Sebuah sistem kromatografi ion otomatis.
dengan cepat dapat menjadi hambatan untuk setiap laboratorium proses. Oleh karena itu, beberapa produsen telah mengembangkan sistem otomatis flash kromatografi (biasanya disebut sebagai LPLC, kromatografi cairan tekanan rendah, sekitar 50-75 psi) yang meminimalkan keterlibatan manusia dalam proses pemurnian. Sistem otomatis akan mencakup komponen biasanya ditemukan pada lebih sistem HPLC mahal seperti pompa gradien, port sampel injeksi, detektor UV dan kolektor untuk mengumpulkan fraksi eluen. Biasanya sistem ini otomatis dapat memisahkan sampel dari beberapa miligram hingga skala kg industri dan menawarkan solusi yang jauh lebih murah dan lebih cepat untuk melakukan beberapa suntikan pada persiapan-HPLC sistem.
Resolusi (atau kemampuan untuk memisahkan campuran) pada sistem LPLC akan selalu lebih rendah dibandingkan dengan HPLC, sebagai bahan kemasan dalam kolom HPLC bisa jauh lebih kecil, biasanya hanya 5 micrometre sehingga luas permukaan meningkat fase stasioner, meningkatkan interaksi permukaan dan memberikan pemisahan yang lebih baik. Namun, penggunaan media ini kemasan kecil
menyebabkan tekanan balik tinggi dan mengapa itu disebut kromatografi cair tekanan tinggi. Kolom LPLC biasanya dikemas dengan silika sekitar 50 mikrometer, sehingga mengurangi tekanan balik dan resolusi, tetapi juga menghilangkan kebutuhan untuk mahal pompa tekanan tinggi. Produsen kini mulai pindah ke yang lebih tinggi tekanan sistem flash kromatografi dan telah disebut ini kromatografi cair tekanan sebagai media (MPLC) sistem yang beroperasi di atas 150 psi.
Perangkat lunak mengendalikan sistem otomatis akan mengkoordinasikan komponen, memungkinkan pengguna untuk hanya mengumpulkan faksi-faksi yang mengandung senyawa target mereka (dengan asumsi mereka terdeteksi pada detektor sistem) dan membantu pengguna untuk menemukan bahan murni yang dihasilkan dalam kolektor fraksi. Perangkat lunak ini juga akan menyelamatkan kromatografi yang dihasilkan dari proses untuk keperluan penarikan kembali arsip dan / atau lambat.
Sebuah contoh wakil dari kromatografi kolom sebagai bagian dari latihan laboratorium sarjana adalah pemisahan tiga komponen (dari 28) dalam minyak spearmint: carvone, limonene dan dehydrocarveol [5]. Sebuah setup mikro yang terdiri dari pipet Pasteur sebagai kolom dengan fase diam silika gel dapat cukup. The eluen awalnya adalah heksana dan polaritas pelarut meningkat selama proses dengan menambahkan etil asetat.
[Sunting] Kolom Kromatogram Perhitungan Resolusi
Biasanya, kromatografi kolom diatur dengan pompa peristaltik mengalir buffer dan sampel solusi melalui bagian atas kolom. Solusi dan buffer melewati kolom di mana seorang kolektor fraksi pada akhir setup kolom mengumpulkan sampel dielusi. Sebelum koleksi fraksi, sampel yang dielusi dari kolom lulus melalui detektor seperti spektrofotometer atau spektrometer massa sehingga konsentrasi sampel dipisahkan dalam campuran larutan sampel dapat ditentukan.
Misalnya, jika Anda adalah untuk memisahkan dua protein yang berbeda dengan kapasitas mengikat yang berbeda untuk kolom dari sampel solusi, jenis yang baik detektor akan menjadi spektrofotometer menggunakan panjang gelombang 280 nm. Semakin tinggi konsentrasi protein yang melewati solusi dielusi melalui kolom, semakin tinggi absorbansi panjang gelombang itu.
Karena kromatografi kolom memiliki aliran konstan solusi dielusi melewati detektor pada konsentrasi yang berbeda-beda, detektor harus plot konsentrasi sampel dielusi selama perjalanan waktu. Ini plot konsentrasi sampel terhadap waktu disebut kromatogram.
Tujuan utama dari kromatografi adalah untuk memisahkan komponen yang berbeda dari campuran solusi. Resolusi itu menyatakan tingkat pemisahan antara komponen-komponen dari campuran. Semakin tinggi resolusi dari kromatogram, semakin baik tingkat pemisahan sampel kolom memberikan. Data ini adalah cara yang baik untuk menentukan pemisahan kolom sifat bahwa sampel tertentu. Resolusi dapat dihitung dari kromatogram.
Kurva terpisah dalam diagram mewakili profil yang berbeda konsentrasi sampel elusi dari waktu ke waktu berdasarkan afinitas mereka ke kolom resin. Untuk menghitung resolusi, waktu retensi dan lebar kurva diperlukan.
Waktu Retensi: Waktu dari awal deteksi sinyal oleh detektor dengan tinggi puncak profil konsentrasi elusi dari masing-masing sampel yang berbeda.
