High performance liquid chromatography
.
Sebuah HPLC. Dari kiri ke kanan: Sebuah perangkat memompa menghasilkan gradien dari dua pelarut yang berbeda, kolom baja ditegakkan dan aparatus untuk mengukur absorbansi
HPLC apparatus.
Kromatografi cair kinerja tinggi (atau kromatografi cair tekanan tinggi, HPLC) merupakan bentuk kromatografi kolom sering digunakan dalam kimia biokimia dan analitis untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan menghitung senyawa berdasarkan polaritas istimewa mereka dan interaksi dengan fase diam kolom ini. HPLC menggunakan berbagai jenis fase diam (biasanya, hidrofobik rantai karbon jenuh), sebuah pompa yang menggerakkan fase gerak (s) dan analit melalui kolom, dan detektor yang memberikan waktu retensi charateristic untuk analit. Detektor juga dapat memberikan informasi characterisitc lainnya (yaitu UV / Vis data spektroskopi untuk analit jika demikian dilengkapi). Analit waktu retensi bervariasi tergantung pada kekuatan interaksi dengan fase diam, rasio / komposisi pelarut (s) yang digunakan, dan laju aliran fase gerak.
Dengan HPLC, pompa (bukan gravitasi) memberikan tekanan yang lebih tinggi diperlukan untuk mendorong fase mobile dan analit melalui kolom padat. Kepadatan meningkat muncul dari ukuran partikel yang lebih kecil. Hal ini memungkinkan untuk pemisahan yang lebih baik pada kolom panjang pendek bila dibandingkan dengan kromatografi kolom biasa. [Sunting] Operasi
Sampel yang akan dianalisis diperkenalkan dalam volume kecil dengan aliran fase gerak. Gerak analit melalui kolom diperlambat oleh bahan kimia tertentu atau interaksi fisik dengan fase diam seperti melintasi panjang kolom. Berapa banyak analit diperlambat tergantung pada sifat analit dan komposisi fase stasioner dan mobile. Waktu di mana mengelusi analit tertentu (keluar dari ujung kolom) disebut waktu retensi, waktu retensi dalam kondisi tertentu
dianggap sebagai karakteristik mengidentifikasi cukup unik dari analit tertentu. Penggunaan ukuran partikel yang lebih kecil kemasan kolom (yang menciptakan backpressure lebih tinggi) meningkatkan kecepatan linear memberikan komponen lebih sedikit waktu untuk menyebar dalam kolom, yang mengarah ke resolusi ditingkatkan dalam kromatogram yang
dihasilkan. Pelarut umum digunakan termasuk kombinasi bercampur air atau cairan organik berbagai (yang paling umum adalah metanol dan asetonitril). Air mungkin berisi buffer atau garam untuk membantu dalam pemisahan komponen analit, atau senyawa seperti asam trifluoroasetat yang bertindak sebagai agen pasangan ion.
Sebuah perbaikan lebih lanjut untuk HPLC telah bervariasi komposisi fase gerak selama analisis, hal ini dikenal sebagai elusi gradien. Sebuah gradien normal untuk kromatografi fase terbalik mungkin mulai metanol 5% dan kemajuan linear untuk metanol 50% lebih dari 25 menit, gradien yang dipilih tergantung pada seberapa hidrofobik analit tersebut. Gradien memisahkan campuran analit sebagai fungsi dari afinitas analit untuk komposisi fase saat bergerak relatif terhadap fase diam. Proses partisi ini mirip dengan apa yang terjadi selama ekstraksi cair-cair tetapi terus menerus, tidak bertahap. Dalam contoh ini, menggunakan gradien air / metanol, komponen lebih hidrofobik akan mengelusi (datang dari kolom) ketika fase gerak sebagian besar terdiri dari metanol (memberikan fase gerak relatif hidrofobik). Senyawa-senyawa yang lebih hidrofilik akan terelusi dalam kondisi metanol relatif rendah / air yang tinggi.
