SUB-KEGIATAN PRODUK KOMERSIAL
BAHAN DAN METODE Kultivasi isolat mikroba agen pupuk hayati di media cair.
Isolat bakteri starter POH diinokulasi pada erlenmeyer 2 L yang mengandung 1 L media Nutrient Broth (NB), yang terdiri dari 3 g beef extract dan 5 g pepton dalam 1 L aquades, kemudian diinkubasi selama 24 jam. Setelah inkubasi selama 24 jam, kultur bakteri yang tumbuh digunakan sebagai pre-kultur untuk produksi sel dalam skala besar dengan fermentor 20 selama 24-48 jam.
Produksi kultur bakteri agen pupuk hayati tunggal dalam skala besar menggunakan fermentor.
Produksi kultur bakteri skala besar menggunakan fermentor volume 20 L Pertumbuhan isolat bakteri pada fermentor 20 L menggunakan media NB yang terdiri dari 60 g beef extract dan 100 g pepton dalam 19 L aquades, kemudian disterilisasi. Setelah proses sterilisasi selesai, ditambahkan 1 L dan difermentasikan selama 24-48 jam. Kondisi fermentor telah diatur pada temperatur 30 C, pH 6,5-7,5 serta agitasi/pengadukan 100- 150 rpm. Untuk mengetahui pertumbuhan bakteri dalam fermentor dilakukan pengukuran optical density (OD) menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 436 nm. Setelah pertumbuhannya mencapai fase eksponesial akhir atau awal stasioner, kultur bakteri dalam fermentor dipanen menggunakan continous centrifuge. Isolat bakteri ditumbuhkan dalam fermentor sebagai isolat tunggal, terdiri dari Bacillus sp. 140-B, Brevundimonas sp. Piko dan Brevundimonas sp. AA2.
Pemanenan sel bakteri agen pupuk hayati hasil fermentasi menggunakan continuous centrifuge.
Isolat bakteri untuk starter POH yang ditumbuhkan di fermentor diinkubasi selama 24-48 jam sesuai dengan kurva pertumbuhan dari masing-masing bakteri. Setelah pertumbuhan mencapai fase eksponensial akhir atau awal stasioner, dilakukan pemanenan sel bakteri menggunakan continuous centrifuge. Bakteri Bacillus sp. 140-B dipanen setelah fermentasi selama 42 jam, bakteri Brevundimonas sp. AA2 setelah 36 jam dan Brevundimonas sp. Piko dipanen setelah fermentasi selama 30 jam.
Proses vacuum freeze drying pelet hasil sentrifus untuk mengurangi kadar air. Pelet yang diperoleh dari proses sentrifugasi, ditambahkan dengan agen cryoprotectant yang terdiri dari susu skim dan trehalose dengan perbandingan antara 3-10 susu skim berbanding 0,5-2,0 trehalose. Pemberian agen cryoprotectant pada pelet sel bakteri dilakukan dengan perbandingan 5:1. Agen cryoprotectant dilarutkan dalam phosphat buffer saline, kemudian disterilisasi. Pelet sel bakteri yang telah diberi agen cryoprotectant selanjutnya disimpan dalam deep freezer -80 C selama 24 jam. Selanjutnya dikering-bekukan dengan menggunakan vacuum freeze drying pada suhu -50 C, tekanan 0,5-1,0 atm selama 24-48 jam sampai diperoleh sel bakteri dalam bentuk kering beku. Hasil sel bakteri kering beku dihaluskan dan selanjutnya dicampur dengan bahan carrier.
