Ukuran kuantitatif dari efisiensi kolom disebut sebagai nilai lempeng (plate number) atau N (Ornaf dan Dong, 2005). Menurut Kazakevich dan LoBrutto tahun 2007, Efisiensi adalah ukuran tingkat penyebaran puncak dalam kolom. Efisiensi kolom ditunjukkan dari jumlah lempeng teoritikal atau theoretical plates
(N), yang dapat dihitung dengan rumus:
Menurut Snyder dan Kirkland tahun 1979, kolom yang efisien adalah kolom yang mampu menghasilkan pita sempit dan memisahkan dengan baik setiap analit dalam campuran (sampel). Nilai lempeng akan semakin tinggi jika ukuran kolom semakin panjang, hal ini berarti proses pemisahan yang terjadi semakin baik. Hubungan yang proporsional antara nilai lempeng pengan panjang kolom disebut sebagai tinggi setara dengan lempeng teoritikal (Height Equivalent of a Theoritical Plate atau HETP atau H) dan dapat dihitung dengan menggunakan rumus:
� = � �
Tujuan utama dari analisis kromatografi cair kinerja tinggi secara praktik adalah untuk mendapatkan nilai lempeng teoritis yang maksimum, tinggi setara setara dengan lempeng teoritikal yang minimum dan efisiensi kolom yang tertinggi (Snyder dan Kirkland, 1979).
2.5.1.3.5 Resolusi (Rs
Menurut Ornaf dan Dong tahun 2005, Resolusi (Rs) merupakan derajat pemisahan dari dua puncak analit yang berdekatan. Resolusi dapat didefinisikan sebagai perbedaan waktu tambat antara dua puncak dibagi dengan rata-rata lebar kedua puncak. Oleh karena itu resolusi dapat dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut ini:
� = ��2 − ��1 �(�2 − �1) 2 � = 2 × ��2 − ��1 �2 − �1 = 1,18 × ��2 − ��1 �1 22 − �1 22 )
Pemisahan yang terpisah dengan sempurna telah dapat terlihat bila resolusi setara dengan 1. Akan tetapi, pada analisis kuantitatif, resolusi yang ditunjukkan
harus lebih besar dari 1,5. Sementara itu, bila kedua puncak yang berdekatan memiliki perbedaan ukuran yang signifikan, maka diperlukan nilai resolusi yang lebih besar (Meyer, 2004).
2.5.1.3.6 Faktor Ikutan (Tf) dan Faktor Asimetri (As
Idealnya, puncak kromatogram akan memperlihatkan bentuk Gaussian dengan derajat simetris yang sempurna (Ornaf dan Dong, 2005). Namun kenyataannya, puncak yang simetris secara sempurna jarang dijumpai (bentuk Gaussian seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2.8). Jika diperhatikan secara cermat, maka hampir setiap puncak dalam kromatografi memperlihatkan tailing (Dolan, 2003). Pada Gambar 2.8, ditunjukkan tiga jenis bentuk puncak.
)
Gambar 2.8. Bentuk puncak kromatogram (Meyer, 2004).
Pengukuran derajat asimetris puncak dapat dihitung dengan 2 cara, yakni: faktor ikutan atau tailing factor (Tf) dan faktor asimetris. Faktor ikutan atau
tailing factor (Tf) seperti yang diterangkan dalam Farmakope Amerika Serikat edisi ketiga puluh (United States Pharmacopoeia 30th Edition (USP XXX)) tahun 2007 dihitung dengan menggunakan lebar puncak pada ketinggian 5% (W0,05), rumusnya dituliskan sebagai berikut:
�� = � + �
Dengan nilai a dan b merupakan setengah lebar puncak pada ketinggian 5% seperti yang ditunjukkan di Gambar 2.9.
Gambar 2.9. Pengukuran derajat asimetris puncak (Dolan, 2003). Sedangkan faktor asimetri (As
Akan tetapi, nilai a dan b dalam perhitungan faktor asimetri merupakan setengah lebar puncak pada ketinggian 10% seperti yang ditunjukkan di Gambar 2.9. Jika nilai a sama dengan b, maka faktor tailing dan asimetri bernilai 1. Kondisi ini menunjukkan bentuk puncak yang simetris sempurna (Dolan, 2003). Bila puncak berbentuk tailing, maka kedua faktor ini akan bernilai lebih besar dari 1 dan sebaliknya bila puncak berbentuk fronting, maka faktor tailing dan asimetri akan bernilai lebih kecil dari 1 (Hinshaw, 2004).
) dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut:
�� = � �
2.5.1.4 Instrumen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Instrumen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi terdiri atas 6 bagian (dapat dilihat pada Gambar 2.10), yakni: wadah fase gerak (reservoir), pompa (pump), tempat injeksi sampel (injector), kolom (column), detektor (detector) dan perekam (recorder) (McMaster, 2007).
Gambar 2.10. Instrumen dasar kromatografi cair kinerja tinggi (McMaster, 2007).
