Tempat terkonsentrasi kecil solusi yang berisi sampel zat terlarut diterapkan pada secarik kertas kromatografi sekitar dua cm dari dasar piring, biasanya menggunakan tabung kapiler untuk presisi maksimum. Sampel ini diserap ke kertas dan dapat membentuk interaksi dengan itu. Setiap zat yang bereaksi atau obligasi dengan kertas tidak dapat diukur dengan
menggunakan teknik ini. Makalah ini kemudian dicelupkan ke dalam perawatan pelarut, seperti etanol atau air, mengambil tempat cocok yang berada di atas permukaan pelarut, dan ditempatkan dalam wadah tertutup.
molekul pelarut untuk kertas, hal ini juga dapat dijelaskan sebagai diferensial adsorpsi dari komponen zat terlarut ke dalam pelarut. Sebagai pelarut naik melalui kertas itu bertemu dan melarutkan campuran sampel, yang kemudian akan melakukan perjalanan ke kertas dengan sampel zat terlarut pelarut. Berbeda senyawa dalam campuran sampel pada tingkat yang berbeda karena perbedaan dalam kelarutan dalam pelarut, dan karena perbedaan ketertarikan mereka pada serat di koran. Komponen lebih mudah larut yang lebih lanjut ia pergi.
Kromatografi kertas mengambil mana saja dari beberapa menit sampai beberapa jam. Dalam beberapa kasus, kromatografi kertas tidak pigmen terpisah sepenuhnya, ini terjadi ketika dua zat tampaknya memiliki nilai yang sama dalam pelarut tertentu. Dalam kasus ini, dua arah kromatografi digunakan untuk memisahkan beberapa tempat-pigmen.
[Sunting] kromatografi Ascending
Dalam metode ini, pelarut adalah di kolam renang di bagian bawah kapal di mana kertas yang supported.The cromatogram menaik dilipat di atas batang gelas yang setengah lainnya menjadi teknik chromatogram.This turun memberikan pemisahan cepat seperti yang dari teknik individu .
[Sunting] kromatografi Descending
Dalam metode ini, pelarut disimpan dalam sebuah palung di bagian atas ruangan dan dibiarkan mengalir ke bawah kertas. Cairan bergerak turun oleh aksi kapiler serta oleh gaya gravitasi, sehingga metode ini juga dikenal sebagai metode gravitasi. [Rujukan?] Dalam hal ini, aliran lebih cepat dibandingkan dengan metode ascending, dan kromatografi adalah menyelesaikan lebih cepat. Aparat dibutuhkan untuk kasus ini lebih canggih. Pelarut berkembang ditempatkan di palungan di bagian atas yang biasanya terdiri dari bahan inert. Makalah ini kemudian ditangguhkan dalam pelarut. Zat yang tidak dapat dipisahkan dengan metode naik kadang-kadang dapat dipisahkan dengan metode menurun. [Rujukan?]
[Sunting] Kromatografi sebagai seni
Kromatografi dapat digunakan sebagai alternatif seni karena warna tertentu yang
menciptakan, tapi kromatografi kertas jarang menghasilkan warna dipahami jika dijalankan dengan benar. Kadang-kadang, hasil kromatografi dapat memulai dengan yang tidak
diinginkan "berdaun" warna, tetapi jika dilakukan dengan benar dan lengkap, warna megah dapat diproduksi.
[Sunting] Rƒ nilai
Nilai Rƒ dapat didefinisikan sebagai rasio dari jarak yang ditempuh oleh substansi ke jarak yang ditempuh oleh pelarut. Nilai Rƒ biasanya dinyatakan sebagai pecahan dari dua tempat desimal tetapi disarankan oleh Smith bahwa angka persentase harus digunakan sebagai gantinya. Jika Rƒ nilai solusi adalah nol, zat terlarut tetap dalam fase diam dan dengan demikian itu bergerak. Jika Rƒ value = 1 maka zat terlarut tidak memiliki afinitas untuk fase diam dan perjalanan dengan pelarut depan.