Optimasi formulasi dan komposisi agen pembawa (carrier)
Hasil freeze drying yang berupa sel bakteri kering beku selanjutnya dilakukan pencampuran dengan agen pembawa (carrier). Bahan carrier yang digunakan dalam bentuk campuran dengan 3 formulasi yang berbeda, sebagai berikut:
1. F1= Susu skim : maltodextrin : maize starch (1:1:2)
3. F3= Susu skim : maltodextrin : maize starch (3:2:5)
Bahan untuk carrier disterilisasi terlebih dahulu sebelum dicampur dengan sel bakteri. Proses pencampuran sel bakteri dengan carrier dilakukan dengan beberapa konsentrasi bakteri yang berbeda. Pada F1 dan F2, bakteri dicampur dengan carrier sebagai isolat tunggal dengan konsentrasi 0,1 g dan 0,2 g dalam 10 g carrier. Sedangkan pada carrier F3, bakteri dicampur sebagai isolat campuran dengan konsentrasi 0,6 g dan 0,9 g dalam 50 g carrier. Hasil pencampuran sel bakteri dengan carrier selanjutnya disimpan pada suhu yang berbeda yaitu suhu 4 C di dalam refrigerator dan suhu 25 C di dalam ruangan.
Penghitungan populasi dan uji viabilitas sel bakteri
Penghitungan populasi dan uji viabilitas sel bakteri dilakukan dengan metode Total Plate Count (TPC). TPC dilakukan mulai dari pemanenan sel bakteri, pemberian agen cryoprotectant sebelum masuk ke deep freezer -80 C, sebelum proses freeze drying, setelah proses freeze drying dan pada saat penyimpanan sel kering beku setiap 1 bulan sekali. Penghitungan populasi bakteri juga dilakukan setelah diperoleh produk starter powder, yaitu setelah proses pencampuran sel bakteri dengan agen carrier selama penyimpanan 1 minggu dan dilanjutkan setiap 1 bulan sekali.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Produksi starter pupuk organik hayati (POH) dalam bentuk powder diawali dengan fermentasi isolat bakteri starter POH dalam fermentor 20 L untuk isolat bakteri Bacillus sp. 140-B, Brevundimonas sp. AA2 dan Brevundimonas sp. Piko secara terpisah sebagai isolat tunggal. Isolat bakteri Bacillus 140-B memiliki aktivitas enzim protease tertinggi untuk menghasilkan asam-asam organik pada produk POH serta perombakan protein dari bahan- bahan pembuatan POH. Isolat Brevundimonas sp. AA2 yang memiliki aktivitas penghasil zat pengatur tumbuh, terutama hormon Indole Acetic Acid (IAA) tertinggi. Sedangkan isolat Brevundimonas sp. Piko memiliki kemampuan dalam melarutkan senyawa fosfat menjadi unsur P yang dapat diserap tanaman dan berperan dalam memacu pertumbuhan tanaman.
Pemanenan sel dilakukan pada saat fase akhir eksponensial atau awal stasioner menggunakan continous centrifuge sehingga diperoleh pelet sel bakteri dalam bentuk pasta. Waktu pemanenan sel berbeda dari masing-masing bakteri berdasarkan hasil pengukuran kurva pertumbuhannya. Pelet sel bakteri yang diperoleh dari hasil sentrifus selanjutnya ditempatkan dalam cawan petri steril. Pelet hasil sentrifus dari tiap-tiap bakteri memiliki bobot yang berbeda, seperti ditunjukkan pada Tabel 1. Perbedaan bobot pelet sel bakteri ini dapat disebabkan oleh koloni dan pertumbuhan yang berbeda dari masing- masing isolat bakteri yang difermentasi.
Pelet hasil sentrifus selanjutnya diberi tambahan agen cryoprotectant sebelum proses freeze drying. Agen cryoprotectant berfungsi untuk melindungi sel bakteri dari kondisi temperatur yang ekstrim di deep freezer dan mesin freeze drying. Agen cryoprotectant yang digunakan terdiri dari susu skim dan trehalose. Hasil freeze drying dari pelet sel bakteri ditunjukkan pada Tabel 1.
Hasil dari proses freeze-drying berupa sel kering beku akibat proses pendinginan dan vakum untuk menghilangkan kadar air dalam pelet sel bakteri. Proses freeze-drying ini merupakan suatu proses kritis yang rentan mengakibatkan kerusakan sel bakteri. Pada tahap pertama adalah proses pendinginan dengan suhu yang sangat rendah (-50 C), dan dilanjutkan dengan proses yang kedua, yaitu sublimasi dalam kondisi vakum untuk menghasilkan sel kering beku. Oleh karena itu, pemberian agen cryoprotectant sebelum proses freeze-drying sangat diperlukan untuk menjaga viabilitas sel bakteri dan mengoptimalkan hasil freeze-drying.
