BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA
2.6 Analisis DNA
Analisis DNA dapat dilakukan dengan menggunakan berbagai metode diantaranya yaitu :
2.6.1 Pemisahan Menggunakan Gel
Teknik dasar pemisahan DNA dan RNA menggunakan elektroforesis pada sistem gel berdasarkan prinsip perbedaaan ukuran. DNA dan RNA pada pH netral bermuatan negatif dan akan bermigrasi ke arah anoda. Pada saat migrasi pada matriks polimer gel, maka fragmen kecil akan bergerak lebih cepat daripada fragmen yang besar. Migrasi elektroforetik melalui gel akan dapat memisahkan campuran fragmen DNA sehingga tampak sebagai pita-pita yang berbeda ukurannya. Matriks gel yang dapat dipakai untuk pemisahan asam nukleat diantaranya yaitu gel agarosa dan gel poliakrilamid. Gel agarosa dapat digunakan untuk pemisahan fragmen DNA berukuran 0.1-20 kb, sedangkan poliakrilamid untuk fragmen DNA berukuran 0.025-2 kb (Grompe et al., 1998). Gel agarosa mempunyai daya pemisahan lebih rendah dibandingkan dengan gel poliakrilamid, tetapi mempunyai rentang pemisahan yang lebih besar. Gel agarosa biasanya dilakukan dalam konfigurasi horisontal dalam kekuatan medan listrik dan arah tetap (Sudjadi, 2008).
Gel agarosa dibuat dengan melarutkan serbuk agarosa dalam bufer kemudian dipanaskan dan lalu dituang pada cetakan dan didiamkan sampai dingin. Setelah dingin dan mengeras, agarosa membentuk matriks dengan kerapatan yang ditentukan oleh konsentrasi agarosa. Jika medan magnet diberikan antara kedua ujung gel, maka DNA yang bermuatan negatif pada pH netral dan bergerak ke anoda. Kecepatan migrasi dari DNA tergantung dari ukuran (panjang) DNA, konformasi DNA, konsentrasi agarosa, dan besaran tegangan yang digunakan (Sudjadi, 2008). Fragmen DNA yang telah dipisahkan dengan elektroforesis gel dapat divisualisasikan dengan cara pewarnaan gel setelah elektroforesis selesai sehingga fragmen DNA dapat terlihat. Pewarna yang biasanya digunakan adalah etidium bromida yang mana dapat mengikat DNA dan akan berfluoresensi merah dibawah sinar UV (Grompe et al., 1998).
Akrilamid merupakan suatu monomer yang digunakan dalam pembuatan gel akrilamid, yang ditambahkan amonium persulfat dan distabilkan oleh TEMED, maka terjadi reaksi berantai sehingga monomer terpolimerisasi menjadi rantai panjang. Jika dalam reaksi terdapat bisakrilamid, maka reaksi menjadi bersambung melintang menjadi gel yang pori-porinya ditentukan oleh panjang rantai dan jumlah sambungan silang. Gel poliakrilamid dibuat dengan cara menuangkan antara dua lempeng kaca yang dipisahkan dengan pembatas dengan ketebalan tertentu. Elektroforesis gel poliakrilamid yang digunakan untuk memisahkan protein dengan sistem vertikal (Sudjadi, 2008).
2.6.2 Sekuensing DNA
Sekuensing adalah analisis DNA yang paling detil karena menggunakan penentuan urutan basa-basa nukleotida. Teknik sekuensing DNA merupakan salah satu teknik yang penting dalam teknologi DNA rekombinan karena sangat bermanfaat untuk menentukan urutan basa nukleotida suatu gen ataupun sekuen genom total suatu sel atau organisme. Teknik sekuensing DNA untuk pengurutan basa DNA terdiri 2 macam cara yaitu (1) cara degradasi kimiawi oleh A. Maxam dan W. Gilbert di Amerika, dan (2) cara determinasi rantai oleh F. Sanger dan A.R. Coulson di Inggris (Radji, 2011).
