BAB II TINJAUAN PUSTAKA
4 Asam Fusarat dan gejala yang ditimbulkannya
Secara kimia asam fusarat disebut asam piridine karboksilat (5-n-butil asam pikolinat) dengan formulasi C10H13O2N dan mempunyai berat molekul 179. Asam
fusarat murni mepunyai titik lebur 98-100oC, tetapi bila mengandung asam dehidrofusarat mempunyai titik lebur di atas 109oC (Damayanti 2002). Umumnya asam fusarat terdapat bersama senyawa la in yaitu asam dehidrofusarat dan asam 10-hidroksi fusarat. Menurut Torssell (1983) asam fusarat merupakan campuran biogenesis dari asam amino dan poliketida.
Asam fusarat dihasilkan oleh banyak spesies dari genus Fusarium dan merupakan toksin yang tidak spesifik pada inang tertentu, dapat menimbulkan gejala layu pada beberapa spesies tanaman yang berbeda (Matsumoto et al 1995).
Asam fusarat juga merupakan ‘chelator’ logam, produksi asam fusarat secara in vitro dipengaruhi oleh ketersediaan ion logam, terutama zinc (Harborne 1988) dan rasio C dan N dalam media (Remotti 1996). Asam fusarat dapat mempengaruhi fungsi organel, protein atau enzim tertentu dari sel tanaman seperti: menghambat oksidasi sitokrom dan respirasi pada mitokondria sehingga menurunkan ATP yang akhirnya menyebabkan layu; menghambat enzim kristalin katalase dalam pembentukan dinding sel sehingga mengganggu permeabilitas membran sel yang dapat mengakibatkan kebocoran sel; menurunkan aktivitas oksidasi fenol dan polifenol yang memegang peran dalam pertahanan tanaman terhadap patogen (Jin
et al. 1996; Remotti 1996). Asam fusarat telah banyak digunakan dalam seleksi in vitro untuk memperoleh tanaman tahan penyakit layu antara lain pada tomat, asparagus, gandum, bunga lily, gladiol, pisang, nanas dan sebagainya. (Toyoda et al. 1984b; Morpurgo et al. 1994; Matsumoto et al. 1995; Remotti et al. 1997; Borras et al. 2001).
KULTUR JARINGAN ABAKA
Kultur jaringan abaka telah berkembang baik di Filipina dan terbukti dapat mempercepat propagasi hingga 1 000 - 1 500 kali dibandingkan dengan cara konvensional. Eksplan yang digunakan adalah tunas pucuk (shoot tip), dan media untuk induksi tunas adalah MS dengan penambahan hormon BA dan air kelapa. Dengan teknik kultur jaringan diperoleh 20 000 – 30 000 plantlet/tunas pucuk/tahun, sementara dari tanaman di lapang hanya diperoleh 20 bibit/anakan/tahun. Plantlet yang diperoleh sangat mudah berakar pada media yang mengandung karbon aktif dan IBA. Hasil pengujian 30 varietas abaka menunjukkan bahwa produksi tunas melalui kultur jaringan tergantung pada varietas (Del-Rosario dan Zamora 1988).
Di Indonesia, pengadaan bibit abaka melalui kultur jaringan juga telah banyak dilakukan. Sumber eksplan yang umum digunakan adalah mata tunas atau tunas pucuk yang berasal dari tanaman di lapang. Setelah disterilisasi kemudian ditanam pada media MS yang diberi tambahan BAP (5 mg/l) untuk penggandaan tunas, sedang untuk media perakaran digunakan MS dengan penambahan IBA atau IAA (0.5 mg/l). Produksi plantlet mencapai 28 000 planlet/mata tunas atau
tunas pucuk/tahun (Hilman dan Toruan-Mathius 2001). Hasil penelitian Mante dan Tepper (1983) menunjukkan bahwa penambahan BAP pada media inisiasi tunas lebih efektif dibandingkan zat pengatur tumbuh lain, misal: kinetin dan 2iP. Selain itu, pembentukan tunas pada eksplan yang berasal dari tanaman muda (umur 2-6 bulan) lebih cepat dan konsisten dibandingkan tanaman tua (umur 12 bulan), dan yang paling menentukan keberhasilan kultur jaringan abaka adalah intensitas cahaya yang cukup (1 000 – 3 000 lux). Penambahan asam askorbat (100 mg/l) pada media MS yang mengandung BAP (5 mg/l) dapat mengurangi proses pencoklatan (browning) akibat adanya phenol pada jaringan (Damayanti 2002).
