SUB-KEGIATAN PRODUK KOMERSIAL
BAHAN DAN METODE Artemisia annua Double Artenua
Perbanyakan tunas Double Artenua poliploid secara in vitro
Kultur tunas Double Artenua poliploid hasil perlakuan kolkisin telah diperoleh pada tahun 2013. Perbanyakan mulai dilakukan pada tahun 2014 menggunakan media MS (Murashige and Skoog, 1962) tanpa penambahan zat pengatur tumbuh. Pada media ditambahkan 20 g/l gula dan dipadatkan dengan 8 g/l agar. Sterilisasi media dilakukan dengan menggunakan otoklaf dengan suhu 120oC, tekanan 1 atm selama 15 menit. Eksplan yang dipergunakan untuk perbanyakan adalah tunas pucuk dengan panjang sekitar 1 cm dan buku tunggal. Kultur disimpan pada ruang kultur dengan suhu 26-27oC dengan penyinaran kontinyu. Sekitar 4-5 minggu dilakukan perbanyakan dengan metode yang sama pada medium dengan komposisi nutrisi yang sama.
Pembentukan planlet diinisiasi dengan menggunakan eksplan tunas pucuk dengan ukuran panjang sekitar 2 cm dan buku tunggal. Setelah eksplan ditanam pada medium MS tanpa zat pengatur tumbuh selama 2-3 minggu terbentuk akar. Cara ini dilakukan secara rutin untuk mendapatkan planlet. Sebagian planlet diperbanyak untuk stok dan sebagian lagi dipeliharan hingga 6 minggu. Setelah akar-akar mempunyai panjang lebih dari 2 cm dapat dilakukan aklimatisasi.
Aklimatisasi planlet
Planlet yang telah berumur 5-6 minggu yang mempunyai akar dengan panjang lebih dari 2 cm siap diaklimatisasi. Secara perlahan-lahan planlet dikeluarkan dari botol, akar dicuci dengan air secara hati-hati untuk menghilangkan media agar. Setelah itu planlet ditanam pada polibag atau tray yang telah diisi dengan campuran tanah dan kompos (1 : 1), kemudian disungkup dengan plastik transparan dan ditempatkan di tempat yang teduh. Setelah muncul beberapa helai daun baru, tanaman dipindahkan di rumah kaca. Aklimatisasi akan dilakukan di Cibodas. Setelah 3-4 minggu tanaman siap ditanam di lapangan.
Konfirmasi stabilitas ploidi kultur A. annua poliploid dan yang diaklimatisasi di lapang dengan flowsitometer.
Konfirmasi stabilitas ploidi dilakukan dengan menggunakan prosedur menurut Hafiizh et al (2013). Sampel dibaca pada panjang gelombang 440 nm dan kecepatan 1000 nuclei per detik. Tanaman diploid dipergunakan sebagai standard dan kandungan DNA-nya dikalibrasi sehingga mendapatkan puncak apektrum pada channel 200. Tanaman triploid menunjukkan puncak pada channel 300 dan tetraploid menunjukkan puncak pada channel 400, dan tanaman miksoploid menunjukkan lebih dari 1 puncak pada channel yang berbeda. Rata-rata kandungan DNA dari tiap-tiap sampel pada setiap puncak dibandingkan dengan tanaman kontrol diploid. Tingkat ploidinya ditentukan sesuai dengan kelipatan rata- rata kandungan DNA.
Budidaya dan Uji agronomi artenua di lapangan.
Tanaman poliploidi (Double Artenua) hasil perbanyakan kultur in vitro yang telah diaklimatisasi selama 3-4 minggu dijadikan sebagai bahan tanam. Jarak tanam yang digunakan yaitu 50x50 cm. Jarak antar bedeng yaitu 50 cm. Pemupukan menggunakan NPK 40:40:40 kg/ha. Pemupukan pertama yaitu pupuk P 40kg/ha, dan pupuk N dan K masing-masing 20kg/ha diberikan satu minggu setelah tanam. Pemupukan susulan dilakukan satu bulan setelah tanam menggunakan pupuk N dan K masing-masing 20 kg/ha. Parameter yang diamati yaitu tinggi tanaman, jumlah cabang, laju pertumbuhan tinggi tanaman (cm/minggu), dan laju pertambahan jumlah cabang (jumlah/minggu).
Disamping tanaman hasil kultur in vitro, dilakukan juga uji agronomi terhadap bibit F1 tanaman poliploid A.annua. Bibit ini merupakan turunan pertama dari induk tanaman poliploid yang ditanam tahun 2014. Tanaman induk terdiri atas tanaman tetraploid (C.1.i, C.2.C, K.3.2.1, dan OR.2.C), miksoploid (C1C, C1H, C3C, C3D, C3E, dan K.3.2.6), tanaman diploid (C.2.F dan C.1.G), dan tanaman hasil radiasi gamma (R2F). Cara penanaman dan pengamatan sama dengan tanaman yang berasal dari hasil perbanyakan kultur in vitro.