Pemilihan pelarut, aditif dan gradien tergantung pada sifat fase diam dan analit. Seringkali serangkaian tes yang dilakukan pada analit dan sejumlah berjalan sidang dapat diproses dalam rangka untuk menemukan metode HPLC yang memberikan pemisahan terbaik dari puncak.
[
edit] Types
[edit] Partition chromatography
HPLC moderen
Seorang diri modern yang terkandung HPLC. Dalam gambar ini, sebuah Agilent 1.200 terhubung ke PC
Partisi kromatografi adalah jenis pertama dari kromatografi yang dikembangkan kimiawan. Prinsip Koefisien partisi telah diterapkan dalam kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis, fase gas dan cairan-cairan aplikasi. 1952 Nobel Prize di bidang kimia itu diperoleh oleh Archer John Porter Martin dan Richard Laurence Millington Synge bagi perkembangan mereka dari teknik, yang digunakan untuk pemisahan mereka dari asam amino. Partisi kromatografi menggunakan pelarut dipertahankan, di permukaan atau di dalam biji-bijian atau serat dari matriks "lembam" pendukung yang solid seperti kromatografi kertas, atau mengambil keuntungan dari beberapa coulombic tambahan dan / atau hidrogen donor
interaksi dengan dukungan yang solid. Molekul menyeimbangkan (partisi) antara fase diam cair dan eluen. Dikenal sebagai Kromatografi Interaksi Hidrofilik (HILIC) di HPLC, metode ini memisahkan analit didasarkan pada perbedaan kutub. HILIC paling sering menggunakan fase terikat diam polar dan non-polar, air larut, fase gerak. Partisi HPLC telah digunakan historis pada silika tak terikat atau mendukung alumina. Masing-masing bekerja secara efektif untuk memisahkan analit oleh perbedaan kutub relatif, bagaimanapun, HILIC
memiliki keuntungan memisahkan asam, larutan basa dan netral dalam kromatogram tunggal. Analit polar berdifusi ke dalam lapisan air stasioner terkait dengan fase diam polar dan dengan demikian dipertahankan. Kekuatan retensi meningkat dengan polaritas analit
meningkat, dan interaksi antara analit polar dan fase diam polar (relatif terhadap fase gerak) meningkatkan waktu elusi. Kekuatan interaksi tergantung pada kelompok fungsional dalam molekul analit yang mempromosikan partisi tetapi juga dapat mencakup coulombic
(elektrostatik) interaksi dan kemampuan hidrogen donor.
Penggunaan pelarut polar lebih dalam fase gerak akan mengurangi waktu retensi analit, sedangkan pelarut hidrofobik lebih cenderung meningkatkan waktu retensi.
Partisi dan NP-HPLC telah jatuh dari kasih karunia di tahun 1970-an dengan perkembangan fase terbalik HPLC karena kurangnya reproduksibilitas waktu retensi sebagai air atau pelarut organik protik mengubah keadaan hidrasi dari silika atau media kromatografi alumina. Baru-baru ini telah menjadi berguna lagi dengan perkembangan fase terikat HILIC yang
meningkatkan reproduktifitas. [Sunting] kromatografi fase normal
Untuk detail lebih lanjut tentang topik ini, lihat kromatografi fasa air normal.
Juga dikenal sebagai HPLC fase normal (NP-HPLC), atau adsorpsi kromatografi, metode ini memisahkan analit didasarkan pada adsorpsi dengan kimia permukaan stasioner dan dengan polaritas. Itu adalah salah satu jenis pertama HPLC yang dikembangkan kimiawan. NP-HPLC menggunakan fase diam polar dan non-polar, non-berair fase gerak, dan bekerja efektif untuk memisahkan analit mudah larut dalam pelarut non-polar. Rekan analit dengan dan dipertahankan oleh fase diam polar. Kekuatan adsorpsi meningkat dengan polaritas analit meningkat, dan interaksi antara analit polar dan fase diam polar (relatif terhadap fase gerak) meningkatkan waktu elusi. Kekuatan interaksi tidak hanya tergantung pada kelompok fungsional dalam molekul analit, tetapi juga pada faktor sterik. Pengaruh sterics pada kekuatan interaksi memungkinkan metode ini untuk menyelesaikan (terpisah) isomer struktural.