[Sunting] Penemuan
Munculnya kromatografi perpindahan dapat dikaitkan dengan Tiselius [1], yang pada tahun 1943 pertama kali diklasifikasikan mode kromatografi yang frontal, elusi, dan perpindahan. Kromatografi Pemindahan sejak menemukan berbagai aplikasi dari isolasi unsur transuranic [2] untuk entitas biokimia [3]. Pemindahan kromatografi adalah metode kromatografi di mana komponen diselesaikan dalam berturut-turut "persegi panjang" zona zat murni sangat terkonsentrasi daripada pelarut dipisahkan "puncak". Molekul-molekul dipaksa untuk bermigrasi ke kolom oleh gelombang maju dari molekul displacer yang memiliki afinitas yang lebih tinggi untuk fase diam daripada larutan umpan. [4] Karena migrasi paksa, konsentrasi produk yang lebih tinggi dan kemurnian dapat diperoleh dibandingkan dengan moda lain kromatografi. Teknik ini ditemukan kembali oleh Horvath [5] dan telah sejak menemukan banyak aplikasi, terutama di bidang pemurnian makromolekul biologi. [Sunting] Prinsip
Prinsip dasar kromatografi perpindahan adalah: Sebuah molekul dengan afinitas tinggi untuk matriks kromatografi (displacer) akan bersaing secara efektif untuk situs mengikat, dan dengan demikian menggantikan seluruh molekul dengan afinitas yang lebih rendah [6] Ada perbedaan jelas antara perpindahan dan kromatografi elusi. . Dalam modus elusi, zat biasanya muncul dari sebuah kolom di sempit, puncak Gaussian. Pemisahan yang luas dari puncak, sebaiknya ke baseline, yang diinginkan untuk mencapai pemurnian maksimal. Kecepatan di mana setiap komponen campuran perjalanan ke kolom dalam mode elusi tergantung pada banyak faktor. Tapi untuk dua zat untuk melakukan perjalanan dengan kecepatan yang berbeda, dan dengan demikian dapat diselesaikan, harus ada perbedaan substansial dalam beberapa interaksi antara biomolekul dan matriks kromatografi. Parameter operasi yang disesuaikan untuk memaksimalkan efek dari perbedaan ini. Dalam banyak kasus, dasar pemisahan puncak dapat dicapai hanya dengan elusi gradien dan beban kolom yang rendah. Dengan demikian, dua kelemahan kromatografi elusi modus, terutama pada skala preparatif, adalah kompleksitas operasional, karena gradien pelarut memompa, dan throughput rendah, karena beban kolom yang rendah. Pemindahan kromatografi memiliki keunggulan
dibandingkan kromatografi elusi dalam komponen diselesaikan menjadi zona berturut-turut zat murni daripada "puncak". Karena proses mengambil keuntungan dari nonlinier dari isoterm, feed kolom yang lebih besar dapat dipisahkan pada kolom tertentu dengan komponen dimurnikan pulih pada konsentrasi lebih tinggi secara signifikan.
[Sunting] Teori dan Metode
Seperti ditunjukkan di atas, proses kromatografi perpindahan dapat dipecah menjadi tiga tahap yang berbeda: loading, perpindahan, dan regenerasi. Demi kesederhanaan, contoh pemurnian biomolecule diberikan di sini akan dibatasi untuk protein. Pada prinsipnya, semua biomolekul kepentingan komersial saat ini - termasuk oligonukleotida dan antibodi - dapat dimurnikan dalam mode perpindahan, dengan pilihan yang tepat matriks kolom dan displacer. Memuat fase
Pemurnian dimulai dengan kolom disetimbangkan dengan buffer pemuatan mirip dengan metode kromatografi elusi. Campuran pakan yang mengandung protein murni dalam buffer dimuat ke kolom pada tingkat yang cukup lambat, dalam kondisi di mana bahan baik dipertahankan. Tujuan dari langkah ini adalah untuk memulai pengikatan biomolekul dalam keadaan semiequilibrium. Hal ini ditunjukkan dalam grafik sebagai campuran protein dimulai pemisahan awal ke komponen kuning dan ungu.