Lebar Curve: Lebar kurva profil konsentrasi sampel yang berbeda dalam kromatogram dalam satuan waktu.
Sebuah metode sederhana dari menghitung resolusi kromatogram adalah dengan menggunakan model plat [6]. Model piring mengasumsikan bahwa kolom dapat dibagi menjadi sejumlah bagian, atau piring dan keseimbangan massa dapat dihitung untuk setiap piring individu. Pendekatan ini mendekati kurva kromatogram yang khas sebagai kurva distribusi Gaussian. Dengan melakukan ini, lebar kurva diperkirakan sebagai 4 kali standar deviasi dari kurva, 4σ. Waktu retensi adalah waktu dari awal deteksi sinyal dengan waktu ketinggian puncak kurva Gaussian.
Dari variabel pada gambar di atas, resolusi, nomor plat, dan tinggi piring model plat kolom dapat dihitung dengan menggunakan persamaan:
Resolusi (Rs):
Rs = 2 (TRB - tra) / (WB + WA) Dimana:
TRB = waktu retensi dari B terlarut TRA = waktu retensi zat terlarut A wb = Gaussian kurva lebar B terlarut Wa = Gaussian kurva lebar zat terlarut A Plat Nomor (N):
N = (TR2) / (w / 4) 2 Plat Tinggi (H): H = L / N
Dimana L adalah panjang kolom [6]. [Sunting] Column Adsorpsi Equilibrium
Untuk kolom adsorpsi, resin kolom (fase diam) terdiri dari microbeads. Bahkan partikel yang lebih kecil seperti protein, karbohidrat, ion logam, atau senyawa kimia lainnya yang terkonjugasi ke microbeads. Setiap partikel mengikat yang melekat pada microbead dapat diasumsikan untuk mengikat dalam rasio 1:1 dengan sampel zat terlarut dikirim melalui kolom yang perlu dimurnikan atau dipisahkan.
Mengikat antara molekul target untuk dipisahkan dan molekul mengikat manik-manik kolom dapat dimodelkan menggunakan reaksi kesetimbangan yang sederhana Keq = [CS] / ([C] [S]) di mana Keq adalah konstanta kesetimbangan, [C] dan [ S] adalah konsentrasi molekul target dan molekul mengikat resin kolom, masing-masing. [CS]
adalah konsentrasi kompleks dari molekul target terikat pada resin kolom. [6] Menggunakan ini sebagai dasar, tiga isoterm yang berbeda dapat digunakan untuk menggambarkan dinamika mengikat kromatografi kolom: linear, Langmuir, dan Freundlich.
Isoterm linear terjadi ketika konsentrasi zat terlarut perlu dimurnikan adalah relatif sangat kecil untuk molekul pengikatan. Dengan demikian, ekuilibrium dapat didefinisikan sebagai:
[CS] = Keq [C].
Untuk menggunakan skala industri, molekul yang mengikat total pada manik-manik kolom resin harus diperhitungkan karena situs kosong harus diperhitungkan.
Langmuir isoterm Freundlich dan isoterm berguna dalam menggambarkan keseimbangan ini. Langmuir isoterm:
[CS] = (KeqStot [C]) / (1 + Keq [C]), di mana Stot adalah molekul mengikat total pada manik-manik.
Freundlich isoterm: [CS] = Keq [C] 1 / n
Isoterm Freundlich digunakan ketika kolom dapat mengikat sampel yang berbeda dalam larutan yang perlu dimurnikan. Karena sampel yang berbeda memiliki konstanta mengikat yang berbeda dengan manik-manik, ada banyak yang berbeda Keq ini. Oleh karena itu, Langmuir isoterm bukan model yang baik untuk mengikat dalam hal ini. [6]
[Sunting] Lihat pula
• Kromatografi, sebuah artikel gambaran yang mencakup semua teknik kromatografi. • kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) untuk kromatografi kolom menggunakan tekanan tinggi.
• protein Cepat kromatografi cair (FPLC) untuk pemisahan protein menggunakan kromatografi kolom.
[
edit] References
1. ^ Still, W. C.; Kahn, M.; Mitra, A. J. Org. Chem. 1978, 43(14), 2923-2925. (doi:10.1021/jo00408a041)
2. ^ Laurence M. Harwood, Christopher J. Moody. Experimental organic chemistry: Principles
and Practice (Illustrated edition ed.). pp. 180-185. ISBN978-0632020171. 3. ^ Normal phase column chromatography, Material Harvest
4. ^ Fair, J. D.; Kormos, C. M. J. Chromatogr. A 2008, 1211(1-2), 49-54. (doi:10.1016/j.chroma.2008.09.085)
5. ^ Isolation of Three Components from Spearmint Oil: An Exercise in Column and Thin-Layer
Chromatography Davies, Don R.; Johnson, Todd M. J. Chem. Educ. 2007 84Abstract
6. ^ abcd Harrison et al. Bioseparations Science and Engineering. Oxford University Press. New York, New York. 2003