Penggunaan pelarut polar lebih dalam fase gerak akan mengurangi waktu retensi analit, sedangkan pelarut hidrofobik lebih cenderung meningkatkan waktu retensi. Pelarut polar yang sangat dalam campuran cenderung menonaktifkan fase diam dengan menciptakan lapisan air stasioner terikat pada permukaan fase diam. Perilaku ini agak aneh bagi fase normal karena hal ini sangat murni mekanisme adsorptif (interaksi adalah dengan permukaan yang keras daripada lapisan lembut pada permukaan).
NP-HPLC jatuh dari kasih karunia di tahun 1970-an dengan perkembangan fase terbalik HPLC karena kurangnya reproduksibilitas waktu retensi sebagai air atau pelarut organik protik mengubah keadaan hidrasi dari silika atau media kromatografi alumina. Baru-baru ini telah menjadi berguna lagi dengan perkembangan fase terikat HILIC yang meningkatkan reproduktifitas.
[Sunting] Pemindahan kromatografi
Prinsip dasar kromatografi perpindahan adalah: Sebuah molekul dengan afinitas tinggi untuk matriks kromatografi (displacer) akan bersaing secara efektif untuk situs mengikat, dan dengan demikian menggantikan seluruh molekul dengan afinitas yang lebih rendah [1] Ada perbedaan jelas antara perpindahan dan kromatografi elusi. . Dalam modus elusi, zat biasanya muncul dari sebuah kolom di sempit, puncak Gaussian. Pemisahan yang luas dari puncak,
sebaiknya ke baseline, yang diinginkan untuk mencapai pemurnian maksimal. Kecepatan di mana setiap komponen campuran perjalanan ke kolom dalam mode elusi tergantung pada banyak faktor. Tapi untuk dua zat untuk melakukan perjalanan dengan kecepatan yang berbeda, dan dengan demikian dapat diselesaikan, harus ada perbedaan substansial dalam beberapa interaksi antara biomolekul dan matriks kromatografi. Parameter operasi yang disesuaikan untuk memaksimalkan efek dari perbedaan ini. Dalam banyak kasus, dasar pemisahan puncak dapat dicapai hanya dengan elusi gradien dan beban kolom yang rendah. Dengan demikian, dua kelemahan kromatografi elusi modus, terutama pada skala preparatif, adalah kompleksitas operasional, karena gradien pelarut memompa, dan throughput rendah, karena beban kolom yang rendah. Pemindahan kromatografi memiliki keunggulan
dibandingkan kromatografi elusi dalam komponen diselesaikan menjadi zona berturut-turut zat murni daripada "puncak". Karena proses mengambil keuntungan dari nonlinier dari isoterm, feed kolom yang lebih besar dapat dipisahkan pada kolom tertentu dengan komponen dimurnikan pulih pada konsentrasi lebih tinggi secara signifikan.
Reversed phase chromatography (RPC)
Sebuah kromatogram campuran kompleks (air parfum) diperoleh terbalik fase HPLC Untuk detail lebih lanjut tentang topik ini, lihat Terbalik-fase kromatografi.
