BAB 3 METODE PENELITIAN
3.3 Tahap Kerja
3.3.9 Ekspresi, Isolasi dan Karakterisasi Protein Rekombinan
Klon transforman E. coli BL21(DE3) yang terpilih selanjutnya dilakukan uji ekspresi protein rekombinan pada skala kecil menggunakan medium produksi yaitu media LB cair 10 ml yang ditambah 50 µg/ml ampisilin. Inkubasi dilakukan dengan variasi suhu pada 28⁰C, 30⁰C dan 37⁰C. Kultur sel bakteri pada OD600 sekitar 0,5 diinduksi menggunakan IPTG konsentrasi akhir 1 mM. Adapun protokol induksi yang digunakan adalah sebagai berikut:
1. Kultur stok gliserol 20 µl ditumbuhkan pada media LB cair 3 ml yang telah ditambah ampisilin dan diinkubasi pada 37⁰C dikocok 200 rpm semalam. 2. Kultur semalam diambil 0,5 ml dan dimasukkan ke LB cair 10 ml yang telah
ditambah ampisilin.
3. Kultur ditumbuhkan dengan dikocok 250 rpm pada suhu 37⁰C mencapai OD600: 0,5 sekitar 2 jam.
4. Kultur diambil 0,5 ml dimasukkan ke tabung 1,5 ml dan disentrifus pada 8000 rpm 4⁰C selama 10 menit, selanjutnya dipisahkan antara supernatan dan pelet sebagai sampel 0 jam sebelum induksi lalu disimpan pada -20⁰C.
5. Kultur diinduksi dengan penambahan IPTG konsentrasi akhir 1 mM dan dilanjutkan inkubasi pada variasi suhu 28⁰C, 30⁰C, dan 37⁰C dengan dikocok 250 rpm.
6. Pengambilan sampel 0,5 ml dilakukan pada waktu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 jam dan semalam, selanjutnya disentrifus dan dipisahkan antara supernatan dan pelet
lalu disimpan pada -20⁰C. Pelet selanjutnya diresuspensi dengan menggunakan 100 µl buffer PBS 1x.
Isolasi protein rekombinan human IFN α2a dari pelet dilakukan dengan metode sebagai berikut:
1. Kultur stok gliserol 20 µl ditumbuhkan pada media LB cair 3 ml yang telah ditambah ampisilin dan diinkubasi pada 37⁰C dikocok 200 rpm semalam. 2. Kultur semalam diambil 1,25 ml dan dimasukkan ke LB cair 25 ml yang telah
ditambah ampisilin.
3. Kultur ditumbuhkan dengan dikocok 250 rpm pada suhu 37⁰C mencapai OD600: 0,5 sekitar 2 jam.
4. Kultur diinduksi dengan penambahan IPTG konsentrasi akhir 1 mM dan dilanjutkan inkubasi pada suhu 37⁰C dengan dikocok 250 rpm.
5. Pemanenan sel dilakukan setelah 5 jam inkubasi dengan disentrifugasi 12.000 rpm pada suhu 4⁰C selama 10 menit untuk memisahkan pelet dan supernatan. 6. Pelet diresuspensi dengan 2,5 ml bufer 50 mM tris HCl pH 8 yang ditambah 1
mM EDTA dan 1 mM PMSF.
7. Campuran disonikasi sebanyak 10 kali selama 30 detik di es dengan selang waktu 30 detik di es.
8. Campuran disentrifugasi pada 12.000 rpm suhu 4⁰C selama 10 menit untuk memisahkan antara supernatan (protein terlarut di sitoplasma) dan pelet.
9. Pelet dicuci dengan bufer 50 mM tris HCl yang ditambah 1% triton X-100 (750 µl bufer untuk 0,1 gram pelet).
10. Campuran diikubasi 5 menit pada suhu kamar dan selanjutnya disentrifus 12.000 rpm pada suhu 4⁰C selama 5 menit.
11. Tahap pencucian dilakukan sebanyak 2 kali.
12. Pelet disolubilisasi dengan bufer 50 mM tris HCl yang ditambah 6 M guanidin HCl dan 800 mM merkaptoetanol (750 µl bufer untuk 0,1 gram pelet).
13. Campurn diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar dan selanjutnya disentrifus pada 12.000 rpm pada suhu 4⁰C selama 15 menit.
14. Supernatan dipisahkan dari pelet selanjutnya di cek menggunakan SDS PAGE dengan pewarnaan CBB atau Western blot dan penyimpanan dilakukan pada
suhu -20⁰C. Supernatan merupakan protein yang tidak terlarut yaitu sebagai badan inklusi di dalam sitoplasma.