MUTASI DAN KERAGAMAN SOMAKLONAL
Mutasi secara umum dibedakan dalam dua kelompok, yaitu mutasi alami dan mutasi buatan. Mutasi alami terjadi secara spontan dan berkaitan dengan faktor- faktor lingkungan. Mutasi alami terjadi secara lambat, tetapi berlangsung secara terus- menerus sehingga memerlukan waktu yang lama untuk mengakumulasi mutan dalam populasi alami (Damayanti 2002). Mutasi buatan adalah mutasi yang diinduksi yang digunakan sebagai salah satu cara untuk menimbulkan keragaman genetik. Mutasi dapat diinduksi dengan cara fisik menggunakan radiasi atau dengan cara kimia menggunakan senyawa yang bersifat mutagen (van Harten 1998), dan akhir-akhir ini penggunaan elemen transposon yang dikenal dengan mutagenesis insersi dan kultur jaringan yang menimbulkan keragaman somaklonal dinyatakan sebagai teknik biologi unt uk menghasilkan mutasi (Bird & Neuffer 1987). Mutasi buatan telah memberikan kontribusi nyata terhadap perbaikan tanaman di dunia (Maluszynski et al. 1995).
Radiasi yang umum digunakan adalah sinar-x atau gamma, sedangkan mutasi kimia antara lain menggunakan colchicin, dietil sulfat (DES), etilenimin (EI), nitroso etil urea, nitroso metil urea, dan etilmetan sulfonat (EMS). EMS termasuk senyawa alkil yang mempunyai potensi tinggi sebagai mutagen yang efisien untuk tanaman tinggi. EMS merupakan mutagen kimia yang paling banyak digunakan karena mudah dibeli, harganya murah dan tidak meninggalkan racun setelah hidrolisat (van Harten 1998). Frekuensi mutasi tinggi diperoleh pada
kacang tanah yang diberi perlakuan EMS dengan konsentrasi 0.25 – 0.5% (Gowda
et al. 1996). Pada tanaman barley, EMS menimbulkan laju mutasi hingga 4-5 kali lebih tinggi dibandingkan dengan radiasi sinar-x, terutama untuk mutasi klorofil (van Harten 1998). Kombinasi antara EMS (0,3%) dan dimetil sulfonat atau DMSO (4%) telah berhasil meningkatkan frekuensi mutasi pada tanaman pisang (Matsumoto et al. 1995).
Keragaman somaklonal merupakan keragaman genetik dari tanaman yang dihasilkan melalui berbagai macam kultur jaringan (Semal & Lepoivre 1990). Keragaman somaklonal dapat berasal dari keragaman genetik yang sebelumnya sudah ada (pre-existing) pada eksplan dan keragaman yang diinduksi selama fase kultur jaringan (Skirvin et al. 1994). Keragaman yang timbul akibat induksi pada kultur in vitro lebih sering terjadi dan mudah diamati, karena varian diperoleh dari tempat yang terbatas dan dalam waktu singkat (Ahloowalia 1986).
Keragaman somaklonal terdiri dari dua tipe yaitu: heritabel dan epigenetik. Keragaman heritabel adalah keragaman yang stabil dan diwariskan melalui siklus seksual maupun propagasi akseksual yang berulang, sementara keragaman epigenetik tidak stabil meskipun dipropagasi secara aseksual (Skirvin et al. 1994). Keragaman somaklonal dapat berupa defisiensi klorofil, mutasi gen tunggal, poliploidi, perubahan kromosom, modifikasi hasil, kualitas, ketahanan penyakit, atau kadang-kadang muncul keragaman yang sebelumnya tidak pernah ada di alam (Ahloowalia 1986). Adapun faktor-faktor yang mempengaruhi terbentuknya keragaman somaklonal pada kultur jaringan adalah: fase pertumbuhan awal, genotipe, zat pengatur tumbuh, sumber jaringan eksplan (Karp 1995) dan protokol atau prosedur regenerasi plantlet (Semal & Lepoivre 1990).