Fase balik HPLC (RP-HPLC atau RPC) memiliki fase non-polar stasioner dan Aqueous, fase gerak cukup polar. Satu fase diam umum adalah silika yang telah diobati dengan RMe2SiCl, di mana R adalah gugus alkil rantai lurus seperti C18H37 atau C8H17. Dengan fase stasioner, waktu retensi lebih lama untuk molekul yang lebih non-polar, sedangkan molekul polar mengelusi lebih mudah. Penyidik dapat meningkatkan waktu retensi dengan menambahkan lebih banyak air ke fase gerak, sehingga membuat afinitas analit hidrofobik untuk fase relatif hidrofobik stasioner kuat ke fase gerak sekarang lebih hidrofilik. Demikian pula, penyidik dapat mengurangi waktu retensi dengan menambahkan lebih pelarut organik untuk eluen. RPC begitu umum digunakan yang sering salah disebut sebagai "HPLC" tanpa spesifikasi lebih lanjut. Industri farmasi secara rutin menggunakan RPC untuk memenuhi syarat obat sebelum pembebasan mereka.
RPC beroperasi pada prinsip kekuatan hidrofobik, yang berasal dari simetri tinggi dalam struktur air dipole dan memainkan peran paling penting dalam semua proses dalam ilmu kehidupan. RPC memungkinkan pengukuran kekuatan interaktif. Pengikatan analit ke fase diam sebanding dengan luas permukaan kontak sekitar segmen non-polar dari molekul analit pada hubungan dengan ligan dalam eluen air. Efek solvophobic didominasi oleh kekuatan air untuk "pengurangan rongga-" sekitar analit dan rantai-C18 versus kompleks keduanya. Energi yang dilepaskan dalam proses ini sebanding dengan tegangan permukaan eluen (air:
7.3 × 10-6 J / cm ², metanol: 2,2 × 10-6 J / cm ²) dan permukaan hidrofobik analit dan ligan masing . Retensi dapat dikurangi dengan menambahkan pelarut kurang polar (metanol, asetonitril) ke dalam fase gerak untuk mengurangi tegangan permukaan air. Elusi gradien menggunakan efek ini dengan secara otomatis mengurangi polaritas dan tegangan permukaan dari fase gerak berair selama analisis.
Sifat struktur molekul analit memainkan peran penting dalam karakteristik retensi. Secara umum, suatu analit dengan luas hidrofobik lebih besar permukaan (CH, CC, dan umumnya non-polar ikatan atom, seperti SS dan lain-lain) hasil dalam waktu retensi lebih lama karena meningkatkan non-polar permukaan molekul daerah, yang non -berinteraksi dengan struktur air. Di sisi lain, gugus polar, seperti-OH,-NH2, COO-atau-NH3 + mengurangi retensi karena mereka terintegrasi dengan baik ke dalam air. Molekul yang sangat besar, namun, dapat mengakibatkan interaksi yang tidak lengkap antara permukaan analit besar dan rantai alkil ligan dan dapat memiliki masalah memasuki pori-pori fase diam.
Waktu retensi meningkat dengan luas permukaan hidrofobik (non-polar). Senyawa rantai bercabang mengelusi lebih cepat dari isomer berhubungan linear karena luas permukaan keseluruhan menurun. Senyawa organik Similarly with ikatan CC single mengelusi lambat dibandingkan dengan C = C or CC-triple Bond sebagaimana ikatan ganda atau triple lebih pendek daripada single CC-bond.
Selain fase tegangan permukaan ponsel (kekuatan organisasi dalam struktur eluen), lainnya pengubah fase gerak dapat mempengaruhi retensi analit. Misalnya, penambahan garam anorganik menyebabkan peningkatan linear moderat dalam tegangan permukaan larutan berair (1,5 × 10-7 ca. J / cm ² Mol per untuk NaCl, 2,5 × 10-7 J / cm ² Mol per untuk (NH4) 2SO4), dan karena entropi dari interface analit-pelarut dikendalikan oleh tegangan
permukaan, penambahan garam cenderung meningkatkan waktu retensi. Teknik ini digunakan untuk pemisahan ringan dan pemulihan protein dan perlindungan dari aktivitas biologis mereka dalam analisis protein (kromatografi interaksi hidrofobik, HIC).