Metode penghentian rantai dengan dideoksi (dideoxy chain termination) yang dikembangkan oleh Sanger merupakan metode yang paling banyak
digunakan. Pada mulanya DNA didenaturasi dan dipisahkan menjadi untai tunggal dengan cara pemanasan. Satu primer oligonukleotida yang telah dilabel radioaktif ditambahkan ke dalam reaksi dan akan menempel pada sekuen pasangannya pada DNA target. DNA polimerase digunakan untuk menyalin DNA untai tunggal. Penambahan dNTP dalam jumlah banyak dan sampai jenuh akan menghasilkan produk ekstensi dengan ujung terlabel radioaktif, tetapi tidak menghasilkan informasi urutan basa. Penambahan sedikit ddNTP ke dalam campuran dNTP akan dapat memberikan informasi urutan basa DNA. Dideoksinukleotida akan terinkorporasi pada ujung 3' untai DNA yang baru disintesis. DNA polimerase tidak dapat menambahkan basa baru pada ddNTP, sehingga inkorporasi ddNTP akan mengakibatkan penghentian sintesis rantai DNA. Penambahan dNTP dan ddNTP dengan rasio yang tepat memungkinkan untuk menghentikan sintesis rantai DNA pada tiap posisi nukleotida (Grompe et al., 1998).
Sebagai contohnya, jika ektensi primer dilakukan menggunakan dATP, dTTP, dGTP dan ddCTP, maka polimerase akan mensintesis untai DNA baru sampai harus menggunakan ddCTP. Inkorporasi ddCTP pada titik ini menyebabkan DNA polimerase tidak dapat melanjutkan ekstensi. Dengan demikian, panjang produk hasil ekstensi yang terlabel radioaktif menentukan posisi G pertama yang disalin. Untuk menentukan posisi G yang lainnya, maka reaksi sekuensing yang sebenarnya dilakukan dengan menggunakan campuran dCTP dan ddCTP dengan perbandingan ~200:1. Pada kondisi ini kemungkinan terjadi penghentian rantai DNA adalah ~1:200 yang terjadi ketika terdapat G pada DNA yang disekuensing. Hasilnya akan diperoleh produk ekstensi dengan berbagai panjang, yang kemudian divisualisasi dengan elektroforesis pada gel poliakrilamid. Berdasarkan pada panjang produk, maka tiap fragmen akan menentukan posisi satu G. Untuk menentukan posisi keempat basa, empat reaksi sekuensing dilakukan untuk tiap sampel. Pada tiap reaksi dicampurkan dNTP dan ddNTP yang sesuai dikombinasi dengan 3 dNTP lainnya dalam konsentrasi jenuh. Keempat reaksi sekuensing kemudian dielektroforesis bersebelahan pada gel (poliakrilamid denaturasi), sehingga hasil sekuens DNA dapat langsung dibaca (Grompe et al., 1998). Berdasarkan perbedaan migrasi masing-masing fragmen
DNA, maka akan dapat ditentukan urutan basa-basa DNAnya. Hasil sekuensing DNA merupakan urutan basa yang komplementer terhadap urutan basa-basa yang terbaca pada hasil elektroforesis (Radji, 2011).
Perkembangan teknologi modern dewasa ini telah memungkinkan dilakukannya automatisasi sekuensing DNA. Perkembangan peralatan yang ada pada saat ini telah memungkinkan dapat membaca hasil sekuensing secara langsung dan sekaligus menyimpan data ke dalam database komputer. Adanya automasisasi dapat mengurangi faktor kesalahan yang sering terjadi dalam pembacaan dan pemulisan urutan DNA secara manual. Mesin sekuensing sekarang telah menggunakan fluoresen sebagai pengganti radioaktif. Senyawa fluoresen dapat diinkorporasikan ke dalam primer sekuensing atau ke dalam nukleotida. Pada sekuensing manual menggunakan elektroforesis gel atau elektroforesis kapiler untuk memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukurannya. Pada sekuensing otomatis deteksi fragmen DNA yang berfluoresensi dilakukan dengan bantuan sinar laser dan sinyal diproses oleh komputer (Grompe et al., 1998).