2.5.1.4.1 Wadah Fase Gerak (Reservoir)
Wadah fase gerak menyimpan sejumlah fase gerak yang secara langsung berhubungan dengan sistem (Meyer, 2004). Wadah haruslah bersih dan inert, seperti botol pereaksi kosong maupun labu gelas. Adalah hal yang penting untuk menghilangkan gelembung udara (sonikasi atau degassing) fase gerak sebelum digunakan karena gelembung gas kecil dalam fase gerak dapat terkumpul di kepala pompa (pump head)ataupun detektor sehingga akan mengganggu kondisi kromatografi cair kinerja tinggi (Brown dan DeAntonis, 1997).
2.5.1.4.2 Pompa (Pump)
Pompa yang digunakan pada kromatografi cair kinerja tinggi haruslah merupakan instrumen yang kokoh untuk menghasilkan tekanan tinggi hingga 350 bar atau bahkan 500 bar. Tipe pompa yang umum digunakan adalah pompa piston bersilinder pendek (short-stroke piston pump). Laju alir dapat bervariasi dari 0,1 mL/menit hingga 5 mL/menit atau 10 mL/menit. Pompa terdiri dari motor, piring putar (rotating disk/cam), piston dan katup periksa (check valve). Piston dapat terbuat dari batu safir ataupun keramik, sedangkan bola yang terdapat didalam katup periksa (check valve) terbuat dari batu rubi, sedangkan dudukan (seat) terbuat dari batu safir. Kebanyakan pompa saat ini telah memiliki saluran pembilas yang biasanya air dapat bersirkulasi. Larutan ini berfungsi untuk membilas piston agar bersih dari garam dapar atau materi yang bersifat abrasif dari pengunci piston atau piston seal (Meyer, 2004). Jenis pompa yang lain adalah pompa pengganti positif (positive displacement pump) dan pompa pembesar pneumatik (pneumatic amplifier pump) (Snyder dan Kirkland, 1979).
2.5.1.4.3 Tempat Injeksi Sampel (Injector)
Ada 3 jenis macam tempat injeksi sampel atau injektor (injector), yakni: tempat injeksi sampel syringe(syringe injector), katup sampling (sampling valve) dan tempat injeksi sampel otomatik (automatic injector). Tempat injeksi sampel syringe (syringe injector) merupakan bentuk tempat injeksi sampel atau injektor (injector) yang paling sederhana (Snyder dan Kirkland, 1979).
Gambar 2.11. Katup sampling (sampling valve) atau tempat injeksi sampel manual (manual injector) (Meyer, 2004).
Katup sampling (sampling valve) atau tempat injeksi sampel manual (manual injector) mengandung 6 katup saluran dilengkapi dengan rotor, lengkungan sampel (sample loop) dan celah jarum suntik (needle port). Larutan sampel akan disuntikkan kedalam lengkungan sampel (sample loop) dengan jarum suntik gauge pada posisi “masuk (load)” dan larutan sampel yang ada di lengkungan sampel (sample loop) kemudian akan dialirkan ke kolom dengan memutar rotor ke posisi “injek (inject)”. Ukuran lengkungan sampel (sample
loop) eksternal bervariasi antara 6 μL hingga 2 mL (Ornaf dan Dong, 2005).
Tempat injeksi sampel otomatik (automatic injector) atau disebut juga
autosampler memiliki prinsip yang mirip, hanya saja sistem pemasukkan sampelnya bekerja secara otomatis (Meyer, 2004).
2.5.1.4.4 Kolom (Column)
Kolom merupakan jantung atau bagian yang terpenting dari suatu instrumen kromatografi cair kinerja tinggi karena proses pemisahan terjadi didalam kolom. Kolom umumnya terbuat dari baja anti karat dengan tingkat 316 (316 grade stainless steel) dan dikemas dengan fase diam tertentu. Ukuran panjang kolom untuk tujuan analitik berkisar antara 10 cm hingga 25 cm dan diameter dalam berkisar 3 mm hingga 9 mm (Brown dan DeAntonis, 1997). Sedangkan untuk tujuan preparatif panjang berkisar antara 30 cm atau lebih dan diameter dalam berkisar 10 mm hingga 25,4 mm (Meyer, 2004).
2.5.1.4.5 Detektor (Detector)
Karakteristik detektor yang baik adalah sensitif, batas deteksi rendah, respon yang linier, mampu mendeteksi solut secara universal, tidak destruktif, mudah dioperasikan, memiliki volume pendeteksian (dead volume) yang kecil dan tidak sensitif terhadap perubahan temperatur serta kecepatan fase gerak (Hamilton dan Sewell, 1977). Beberapa detektor yang paling sering digunakan dalam kromatografi cair kinerja tinggi adalah detektor spektrofotometri
ultraviolet/visible, photodiode-array (PDA), fluoresensi, spektrometri massa, indeks bias dan elektrokimia (Rohman dan Gandjar, 2007).
2.5.1.4.6 Perekam atau Rekorder (Recorder)
Alat pengumpul data seperti komputer, integrator dan rekorder dihubungkan ke detektor. Alat ini akan menangkap sinyal elektronik dari detektor
dan memplotkannya kedalam kromatogram sehingga dapat dievaluasi oleh analis (Brown dan DeAntonis, 1997).