Selain itu dilakukan juga percobaan pengaruh pembuangan tunas pucuk terhadap alokasi biomassa pada A. annua. Sebanyak 60 bibit A. annua dari biji ditanam di lahan dengan jarak tanam 50x50 cm. pemupukan dilakukan seperti pada penjelasan sebelumnya. Perlakuan terdiri atas pemangkasan tunas pucuk satu kali (P1), dua kali (P2), dan kontrol. Pemangkasan dilakukan dengan teknik perompesan/pinching pada tunas pucuk (gerombol tunas bagian meristematik dan 3 helai daun dibawahnya) seperti yang dijelaskan oleh Towler dan Weathers (2015). Waktu pemangkasan yaitu 6 minggu setelah tanam, untuk P1 dan P2, dan 8 minggu setelah tanam untuk P2. Parameter yang diamati yaitu bobot kering daun, batang, akar, dan proporsinya terhadap bobot total tanaman setelah tanaman dipanen. Tanaman dipanen saat berumur 14 minggu setelah tanam. Saat panen, tajuk tanaman dibagi tiga bagian berdasarkan tingkat ontogeni daun menjadi bagian atas, tengah dan bawah seperti yang dijelaskan oleh Nair et al. (2013).
Pengamatan Stomata A. annua hasil kultur in vitro yang ditanam di lapang.
Daun dari tanaman yang berumur sekitar 1-2 bulan diamati stomatanya. Pengambilan daun dilakukan secara acak dari bagian tengah batang tanaman dengan memilih daun segar yang sudah cukup tua. Setelah dipertik, daun dibungkus dengan tisu basah lalu dimasukkan ke dalam plastik dan disimpan dalam kotak pendingin. Daun yang belum diamati stomatanya disimpan di dalam refrigerator bersuhu 4-6oC
Pembuatan preparat stomata diawali dengan membersihkan permukaan daun dengan tisu hingga bersih. Helai daun berukuran sekitar 2 x 5 cm2 diolesi kutek (pewarna kuku) bening pada permukaan atas dan bawahnya secara merata, dibiarkan 3-5menit hingga kering. Selanjutnya, permukaan daun atas atau bawah yang telah diberi kutek ditempel dengan selotif, ditekan-tekan hingga menempel kuat. Selanjutnya selotip berikut lapisan epidermis daun dilepaskan kemudian ditempelkan pada kaca preparat. Selanjutnya dilakukan pengamatan stomata menggunakan mikroskop LEICA DFC310 FX, perbesaran 400x.
Penghitungan panjang, lebar dan jumlah stomata per bidang pandang difokuskan pada bidang pandang yang bening, bersih dan tidak rusak. Penghitungan dilakukan pada 10 bidang pandang berbeda. stomata diukur. Kerapatan stomata dicatat dengan menghitung jumlah stomata per mm2. Data dirata-ratakan untuk setiap individu tanaman yang diamati.
Analisis artemisinin.
Ekstraksi artemisinin dari Artemisia annua dilakukan dengan menggunakan pelarut metanol teknis yang telah didestilasi. Simplisia diekstrak dengan teknik maserasi selama 24 jam per sampel dengan menggunakan pelarut segar. Ekstrak metanol kemudian disaring melalui kertas saring dan dikeringkan dengan rotari evaporator dalam kondisi vakum dan ditimbang bobotnya. Ekstrak metanol kemudian dipartisi menggunakan teknik
partisi cair cai rdengan perbandingan 1:1 dengan pelarut n-heksan, etil acetat dan metanol. Masing masing ekstrak dikeringvakumkan dengan rotari evaporator untuk kemudian ditimbang dan dianalisa dengan menggunakan HPLC. Untuk menghilangkan pelarut pelarut polar dan air, masing masing ekstrak ditambahkan natrium sulfat anhidrat sebelum dikeringkan dengan evaporator.
Analisis artemisinin dilakukan dengan metode Thin layer Chromatography (TLC) dan High Pressure Liquid Chromatography (HPLC). Penentuan kadar artemisinin dilakukan dengan menggunakan kurva kalibrasi dari standard artemisinin. Kandungan artemisinin masing masing sampel dari ekstrak heksanaArtemisia annua dianalisis dengan menggunakan HPLC. Analisis kuantifikasi artemisinin dilakukan dengan menggunakan Shimadzu HPLC yang dilengkapi dengan UV detektor. Kolom yang digunakan adalah reverse kolom C-18 dengan ukuran partikel 2.1μm, dan I.D 4.6 mm, dan panjang kolom 150mm dan dilengkapi Guard Coloum. Eluen yang digunakan dalam analisa kandungan artemisinin adalah acetonitril 60% dan laju alir 1 ml/min. Deteksi artemisinin dilakukan dengan menggunakan UV detektor dan panjang gelombang 214nm. Penentuan kadar artemisinin dilakukan dengan menggunakan kurva kalibrasi standar artemisinin. Kadar artemisinin yang digunakan dalam pembuatan kurva kalibrasi adalah 125ppm, 250 ppm, 500 ppm dan 1000 ppm. Luas area peak artemisinin yang memiliki waktu retensi yang sama dengan standar artemisinin dimasukkan ke dalam plot luas area peak masing masing konsentrasi larutan standard artemisinin. Pembuatan kurva kalibrasi dilakukan secara segar sebelum sampel dianalis dan diperbaharui setiap penggantian eluen dan waktu analisa.
HASIL DAN PEMBAHASAN