HASIL PENELITIAN
5.3. Apoptosis pada Kultur Sel Sp-C1 Pemberian Senyawa Aktif Triterpen Glikosida Teripang Timbu Kolong
Berdasarkan analisis ekspresi kedua protein diatas maka penelitian ini membuktikan bahwa kemampuan senyawa TG1 dari teripang timbu kolong mempengaruhi ekspresi Fas dan Bcl-2 melalui mekanisme stimulasi ekspresi protein Fas serta supresi protein Bcl-2 pada sel kanker lidah Sp-C1 sehingga melalui proses ini dapat menginisiasi proses apoptosis. Pembuktian ini juga mendukung agar senyawa TG1 dari teripang timbu kolong sebagai kandidat aprotein terapi Sp-C1 dengan protein Fas dan Bcl-2 sebagai target molekular terapi melalui mekanisme induksi apoptosis yang melibatkan inisiasi jalur ekstrinsik dan instrinsik.
Yun (2012) melaporkan dalam penelitiannya bahwa triterpene glycoside dapat menginduksi apoptosis dengan menginaktivasi protein Fas dan caspase-8, mencegah pembelahan sel dan kerusakan mitokondria. Plati (2015) menambahkan bahwa apopotosis terjadi akibata pengaruh FasL protein, tumor necrosis factor, and TRAIL dengan mengikat reseptor target, sementara protein yang termasuk famili caspases memprogramkan kematian sel secara alami.
Mereka berperan pada regulasi respon imun (Zhao et al., 2012).
Analisa berdasarkan dosis memperlihatkan hasil yang terlihat pada gambar 4.9 bahwa tingkat ekpresi protein Fas optimum untuk inisiasi apoptosis terjadi pada pemberian senyawa TG1 dari teripang timbu kolong dengan dosis 2xIC50
yang menghasilkan tingkat ekspresi protein Fas tertinggi. Hal ini menandakan bahwa inisiasi apoptosis jalur ekstrinsik melalui stimulasi ekspresi protein Fas dapat secara optimal dilakukan mulai pemberiaan dosis yang tinggi. Ekpresi proteinBcl-2 terendah pada gambar 4.10 pada pemberian senyawa TG1 dari teripang timbu kolong dengan dosis 2,5xIC50
Berdasarkan analisa diatas maka dapat disimpulkan bahwa untuk menginisiasi proses apotosis pada sel kanker lidah Sp-C1 melalui stimulasi protein Fas serta supresi proteinBcl-2 dapat dilakukan pemberian senyawa TG1 dari teripang timbu kolong mulai dari dosis 2xIC
. Hal ini menandakan bahwa inisiasi apoptosis jalur instrinsik melalui supresi ekspresi proteinBcl-2 dapat dilakukan padai pemberiaan dosis yang tinggi.
50 hingga 2,5xIC50. Rentang dosis ini dapat digunakan sebagai acuan untuk dosis pemberian senyawa yang sama pada penelitian lanjutan. Pada dosis 2xIC50 yang menjadi target molekular
terapi adalah protein Fas, sedangkan pada dosis 2,5xIC50
Hasil penelitian ini memperlihatkan pengaruh ekspresi duaprotein dalam inisiasi apoptosis yaitu Fas dan Bcl-2 secara bersamaan terhadap tingkat apoptosis yang dibuktikan oleh analisa statistik yang memperlihatkan terdapatnya pengaruh yang sangat kuat ekspresi dua protein yaitu Fas dan Bcl-2 secara bersamaan terhadap tingkat apoptosis dengan nilai R sebesar 0,837 pada sel kanker Sp-C1 yang diberi senyawa TG1 dari teripang timbu kolong. Hal ini menunjukkan bahwa pada pemberian senyawa TG1 dari teripang timbu kolong, interaksi kedua jalur ekstrinsik dan instrinsik yang melibatkan protein Fas dan Bcl-2 pada akhirnya akan menuju pada satu titik konverprotein yang menyebabkan enzim-enzim caspase memegang proses selanjutnya,(Rodriguez et al., 2013) yang berarti kedua protein ini menghasilkan suatu puncak sinyal yang mengaktivasi fase eksekusi apoptosis yang akan memperkuat proses induksi apoptosis. Hal ini juga menunjukkan bahwa pemberian senyawa TG1 dari teripang timbu kolong mempengaruhi kembalinya keseimbangan biochemical pathway yang melibatkan Fas dan Bcl-2 pada kultur sel Sp-C1.
yang menjadi target molekular terapi adalah proteinBcl-2.
Hal ini diungkapkan oleh penelitian lain bahwa kedua jalur ekstrinsik dan instrinsik yang melibatkan protein Fas dan Bcl-2 pada akhirnya akan menuju pada satu titik konverprotein yang menyebabkan enzim-enzim caspase memegang kontrol proses selanjutnya,(Rodriguez et al., 2013) yang berarti kedua protein ini menghasilkan suatu puncak sinyal yang mengaktivasi fase eksekusi apoptosis.
Fase akhir apoptosis adalah fase eksekusi yang diperantarai oleh kaskade
proteolytic, yang selanjutnya akan menginisiasi berbagai mekanisme. Protein protase yang memperantarai fase eksekusi ini homolog dengan protein ced-3 pada mamalia. Protein golongan caspase ini terdiri atas lebih dari 10 anggota yang secara fungsional dibagi menjadi 2 grup yakni grup inisiator dan eksekutor.
Termasuk inisiator diantaranya caspase 8 dan caspase 9, sedangkan yang termasuk eksekutor contohnya caspase 3 dan caspase 6 (Kumar et al., 2003;
Martin., 2006; Wong., 2011; Batra and Sharma., 2013).