Tabel 1. Pemanenan sel bakteri dari fermentor dan hasil freeze drying
Sel bakteri kering beku hasil freeze drying selanjutnya dihaluskan dengan cara digerus dalam mortar steril disimpan pada suhu 4 C. Untuk mengetahui viabilitas dari sel bakteri tersebut, dilakukan penghitungan populasi dengan metode Total Plate Count (TPC). Penghitungan populasi juga dilakukan pada saat panen sel bakteri, pencampuran dengan agen cryoprotectant sebelum disimpan pada -80 C, sebelum proses freeze drying, serta setelah masa penyimpanan setiap 1 bulan sekali. Hasil penghitungan populasi sel bakteri dengan metode TPC ditunjukkan pada Tabel 2.
Tabel 2. Hasil penghitungan populasi sel bakteri dengan metode TPC Isolat Bakteri Sel
(CFU/mg) Sebelum FD (CFU/mg) Setelah FD (CFU/mg) Penyimpanan Masa (CFU/mg) Bacillus sp. 140-B 50x 1012 74x 1010 236 x 1011 92 x1011 Brevundimonas sp. AA2 34 x 10 11 69 x 1013 86 x 1011 268 x 1011 Brevundimonas sp. Piko ~ ~ 143 x 10 11 83 x 1012
Berdasarkan hasil perhitungan populasi bakteri seperti data pada Tabel 2, agen cryoprotectant yang terdiri dari susu skim dan trehalose memberikan perlindungan yang baik pada sel bakteri selama proses penyimpanan di -80 C, proses freeze drying dan penyimpanan, ditunjukkan dengan populasi bakteri yang relatif stabil. Hal ini menunjukkan kesamaan dengan hasil penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Zayed et al. (2004), yang melaporkan bahwa kombinasi antara susu skim dan trehalose sebagai agen cryoprotectant mampu meningkatkan viabilitas bakteri Lactobacillus salivarius selama proses freeze drying dan pada masa penyimpanan. Proses freeze drying dapat merusak struktur membran sel dan berdampak pada perubahan viabilitas sel, tetapi adanya susu skim dan trehalose sebagai agen cryoprotectant dapat meningkatkan keutuhan dan perubahan cairan dalam membrane sel (Li et al., 2011).
Pencampuran sel kering beku hasil freeze drying dengan agen carrier. Agen carrier yang digunakan terdiri dari 3 formula dan merupakan campuran antara susu skim, maize starch dan maltodextrin, serta campuran antara susu skim, maize starch, maltodextrin dan kaolin dengan perbandingan yang berbeda. Pencampuran ini dihomogenisasi pada orbital shaker dan divortex. Hasil pencampuran sel bakteri kering beku dengan carrier merupakan prototipe dari produk starter powder POH. Produk ini kemudian disimpan pada suhu ruang (25 C) dan di refrigerator suhu 4 C. Setelah 1 minggu dari masa penyimpanan dilakukan uji viabilitas dengan penghitungan populasi sel bakteri menggunakan metode TPC. Uji viabilitas ini selanjutnya dilakukan setiap 1 bulan sekali. Hasil uji viabilitas sel bakteri dalam carrier ditunjukkan pada Tabel 3.
Isolat bakteri Volume panen
sel (Liter) Bobot pelet sel bakteri (Gram) Bobot sel kering beku (Gram)
Bacillus sp. 140-B 20 24.478 4.86
Brevundimonas sp.
AA2 20 69.972 20.82
Brevundimonas sp.
Tabel 3. Hasil penghitungan populasi bakteri uji viabilitas dalam carrier F1 dan F2.