Perpindahan fase
Setelah sampel telah dimuat, kolom diberi makan larutan displacer pada konsentrasi yang cukup rendah (biasanya 5 mM) dalam buffer yang sama yang digunakan untuk memuat sampel. Displacer ini dirancang untuk mengikat lebih erat dengan matriks dari salah satu biomolekul dan dengan demikian "mendorong" semua komponen campuran dari matriks depan itu. Selama masing-masing komponen sampel dan displacer tersebut tidak ireversibel teradsorpsi pada matriks kolom, ada beberapa dari masing-masing terus menyerap ke, dan dari desorbing, matriks.
Dalam modus elusi, hasil yang optimal diperoleh ketika konsentrasi sangat rendah sehingga komponen individu bertindak independen dan tidak bersaing untuk situs mengikat matriks. Dalam modus perpindahan, komponen sampel diperkenalkan dalam bentuk yang jauh lebih terkonsentrasi, dan sehingga memungkinkan untuk komponen yang mengikat kuat - baik displacer atau salah satu protein dalam campuran sampel - bersaing untuk situs mengikat. Komponen mengikat kuat (awalnya, displacer sendiri) kemudian menggantikan dengan berhasil bersaing untuk situs mengikat. Berdasarkan kekuatan masing-masing mengikat, setiap komponen dalam sampel asli kemudian menjadi "displacer" untuk komponen kurang terikat erat berikutnya. Jadi kereta perpindahan didirikan sebagai berdekatan, band terfokus
dengan sedikit tumpang tindih (kuning dan ungu dalam grafik). Dalam menjalankan sukses, kereta sepenuhnya dibentuk sebelum komponen bunga tiba di bagian bawah kolom. Pecahan dapat dikumpulkan dan pemotongan produk yang diinginkan dibuat.
regenerasi fase
Ketika displacer yang menerobos, yaitu, mulai muncul dari kolom, jalankan selesai dan regenerasi kolom dapat dimulai. Regenerasi dilakukan dengan menggunakan buffer yang dapat menghapus displacer dari matriks, diikuti oleh equilibrium dengan memuat penyangga dalam persiapan untuk menjalankan berikutnya. Karena displacers harus mengikat lebih kuat dari protein apapun yang dimurnikan, maka diharapkan bahwa penghapusan mereka dari kolom harus memerlukan beberapa kondisi khusus. Bagian non-sepele dari desain yang displacer baik, maka, adalah penggabungan dari beberapa fitur struktural yang
memungkinkan untuk penghapusan lengkap dari matriks di bawah beberapa kondisi.
Keuntungan dari kromatografi perpindahan
Sebuah perbedaan penting antara perpindahan dan kromatografi langkah gradien adalah bahwa bagian depan displacer selalu tetap di belakang zona pakan yang berdekatan dalam kereta perpindahan sedangkan desorbents (misalnya, garam dalam pertukaran ion, pengubah organik dalam fase terbalik kromatografi) bergerak melalui zona pakan. Modus perpindahan kromatografi mengambil keuntungan dari karakteristik termodinamika dari sistem
kromatografi untuk mengatasi banyak kekurangan elusi kromatografi preparatif dan gradien. Ini karakteristik perpindahan membuatnya kurang peka terhadap beban pakan daripada mode elusi operasi, sehingga memungkinkan untuk memberikan throughputs proses yang lebih tinggi. Keuntungan lain adalah resolusi tinggi yang dapat memberikan perpindahan
dibandingkan dengan proses elusi. Pemindahan kromatografi memanfaatkan kompetisi, nonlinear multikomponen antara komponen yang akan dipisahkan, sehingga dalam resolusi yang lebih tinggi, khususnya di kalangan spesies yang terkait erat. Sebaliknya, dalam proses elusi (misalnya, linear gradien, gradien langkah), pemisahan terjadi di bawah kondisi yang mengikat relatif lemah (yang penting untuk mendapatkan dari zat terlarut kolom). Faktor pemisahan antara zat terlarut dengan demikian lebih rendah dalam elusi daripada di
pengungsian, menyebabkan resolusi miskin dalam mode elusi operasi. Keuntungan lain dari perpindahan termasuk kontrol yang lebih baik atas konsentrasi produk dan munculnya produk dalam konsentrasi yang relatif rendah pengubah fase gerak. Kombinasi throughputs tinggi dan resolusi tinggi dalam suatu proses tunggal membuat perpindahan modus operasi yang menarik untuk pemurnian protein.