Seperti pada umumnya enzim-enzim protease, caspase ini berada dalam bentuk proenzim yang inaktif atau zimoprotein, dan harus terlebih dahulu diaktivasi untuk dapat menginisiasi apoptosis. Caspase memiliki tempat aktivasi tersendiri yang dapat dihdrolisis bukan hanya oleh caspase yang lain melainkan juga oleh dirinya sendiri melalui proses autocatalytically. Setelah diinisiasi caspase akan berubah menjadi bentuk aktif dan enzim program kematian sel ini akan bergerak mengaktivasi caspase yang lain. Caspase yang merupakan eksekutor, beraktivasi dalam banyak komponen seluler. Caspase ini memecah protein sitoskeleton dan matriks inti sel, sehingga menyebabkan kerusakan sitoskeleton dan kehancuran inti sel. Dalam inti sel, yang menajadi target aktivitas caspase adalah protein-protein yang berproses dalam proses transkripsi, replikasi DNA dan DNA repair. Pada saat yang bersamaan, pengaktivan caspase 3 akan mengakibatkan perubahanDNAase menjadi bentuk aktif, kemudian DNAase akan menginduksi pemecahan internucleosomal pada DNA sehingga terjadi fragmentasi DNA (Martin., 2006; Batra and Sharma., 2013). Walaupun tidak
terlihat variasi yang jelas, gambaran morfologis apoptosis memperlihatkan pola-pola pokok yang umumnya bisa diaplikasikan pada semua bentuk apoptosis.
Gambaran morfologi sel yang mengalami apoptosis dapat dilihat dengan mikroskop elektron dengan gambaran dimulai dengan pengerutan sel (cell shrinkage). Ukuran sel menjadi lebih kecil, sitoplasma menjadi lebih padat, sedangkan organel sekalipun relatif normal namun tampak tersusun lebih rapat.
Selanjutnya terjadi kondensasi kromatin (piknotik) yang merupakan karakteristik yang paling umum pada apoptosis. Kromatin inti memadat membentuk agregasi di perifer, di bawah membran inti menjadi massa padat berbatas tegas dalam berbagai bentuk dan ukuran. Inti dapat terbelah menjadi dua fragmen atau lebih (karyorhexis). Kemudian terjadi pembentukkan kuncup sitoplasmik dan badan apoptotik ( apoptotic bodies). Sel apoptotik mula-mula menunjukkan “blebbing”
permukaan yang luas kemudian mengalami fragmentasi menjadi sejumlah badan apoptosis yang terdiri atas vesikael sitosol dan organel yang dibungkus oleh membran. Tahap akhir adalah fagositosis sel-sel yang mengalami apoptosisoleh makrofak. Badan apoptotik dengan cepat didegradasi dalam lisosom dan sel-sel sehat yang bersebelahan bermigrasi atau berproliferasi untuk mengisi tempat kosong yang ditinggalkan oleh sel yang mengalami apoptosis (Kumar et al., 2003; Yildiz et al., 2008).
Dari uraian diatas terlihat bahwa proses apoptosis merupakan suatu rangkaian proses yang cukup panjang dan memerlukan waktu yang cukup untuk sampai pada tahap akhir berupa fragmentasi DNA akibat teraktivasi DNAase.
Kedua jalur ekstrinsik dan instrink kemudianakhirnya akan menuju pada satu titik
konverprotein yang menyebabkan enzim-enzim caspase memegang kontrol proses selanjutnya (Rodriguez et al., 2013). Gen ataupun molekul seperti Fas dan Bcl-2 berperan dalam transduksi sinyal pada fase inisiasi yang akan menstimulasi pengaktifan enzim protease caspase pada fase berikutnya yaitu fase eksekusi yang diakhiri fragmentasi DNA. Untuk membuktikan bahwa proses inisiasi yang melibatkan ekspresi Fas dan Bcl-2 tersebut cukup optimal untuk menstimulasi fase eksekusi yang diakhiri fragmentasi DNA, maka perlu dilakukan suatu pemerikasaan untuk mendeteksi fragmentasi DNA pada sel yang mengalami apoptosis.
Hasil pemeriksaanmemperlihatkan bahwa fragmentasi DNA yang terlihat pada sediaan sel berupa warna coklat terjadi pada semua dosis pemberian senyawa TG1 dari teripang timbu kolong. Bukti bahwa kematian sel berupa apoptosis dengan morfologi yang khas tersebut dapat dilihat pada tabel 4.11 nilai indeks apoptosis paling tinggi terjadi pada dosis 2xIC50 dan ini masih berada dibawah kelompok kontrol. Jumlah sel yang mengalami apoptosis cenderung meningkat dengan ditingkatkannya dosis pemberian senyawa, namun pada dosis IVyakni dosis 2,5xIC50 jumlah sel yang mengalami apoptosis mengalami penurunan yang dapat dilihat pada tabel 4.11. Namun secara statistik menghasilkan kesimpulan bahwa terdapat keterkaitan positif antara jumlah apoptosis dengan dosis pemberian senyawa TG1 dari teripang timbu kolong.
Besarnya korelasi antara dosis pemberian senyawa senyawa TG1 dari teripang timbu kolong dan jumlah apoptosis memiliki nilai r=0,720. Hal ini menunjukkan tingkat korelasi yang kuat berdasarkan interpretasi Guilford. Berdasarkan analisis
dan pembuktian ini dapat disimpulkan bahwa senyawa senyawa TG1 dari teripang timbu kolong memiliki kemampuan yang sangat kuat dalam menginduksi apoptosis, serta semakin besar dosis senyawa senyawa TG1 dari teripang timbu kolong yang diberikan maka semakin banyak jumlah apoptosis pada kultur sel Sp-C1.