Keragaman somaklonal memiliki potensi untuk perbaikan varietas karena: menimbulkan sifat-sifat baru yang tidak diperoleh dari persilangan atau mutasi, dan pada somaklonal tidak terdapat hambatan yang sering dijumpai pada hibridisasi seperti: fertilitas rendah, kurangnya keragaman genetik, atau lamanya waktu yang dibutuhkan (Semal & Lepoivre 1990). Menurut Cai dan Butler (1996) penggunaan keragaman somaklonal bersama-sama dengan pemuliaan konvensional dapat meningkatkan efisiensi pemuliaan karena dapat memperluas keragaman dan menyingkat waktu proses pemuliaan.
Kombinasi kultur jaringan dengan mutasi buatan dapat mempercepat program pemuliaan mulai dari peningkatan keragaman hingga multiplikasi genotipe yang diinginkan. Pada spesies-spesies yang berkembang biak secara vegetatif (misal: kentang, pisang, abaka dsb.), mutasi yang dikombinasi dengan teknik kultur jaringan merupakan metode yang paling tepat untuk perbaikan kultivar (Maluszynski et al. 1995). Kombinasi antara mutasi dengan kultur jaringan dapat menghasilkan mutan dengan frekuensi tinggi dalam waktu singkat dan mengurangi terjadinya kimera (Nagatomi, 1996).
SELEKSI IN VITRO
Seleksi in vitro ditujukan untuk memilih mutan secara efektif dan efisien yang mempunyai sifat sesuai dengan yang diinginkan. Seleksi in vitro yang dikombinasikan dengan keragaman somaklonal telah banyak digunakan untuk memperoleh tanaman resisten terhadap penyakit pada berbagai jenis tanaman (Ahmed et al. 1996). Sebagai contoh adalah untuk memperoleh tanaman tebu toleran terhadap fitotoksin yang dihasilkan oleh Drechslera sacchari (toksin DS) dari varietas yang sangat rentan (Leal et al. 1996).
Keragaman somaklonal memberikan kemungkinan terbentuknya resistensi terhadap patogen tanaman dan sangat berguna untuk perbaikan resistensi tanaman terhadap fungi. Keragaman akan lebih terarah dengan adanya tekanan seleksi (patogen itu sendiri, toksin atau filtrat kultur) baik selama fase regenerasi tunas atau sesudah regenerasi tanaman (Orlando et al. 1997). Sistem yang paling banyak digunakan untuk evaluasi in vitro terhadap resistensi/suseptibilitas adalah penggunaan toksin murni atau filtrat jamur (Morpurgo et al. 1994). Asam Fusarat yang dihasilkan oleh berbagai spesies Fusarium merupakan toksin yang menyebabkan gejala layu. Seleksi in vitro mutan- mutan yang toleran terhadap asam fusarat merupakan metode yang efiektif untuk memperoleh tanaman toleran terhadap Fusarium (Matsumoto et al. 1995). Umumnya, ketahanan terhadap toksin yang diekspresikan pada saat regenerasi tanaman memiliki korelasi dengan tingkat ketahanannya terhadap penyakit, karena ketahanan telah ditransmisikan kepada keturunan tanaman yang terseleksi (Ahmed et al. 1991).
Teknik filtrat kultur Fusarium spp. juga telah umum digunakan untuk memperoleh somaklon resisten terhadap senyawa toksik yang diproduksi oleh patogen tersebut pada tanaman gandum (Ahmed et al. 1996). Filtrat kultur dapat menghambat pertumbuhan sel dan sel-sel dari spesies inang lebih sensitif terhadap toksin dibandingkan tanaman bukan inang. Kalus tanaman anyelir yang rentan terhadap Fusarium oxysporum f.sp dianthi bila ditanam pada media yang mengandung filtrat kultur nya dapat menghasilkan tanaman resisten terhadap patogen tersebut (Thakur et al. 2002).