[
edit] Applications
Pemurnian kromatografi protein dari campuran kompleks bisa sangat menantang, terutama ketika campuran mengandung protein yang sama dipertahankan atau bila diinginkan untuk memperkaya komponen jejak dalam feed. Selanjutnya, beban kolom sering terbatas ketika resolusi tinggi diperlukan menggunakan mode tradisional kromatografi (misalnya linear gradien, isokratik kromatografi). Dalam kasus ini, kromatografi perpindahan merupakan teknik yang efisien untuk pemurnian protein dari campuran kompleks pada beban tinggi kolom dalam berbagai aplikasi. Sebuah kemajuan penting dalam keadaan seni kromatografi pemindahan adalah pengembangan rendah displacers massa molekul untuk pemurnian
protein dalam sistem pertukaran ion [7]. [8] [9]. Penelitian ini adalah signifikan dalam bahwa itu mewakili keberangkatan utama dari kebijaksanaan konvensional bahwa polimer
polyelectrolyte besar dibutuhkan untuk menggantikan protein dalam sistem pertukaran ion. Rendah displacers massa molekul memiliki keuntungan operasional yang signifikan
dibandingkan dengan displacers polyelectrolyte besar. Misalnya, jika ada tumpang tindih antara displacer dan protein yang menarik, bahan-bahan massa molekul rendah dapat dengan mudah dipisahkan dari protein dimurnikan selama pasca-perpindahan pengolahan
menggunakan ukuran standar berbasis metode pemurnian (misalnya ukuran kromatografi eksklusi, ultrafiltrasi) . Selain itu, perilaku garam bergantung adsorpsi ini displacers MW rendah sangat memudahkan regenerasi kolom. Ini displacers telah digunakan untuk berbagai macam pemisahan resolusi tinggi di sistem pertukaran ion [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16]. Selain itu, kegunaan kromatografi perpindahan untuk pemurnian faktor pertumbuhan
rekombinan [17], antigen protein vaksin [18] dan oligonukleotida antisense [19] juga telah ditunjukkan. Ada beberapa contoh di mana perpindahan kromatografi telah diterapkan pada pemurnian protein menggunakan pertukaran ion, interaksi hidrofobik, serta terbalik
kromatografi fase [20]. Kromatografi Pemindahan cocok untuk memperoleh jumlah mg protein dimurnikan dari campuran kompleks dengan menggunakan kolom kromatografi standar analitis pada skala bangku. Hal ini juga sangat cocok untuk memperkaya komponen jejak dalam feed. Kromatografi Pemindahan dapat dengan mudah dilakukan dengan
menggunakan berbagai sistem resin termasuk, pertukaran ion, HIC dan RPLC [21], [22] Dua-dimensi kromatografi merupakan pendekatan yang paling menyeluruh dan ketat untuk evaluasi proteome. Sementara pendekatan diterima sebelumnya telah digunakan pendekatan modus elusi kromatografi seperti pertukaran kation HPLC fase terbalik, hasil biasanya sangat rendah membutuhkan kepekaan analitis dalam picomolar berkisar femptomolar [23]. Sebagai kromatografi Pemindahan menawarkan keuntungan dari konsentrasi komponen jejak, dua dimensi kromatografi memanfaatkan perpindahan daripada modus elusi pada langkah kromatografi hulu merupakan alat yang berpotensi kuat untuk analisis komponen jejak, modifikasi, dan identifikasi komponen dinyatakan minor proteome. [ 24]
[
edit] References
1. ^ A. Tiselius. Displacement development in adsorption analysis. Ark. Kemi. Mineral Geol. 16A: 1–18 (1943).