Komponen penting lainnya adalah pengaruh pH karena ini dapat mengubah hidrofobisitas analit. Untuk alasan ini metode yang paling menggunakan agen buffering, seperti natrium fosfat, untuk mengontrol pH. Buffer melayani beberapa tujuan: mereka mengontrol pH, menetralisir muatan pada setiap silika terkena residu pada fase diam dan bertindak sebagai agen pasangan ion untuk menetralkan muatan pada analit. Formate Amonium biasanya ditambahkan dalam spektrometri massa untuk meningkatkan deteksi analit tertentu dengan pembentukan adduct amonium. Suatu asam organik yang mudah menguap seperti asam asetat, atau asam formiat paling sering, sering ditambahkan ke fase gerak jika spektrometri massa digunakan untuk menganalisis kolom eluen. Asam trifluoroasetat jarang digunakan dalam aplikasi spektrometri massa karena kegigihan dalam detektor dan sistem pengiriman pelarut, tetapi bisa efektif dalam meningkatkan retensi analit seperti asam karboksilat dalam aplikasi menggunakan detektor lainnya, karena merupakan salah satu asam organik terkuat. Efek dari asam dan buffer bervariasi oleh aplikasi tetapi umumnya meningkatkan
kromatografi.
Kolom fase terbalik cukup sulit untuk merusak dibandingkan dengan kolom silika normal, namun, banyak kolom fase terbalik terdiri dari alkil partikel silika diderivatisasi dan tidak boleh digunakan dengan dasar air karena ini akan menghancurkan partikel silika yang
mendasarinya. Mereka dapat digunakan dengan asam encer, tetapi kolom tidak boleh terkena asam terlalu lama, karena bisa menimbulkan korosi bagian logam dari peralatan HPLC. RP-HPLC kolom harus memerah dengan pelarut bersih setelah digunakan untuk menghapus sisa asam atau buffer, dan disimpan dalam sebuah komposisi yang tepat dari pelarut. Kandungan logam dari kolom HPLC harus tetap rendah jika kemampuan terbaik untuk zat terpisah dipertahankan. Sebuah tes yang baik untuk kandungan logam dari kolom adalah untuk menyuntikkan sampel yang merupakan campuran dari 2,2 dan 4,4' - bipiridin. Karena 2,2
'-bipy dapat khelat logam, bentuk puncak untuk 2,2'-'-bipy akan terdistorsi (ekor) ketika ion logam yang hadir pada permukaan silika. [Rujukan?] ..
[Sunting] Ukuran kromatografi eksklusi
Untuk detail lebih lanjut tentang topik ini, lihat kromatografi eksklusi ukuran.
Ukuran kromatografi eksklusi (SEC), juga dikenal sebagai kromatografi permeasi gel atau kromatografi gel filtrasi, memisahkan partikel berdasarkan ukuran. Ini umumnya merupakan kromatografi resolusi rendah sehingga sering dicadangkan untuk langkah final, "polishing" pemurnian a. Hal ini juga berguna untuk menentukan struktur tersier dan struktur kuaterner protein dimurnikan. SEC digunakan terutama untuk analisis molekul besar seperti protein atau polimer. SEC bekerja dengan menjebak molekul-molekul yang lebih kecil dalam pori-pori partikel. Molekul-molekul yang lebih besar hanya melewati pori-pori-pori-pori karena mereka terlalu besar untuk masuk ke pori-pori. Oleh karena itu molekul yang lebih besar mengalir melalui kolom lebih cepat daripada molekul yang lebih kecil, yaitu lebih kecil molekul, semakin lama waktu retensi.
Teknik ini banyak digunakan untuk penentuan berat molekul polisakarida. SEC adalah teknik resmi (suggested by European Pharmacopeia) untuk perbandingan berat molekul yang berbeda tersedia secara komersial molekul rendah heparins berat.