Penggunaan filtrat kultur lebih baik bila ditambah dengan pengamatan parameter biokimia, misalnya: senyawa fenol. Peroksidase merupakan enzim penting yang berkorelasi dengan mekanisme pertahanan aktif tanaman dengan menyediakan senyawa fenol untuk membentuk lignin (Morpurgo et al. 1994). Pada tanaman strawberry, meningkatnya ketahanan terhadap patogen berkorelasi dengan bertambahnya senyawa fenol terutama ortodihidroksifenol (Orlando et al. 1997).
BAB III
METODE INOKULASI DAN KERAPATAN KONIDIUM
Fusarium oxysporum f.sp. cubense UNTUK MENGINFEKSI
TANAMAN ABAKA
ABSTRAK
Abaka (Musa textilis Nee) merupakan salah satu tanaman industri penting, namun pengembangannya di Indonesia masih mengalami kendala karena adanya penyakit layu Fusarium (penyakit Panama) yang disebabkan oleh infeksi cendawan Fusarium oxysporum f.sp. cubense (Foc). Perbaikan tanaman untuk memperoleh genotipe abaka yang resisten terhadap Foc membutuhkan metode inokulasi yang efektif untuk penapisan plasma nutfah. Penelitian ini bertujuan untuk (1) mengevaluasi efektivitas metoda inokulasi Foc dan (2) kerapatan konidia Foc – untuk menginduksi munculnya infeksi Foc pada bibit abaka, serta (3) mengevaluasi respon sepuluh genotipe abaka terhadap infeksi Foc. Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode inokulasi dengan memotong akar bibit abaka di bagian ujung dan merendamnya selama dua jam dalam suspensi konidia
Foc sebelum tanam (INO-2) pada kerapatan 106 konidia/ml (KON-2) merupakan metode yang paling efektif untuk menginduksi infeksi penyakit pada bibit abaka. Perlakuan tersebut menimbulkan gejala dan intensitas penyakit paling tinggi pada genotype-genotipe abaka yang dievaluasi. Dari sepuluh genotype yang diuji, tidak ada satupun yang resisten terhadap infeksi Foc.
INOCULATION METHODS AND CONIDIAL DENSITIES
OF Fusarium oxysporum f.sp. cubense FOR INFECTING ABACA
ABSTRACT
Despite abaca (Musa textilis Nee) is an important industrial crop; its cultivation in Indonesia is hamperred by Fusarium wilt (Panama disease) due to infection of Fusarium oxysporum f.sp. cubense (Foc). Development of Foc
resistance abaca genotypes requires availability of established and reliable screening method for resistance against Foc. The objectives of this study were (1) to evaluate effectiveness of Foc inoculation methods and (2) Foc conidial densities - to induce disease infection in abaca, and (3) to evaluate the responses of ten abaca clones against Foc infection. Results of the experiment showed method of inoculation by wounding roots and submerging abaca planting materials for 2 hours in suspension of Foc conidia before planting and the use of suspension of 106 Foc konidium/ml were the most effective method for inducing disease infection in abaca. These treatments resulted in the most severe disease symptoms and disease incidence among tested abaca. Out of ten abaca clones evaluated, none was resistance against Foc infection.
Keywords: Fusarium wilt, panama disease, disease response, Musa textilis.