2. ^ G. T. Seaborg. The Transuranium Elements. Science 104(2704):379-386 (1946).
3. ^ J. Frenz and C.S. Horvath. High performance displacement chromatography. pp 212-314 in C. Horvath (Ed.) High Performance Liquid Chromatography-advances and perspectives. Vol. 5, Academic Press, San Diego, CA.
4. ^ N. Tugcu . Purification of proteins using displacement chromatography. pp 71-89 in M. Zachariou (Ed.) Methods in Molecular Biology: Vol 421 Affinity Chromatography: Methods and Protocols. 2nd edition. Humana Press, Totowa NJ.
5. ^ C.S. Horvath, A. Nahum, and J. Frenz. High performance displacement chromatography. J. Chromatogr. 218, 365–393(1981).
6. ^ Displacement Chromatography 101. [1] Sachem, Inc. Austin, TX 78737
7. ^ S. M. Cramer and G. Jayaraman, Current Opinions in Biotechnology 4: 217-225, (1993)
8. ^ G. Jayaraman, S. Gadam, and S. M. Cramer. J. Chromatogr. A 630:53-68. (1993)
9. ^ G. Jayaraman, Y. Li, J. A. Moore, and S. M. Cramer. J. Chromatogr. A 702:143-155. (1995)
10.^ A. Kundu, S. Vunnum, G. Jayaraman, and S. M. Cramer. Biotech. and Bioeng. 48: 452-460. (1995)
11.^ A. Kundu, S. Vunnum, and S. M. Cramer. J. Chromatogr. A, 707:57-67. (1995)
12.^ A. Kundu, S. Vunnum, and S. M. Cramer. Adsorption 4:3-4. (1998)
13.^ A. Kundu, K. Barnthouse, and S. M. Cramer. Biotech. and Bioeng., 56:119-129. (1997)
14.^ KA. Kundu, A. A. Shukla, K. A. Barnthouse, J. Mooreand S. M. Cramer. BioPharm 10 :64. (1997)
15.^ A. Kundu, and S. M. Cramer. Anal. Biochem., 248:111-116. ( 1997)
16.^ A. A. Shukla, K. A. Barnthouse, S. S. Bae, J. A. Moore, and S. M. Cramer.. J. Chromatogr. A 814:1-2. (1998)
17.^ K. A. Barnthouse, W. Trompeter, R. Jone, P. Inampudi, R.Rupp, and S. M. Cramer. J. Biotechnol. 66:125-136 (1998)
18.^ A. A. Shukla, R. L. Hopfer, D. N. Chakravarti, E. Bortell, and S. M. Cramer. Biotechnol. Prog. 14: 91-101(1998)
19.^ N. Tugcu, R. R. Deshmukh, Y. S. Sangvic, J. A. Moored, and S. M. Cramer J. Chromatogr. A 923:65-73(2001)
20.^ R. Freitag and J. Breier. J. Chromatogr. A 691, 101–112 (1995).
21.^ Trace Component Amplification. [2] Sachem, Inc. Austin, TX 78737
22.^ N. Tugcu, R. R. Deshmukh, Y. S. Sanghvi, and S. M. Cramer. Reactive and Functional Polymers 54, 37–47(2003).
23.^ . E. Nagele, M. Vollmer, P. Horth, and C. Vad. 2D-LC/MS techniques for the identification of proteins in highly complex mixtures. Expert Reviews in Proteomics. Vol. 1, No. 1, Pages 37-46 (2004).
24.^ 2D-HPLC Course SACHEM, Inc. Austin, TX, 78737[3]
Retrieved from "http://en.wikipedia.org/wiki/Displacement_chromatography" 4.4. TLC, kolom dan