Karakterisasi protein rekombinan human IFN α2a yang diperoleh dilakukan dengan metode elektroforesis SDS-PAGE yang dilanjutkan dengan pewarnaan CBB atau Western blot. Tahapan metode elektroforesis SDS-PAGE adalah sebagai berikut:
1. Pembuatan gel poliakrilamid yang terdiri atas separating gel dan stacking gel. Larutan separating gel 12%: 1,5 M tris HCl pH 8,8 (2,5 ml); 10% SDS (100 µl); 40% akrilamid (3 ml); aquades (4,4 ml); APS 10% (100 µl); TEMED (6 µl). Larutan separating gel dimasukkan dalam cetakan dan dibiarkan selama 30 menit supaya berpolimerisasi sehingga terbentuk gel.
Larutan stacking gel: 0,5 M tris HCl pH 6,8 (1,25 ml); 10% SDS (100 µl); 40% akrilamid (900 µl); aquades (7 ml); APS 10% (100 µl); TEMED (15 µl). Larutan stacking gel dimasukkan ke dalam cetakan pada posisi diatas separating gel kemudian sisir dimasukkan pada cetakan dan gel akan terbentuk setelah 30 menit.
2. Penyiapan sampel untuk dielektroforesis.
Pada supernatan dan pelet masing-masing diambil 10 µl dimasukkan ke dalam tabung dan ditambahkan 10 µl loading buffer RSB 2x (1:1) lalu dipanaskan pada 95⁰C selama 4 menit. Marker 5 µl ditambah 5 µl loading bufer RSB 2x. 3. Sampel dimasukkan kedalam sumuran dan dielektroforesis dalam bufer
elektroforesis pada tegangan 90 volt selama 90 menit.
Bufer elektroforesis untuk 1 liter pH 8,3: tris 15,5 g, glisin 72 g, SDS 5 g, lalu ditambah aquades sampai 1 liter.
Gel poliakrilamid yang telah selesai dielektroforesis SDS PAGE kemudian dikarakterisasi dengan pewarnaan commasie brilliant blue (CBB) atau menggunakan Western blot. Proses pewarnaan CBB adalah sebagai berikut:
1. Gel SDS-PAGE diinkubasi dengan stain (40% metanol: 20 ml; 7% asam asetat glasial: 3,5 ml; ddH2O: 26,5 ml; CBB stain: 6 ml) dan dikocok 3 jam. 2. Gel dicuci dengan destain I (40% metanol: 20 ml; 7% asam asetat glasial: 3,5
3. Gel dicuci dengan destain II (5% methanol: 2,5 ml; 7% asam asetat glasial: 3,5 ml; ddH2O 44 ml) dikocok 1 jam.
Tahapan metode Western blot adalah sebagai berikut:
1. Protein sebelumnya telah dipisahkan dengan metode SDS PAGE.
2. Protein selanjutnya ditransfer ke membran nitriselulosa dengan cara dielektroforesis dalam bufer transfer pada tegangan 90 volt selama 90 menit. Bufer transfer untuk 1 liter: tris 25 mM 3,03 g, glisin 192 mM 14,4 g, 20% metanol 200 ml, ditambah aquades sampai 1 liter.
3. Membran diambil kemudian diinkubasi dengan 10% susu bebas lemak dalam bufer TBS 1x dengan dikocok selama 1 jam.
Bufer TBS (Tris Buffer Saline) untuk 1 liter dengan pH 7,6: tris 2,42 g, NaCl 8g, HCl 1N 3,8 g, ditambah aquades sampai 1 liter.
4. Pencucian dilakukan 3 kali menggunakan 0,1% Tween 20 dalam TBS 1x selama 15 menit, 5 menit dan 5 menit dengan dikocok.
5. Larutan antibodi primer ditambahkan dan diinkubasi 1 jam dengan dikocok. Larutan antibodi primer: 10 µl anti-α-Interferon Mouse mAb dilarutkan pada 10 ml 10% susu bebas lemak dalam bufer TBS 1x.
6. Pencucian dilakukan 3 kali menggunakan 0,1% Tween 20 dalam TBS 1x selama 15 menit, 5 menit dan 5 menit dengan dikocok.
7. Larutan antibodi sekunder ditambahkan dan diinkubasi 1 jam dengan dikocok. Larutan antibodi sekunder: 3 µl anti-mouse IgG (H+L) AP conjugate dilarutkan pada 10 ml 10% susu bebas lemak dalam bufer TBS 1x.
8. Pencucian dilakukan 3 kali menggunakan 0,1% Tween 20 dalam TBS 1x selama 15 menit, 5 menit dan 5 menit dengan dikocok.
9. Hasil analisis diketahui dengan munculnya pita pada membran nitriselulosa setelah pemberian substrat NBT-BCIP (bufer alkaline phosphatase 5 ml; NBT 33 µl; dan BCIP 16,5 µl).
Hasil SDS PAGE yang dilanjutkan Western blot difoto yang selanjutnya dilakukan analisis densitometri dengan sistem digitalisasi automatik menggunakan UN-SCAN-IT Gel versi 6.1.