PENDAHULUAN
Penyakit layu Fusarium, yang juga dikenal sebagai Panama disease, merupakan salah satu penyakit yang sangat merugikan pada tanaman pisang, termasuk abaka (Musa textilis Nee) yang ditanam di daerah tropika. Penyakit yang disebabkan oleh cendawan Fusarium oxysporum Schlecht.f.sp. cubense (E.F. Smith) Snyd & Hans ini telah menyerang pertanaman pisang di Asia, Afrika, Australia, dan daerah tropika di Amerika sejak 50 tahun yang lalu (Hwang & Ko 2004). Di Leyte-Filipina F. oxysporum f.sp. cubense (Foc) dilaporkan telah menimbulkan kerusakan antara 5-65% dari pertanaman abaka di lapangan (Bastasa & Baliad 2005). Di Indonesia, Foc diketahui telah menyerang tanaman pisang hingga seluas 3 300 ha di 3 provinsi di Sumatera (Nasir & Jumjunidang 2003). Keberadaan patogen ini di berbagai daerah lain di Indonesia juga telah diketahui. Hal tersebut menjadi kendala pengembangan abaka di Indonesia mengingat klon abaka yang resisten terhadap Foc belum tersedia.
bertahan lama dalam bentuk miselium diantara sisa-sisa tanaman yang terserang atau dalam bentuk klamidospora di tanah (Agrios 1997). Pengendalian penyakit layu Fusarium disarankan dilakukan secara terpadu dengan penggunaan bibit sehat dari klon abaka yang resisten, penggunaan mikroba antagonis, dan penggunaan pestisida nabati (Djatnika et al. 2003; Di Pietro et al. 2003). Walaupun demikian, efektivitas mikroba antagonis untuk pengendalian Foc masih terbatas, efektivitasnya di lapangan masih belum diketahui, dan belum ada mikroba antagonis yang dapat diandalkan untuk secara tuntas mengendalikan Foc
(Bastasa & Baliad 2005). Sejauh ini, penggunaan klon yang resisten merupakan metode alternatif pengendalian Foc yang efektif (Ploetz 2000)
Penanaman klon abaka yang resisten terhadap serangan Foc diharapkan merupakan cara alternatif untuk mengatasi kendala serangan layu Fusarium di Indonesia. Dalam usaha untuk mengidentifikasi klon abaka yang resisten terhadap
Foc maka perlu dilakukan penapisan respons plasma nutfah abaka yang ada terhadap serangan Foc. Keberhasilan kegiatan penapisan ditentukan oleh tersedianya metode inokulasi Foc yang efektif pada tanaman abaka. Selama ini metode penapisan yang ada untuk evaluasi respons tanaman pisang terhadap Foc
tidak praktis dalam penerapannya (Ishak & Dwimahyani 2005). Penelitian yang dilakukan bertujuan untuk (1) menge valuasi efektivitas metoda inokulasi dan (2) kerapatan konidium Foc untuk menginduksi munculnya gejala pada bibit abaka, serta (3) mengevaluasi respons sepuluh klon abaka terhadap serangan Foc.
BAHAN DAN METODE
Isolat F. oxysporum f.sp cubense dan Bahan Tanaman.
Cendawan Foc diisolasi dari tanaman abaka yang terinfeksi Foc di perkebunan abaka PT. Bayu Lor, Banyuwangi (Foc isolat Banyuwangi) dan kebun percobaan Balai Penelitian Tembakau dan Tanaman Serat (Balittas) di Sumberejo, Bojonegoro (Foc isolat Bojonegoro) dan di Karangploso, Malang (Foc isolat Malang). Isolat cendawan yang digunakan sebagai sumber inokulum telah dimurnikan dengan menggunakan kultur potongan hifa, diperbanyak dalam media potato dextrose agar (PDA) dan diinkubasikan dalam ruang bersuhu 29-
30oC selama 7 hari. Ke dalam botol kultur dengan volume 250 ml dan berisi media potato dextrose broth (PDB) 100 ml diinokulasikan 3 potongan agar (diameter 1 cm) dengan hifa Foc. Kultur digoyang dengan pengocok (shaker) berkecepatan putaran 60 rpm selama 14 hari (Gambar 2.a).