[Sunting] Ion kromatografi penukar
Untuk detail lebih lanjut tentang topik ini, lihat pertukaran ion kromatografi.
Dalam pertukaran ion kromatografi, retensi didasarkan pada daya tarik antara ion terlarut dan situs dibebankan terikat pada fase diam. Ion muatan yang sama dikecualikan. Jenis penukar ion meliputi:
• Polistirena resin - Ini memungkinkan hubungan lintas yang meningkatkan stabilitas rantai. Tinggi linkage lintas Mengurangi meliuk, yang meningkatkan waktu ekuilibrasi dan akhirnya meningkatkan selektivitas.
• Selulosa dan ion dekstran penukar (gel) - Ini memiliki ukuran pori yang lebih besar dan kepadatan muatan yang rendah membuat mereka cocok untuk pemisahan protein.
• Controlled-pori kaca atau silika berpori
Secara umum, penukar ion mendukung pengikatan ion biaya tinggi dan jari-jari yang lebih kecil.
Peningkatan ion tanding (berkenaan dengan kelompok-kelompok fungsional dalam resin) konsentrasi mengurangi waktu retensi. Peningkatan pH mengurangi waktu retensi dalam pertukaran kation sementara penurunan pH mengurangi waktu retensi dalam pertukaran anion.
Bentuk kromatografi secara luas digunakan dalam aplikasi berikut: pemurnian air,
prekonsentrasi komponen jejak, ligan-kromatografi penukar, pertukaran ion kromatografi protein, tinggi-pH anion-kromatografi penukar karbohidrat dan oligosakarida, dan lain-lain. [Sunting] Bioaffinity kromatografi
Proses kromatografi bergantung pada properti dari zat biologis aktif untuk membentuk stabil, kompleks yang spesifik, dan reversibel. Pembentukan kompleks ini melibatkan partisipasi pasukan molekul umum seperti Van der Waals interaksi, interaksi elektrostatik, dipol-dipol interaksi, interaksi hidrofobik, dan ikatan hidrogen. Ikatan, efisien biospecific dibentuk oleh aksi simultan dan terpadu dari beberapa kekuatan di situs mengikat pelengkap.
[Sunting] kromatografi fase berair yang normal
Aqueous fase kromatografi normal (ANP) adalah teknik kromatografi yang meliputi wilayah fase gerak antara fase terbalik kromatografi (RP) dan organik kromatografi fase normal (ONP). Teknik ini digunakan untuk mencapai selektivitas unik untuk senyawa hidrofilik, menunjukkan elusi fase normal yang menggunakan reverse-fase pelarut. [Rujukan?] [Sunting] isokratik aliran dan elusi gradien
isokratik (berarti komposisi konstan). Kata ini diciptakan oleh Csaba Horvath dari Universitas Yale [rujukan?], Yang merupakan salah satu pelopor dari HPLC.
Komposisi fase gerak tidak harus tetap konstan. Sebuah pemisahan di mana komposisi fase gerak berubah selama proses pemisahan digambarkan sebagai elusi gradien. [2] Salah satu contoh adalah gradien mulai metanol 10% dan berakhir pada metanol 90% setelah 20 menit. Kedua komponen dari fase gerak biasanya disebut "A" dan "B", A adalah "lemah" pelarut yang memungkinkan zat terlarut untuk mengelusi hanya perlahan-lahan, sedangkan B adalah "kuat" pelarut yang cepat elutes zat terlarut dari kolom . Sebuah pelarut sering air, sedangkan B adalah pelarut organik bercampur dengan air, seperti asetonitril, metanol, THF, atau
isopropanol.
Dalam elusi isokratik, lebar puncak meningkat dengan waktu retensi linear menurut persamaan untuk N, jumlah pelat teoritis. Hal ini menyebabkan kerugian yang terlambat-eluting puncak menjadi sangat datar dan luas. Bentuk dan lebar dapat menjaga mereka dari yang diakui sebagai puncak.