Plantlet abaka hasil kultur jaringan yang telah berakar ditanam dalam pot plastik berisi media pasir steril, diinkubasikan di ruangan yang terkontrol kelembaban dan pencahayaannya selama 1 minggu, dan dipindahkan ke rumah kaca hingga bibit berumur 2 bulan (tinggi 15-20 cm). Hanya bibit abaka sehat dan tidak menunjukkan gejala serangan hama dan penyakit yang digunakan dalam percobaan (Gambar 2.b). Abaka klon Tangongon digunakan dalam evaluasi efektivitas metode inokulasi, sedangkan abaka klon Tangongon, Sangihe-1 dan UB-3 digunakan dalam evaluasi efektivitas kerapatan konidia Foc untuk memunculkan gejala infeksi Foc pada bibit abaka yang diuji. Dalam evaluasi respon klon abaka terhadap infeksi Foc digunakan 10 klon abaka yang dibib itkan dari hasil perbanyakan in vitro. Semua bibit ditumbuhkan dalam kantong plastik (polybag) berisi media campuran tanah:pasir (2:1 b/b).
Efektivitas Metode Inokulasi.
Dalam percobaan ini dievaluasi metode inokulasi 1 (INO-1): penanaman bibit abaka dalam media tanam yang terkontaminasi Foc. Media terkontaminasi diperoleh dengan mencampur Foc yang dibiakkan dalam media beras dengan media tanam dan diinkubasikan selama satu minggu sebelum bibit abaka ditanam, dengan perbandingan 10 g beras pada 3 kg tanah. Metode INO-2: penanaman bibit abaka yang akarnya telah dipotong ± 1 cm di bagian ujung dan direndam selama dua jam dalam suspensi konidia Foc (106 konidia/ml) pada media tanam steril. Metode INO-3: penanaman bibit abaka dalam media tanam steril dan penyiraman dengan 50 ml suspensi konidia Foc (106 konidia/ml). Bibit abaka yang tidak diinokulasi Foc digunakan sebagai kontrol. Satuan percobaan terdiri atas 5 pot yang ditanami dengan satu bibit abaka per pot dan diulang 3 kali sehingga total terdapat 15 bibit untuk masing- masing perlakuan. Pengamatan dilakukan terhadap persentase bibit bergejala layu karena infeksi Foc, rataan skor gejala layu, dan intensitas penyakit (IP) pada 30 hari sesudah inokulasi (HSI). Untuk semua data
yang dihasilkan, hanya nilai rataan skor gejala saja yang dianalisis secara statistik. Persentase tanaman bergejala dan intensitas penyakit tidak dianalisis secara statistik.
Pengaruh Kerapatan Konidia Foc terhadap Intensitas Penyakit.
Percobaan ini mengevaluasi pengaruh penggunaan dua tingkat kerapatan konidia terhadap munculnya gejala dan intensitas penyakit layu Fusarium pada tiga klon abaka (Tangongon, Sangihe-1 dan UB-3). Kerapatan konidia Foc isolat Banyuwangi yang dievaluasi terdiri atas: 105 konidia/ml (KON-1) dan 106 konidia/ml (KON-2). Kerapatan stok konidia Foc dihitung menggunakan
haemocytometer (5 bidang pandang) dan kerapatan konidia yang diinginkan
diperoleh dengan pengenceran stok konidia menggunakan akuades steril.
Sebelum ditanam, bibit abaka yang digunakan dilukai perakarannya dan direndam selama 2 jam dalam suspensi konidia Foc dengan kerapatan sesuai perlakuan. Selanjutnya bibit abaka ditanam dalam kantong plastik berisi media tanam sebagaimana telah diuraikan sebelumnya. Bibit abaka yang tidak diinokulasi (direndam dalam air akuades, KON-0) digunakan sebagai pembanding. Unit percobaan terdiri atas 3 pot yang masing- masing ditanami satu bibit abaka. Setiap perlakuan diulang tiga kali sehingga total digunakan 9 bibit abaka untuk setiap perlakuan. Pengamatan dilakukan pada 30 dan 60 HSI terhadap persentase bibit yang bergejala layu, rataan skor gejala layu dan intensitas penyakit. Pengamatan gejala nekrosis pada bonggol bibit abaka dilakukan pada saat 60 HSI (saat bibit dipanen).