Elusi gradien mengurangi retensi nanti-eluting komponen sehingga mereka mengelusi lebih cepat, memberikan sempit (dan lebih tinggi) untuk komponen yang paling puncak. Ini juga meningkatkan bentuk puncak untuk puncak ekor, sebagai meningkatnya konsentrasi eluen organik mendorong bagian tailing dari puncak ke depan. Ini juga meningkatkan tinggi puncak (peak terlihat "tajam"), yang penting dalam analisis jejak. Program gradien mungkin
termasuk mendadak "langkah" peningkatan persentase komponen organik, atau lereng yang berbeda pada waktu yang berbeda - semua sesuai dengan keinginan untuk pemisahan optimum dalam waktu yang minimal.
Dalam elusi isokratik, selektivitas tidak berubah jika dimensi kolom (panjang dan diameter dalam) perubahan - yaitu, elusi puncak dalam urutan yang sama. Dalam elusi gradien, urutan elusi dapat berubah sebagai dimensi atau perubahan laju alir. [Rujukan?]
Kekuatan pendorong yang berasal dari kromatografi fase terbalik dalam urutan tinggi struktur air. Peran fase gerak organik adalah untuk mengurangi urutan tinggi dengan mengurangi kekuatan penghambat dari komponen berair.
[Sunting] Parameter [Sunting] diameter internal
Diameter internal (ID) dari kolom HPLC merupakan parameter penting yang mempengaruhi sensitivitas deteksi dan selektivitas pemisahan elusi gradien. Hal ini juga menentukan kuantitas analit yang dapat dimuat ke kolom. Kolom besar biasanya terlihat dalam aplikasi industri, seperti pemurnian produk obat untuk digunakan nanti. Rendah-ID kolom telah meningkatkan sensitivitas dan konsumsi pelarut lebih rendah dengan mengorbankan kapasitas loading.
• kolom ID yang lebih besar (lebih dari 10 mm) yang digunakan untuk memurnikan jumlah bahan yang dapat digunakan karena kapasitas beban yang besar.
• kolom skala Analytical (4.6 mm) telah menjadi jenis yang paling umum dari kolom, kolom meskipun kecil dengan cepat mendapatkan popularitas. Mereka digunakan dalam analisis kuantitatif tradisional sampel dan sering menggunakan detektor absorbansi UV-Vis. • Narrow-bore kolom (1-2 mm) yang digunakan untuk aplikasi saat sensitivitas lebih diinginkan baik dengan khusus UV-vis detektor, deteksi fluoresensi atau dengan metode deteksi lainnya seperti kromatografi cair-spektrometri massa
• Kolom kapiler (di bawah 0,3 mm) yang digunakan hampir secara eksklusif dengan deteksi alternatif berarti seperti spektrometri massa. Mereka biasanya terbuat dari kapiler leburan silika, daripada tabung stainless steel yang lebih besar mempekerjakan kolom.
[Sunting] Ukuran partikel
HPLC paling tradisional dilakukan dengan fase diam melekat pada bagian luar kecil partikel silika bulat (manik-manik yang sangat kecil). Partikel ini datang dalam berbagai ukuran
dengan 5 pM manik yang paling umum. Partikel yang lebih kecil umumnya memberikan luas permukaan lebih banyak dan pemisahan yang lebih baik, tetapi tekanan yang dibutuhkan untuk meningkatkan kecepatan optimal linear dengan kebalikan dari kuadrat diameter partikel [3] [4] [5].
Ini berarti bahwa perubahan partikel yang setengah besar, menjaga ukuran kolom yang sama, akan menggandakan kinerja, tetapi meningkatkan tekanan yang dibutuhkan dengan faktor empat. Partikel yang lebih besar yang digunakan dalam HPLC preparatif (diameter kolom 5 cm sampai dengan> 30 cm) dan untuk non-HPLC aplikasi seperti solid-fase ekstraksi.