Berdasarkan hasil uji viabilitas pada carrier F1 dan F2, diketahui bahwa bakteri Brevundimonas sp. AA2 memiliki viabilitas yang paling baik dibandingkan dengan bakteri Bacillus sp. 140-B dan Brevundimonas sp. PIKO. Hasil tersebut kemudian dijadikan sebagai acuan untuk membuat formulasi agen carrier yaitu F3, dan dalam proses pencampurannya dengan sel bakteri menggunakan ketiga jenis bakteri, bukan isolat bakteri tunggal. Hasil penghitungan populasi bakteri pada formulasi ini ditunjukkan pada Tabel 4. Tabel 4. Hasil penghitungan populasi bakteri uji viabilitas dalam carrier F3.
Hasil penghitungan populasi bakteri pada formulasi F3 menunjukkan hasil yang lebih baik, di mana dengan 2 konsentrasi yang berbeda dan di tempat penyimpanan suhu ruang maupun di refrigerator diperoleh populasi bakteri yang cukup tinggi. Hal ini menunjukkan bahwa keberadaan bakteri sebagai konsorsium dalam suatu carrier dapat mempertahankan viabilitasnya lebih baik dibandingkan dengan keberadaannya sebagai isolat tunggal.
KESIMPULAN
Dalam kegiatan penelitian ini, kami mengembangkan teknologi untuk menghasilkan starter pupuk organik hayati (POH) dalam bentuk powder, di mana proses pembuatannya terdiri dari fermentasi isolat bakteri dalam fermentor skala besar (20L) dengan kondisi temperatur, pH dan pengadukan yang terkontrol, pemanenan sel dengan continuous centrifuge, proses freeze drying, pencampuran dengan bahan carrier and pengemasan produk. Agen cryoprotectant yang ditambahkan dalam proses freeze drying terdiri dari kombinasi susu skim dan trehalose memberikan perlindungan yang baik terhadap sel bakteri dan meningkatkan viabilitasnya selama proses freeze drying. Pengukuran viabilitas sel bakteri menggunakan metode total plate count (TPC) dilakukan pada beberapa tahap meliputi pemanenan sel, setelah pembekuan -80 C, sebelum dan setelah proses freeze drying, penyimpanan sel kering beku hasil freeze drying, serta masa penyimpanan setelah pencampuran dengan carrier. Kombinasi susu skim dan trehalose sebagai agen cryoprotectant memberikan perlindungan yang baik pada sel bakteri, ditunjukkan dengan stabilitas populasi bakteri selama proses pembekuan di -80 C, freeze drying dan penyimpanan. Penggunaan kombinasi susu skim, maltodextrin, dan maize starch sebagai bahan carrier dengan perbandingan 3:2:5 serta proses pencampuran isolat bakteri sebagai
Isolat bakteri Konsentrasi
(G/10G) Populasi bakteri (CFU/mg) F1 Populasi bakteri (CFU/mg) F2 140-B 0.1 Not detected (106) Not detected (106)
0.2 Not detected (106) Not detected (106)
AA2 0.1 97x 108 85 x 107
0.2 172 x 108 220x 107
PIKO 0.1 Not detected (106) Not detected (106)
0.2 Not detected (106) Not detected (106)
Isolat bakteri Konsentrasi
(G/50G) Penyimpanan 4 C Penyimpanan 25 C
Mix culture 0.6 32 x 107 186 x 107
konsorsium memberikan hasil yang lebih baik dibandingkan dengan isolat bakteri tunggal dalam carrier.
UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terima kasih kami tujukan kepada LIPI atas didanainya penelitian ini melalui Program Unggulan IPH Produk Komersial 2015. Kami juga berterima kasih atas bantuan dan kerjasama dari saudara Entis Sutisna dan Nani Mulyani yang telah bekerja keras demi kelancaran kegiatan penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA
Adesemoye, A.O.,H.A. Torbert & J.W. Kloepper. 2008. Enhanced plant nutrient use efficiency with PGPR and AMF in an integrated nutrient management system. Canadian Journal of Microbiology, 54(10): 876-886.
Ahmad, F., I. Ahmad & M.S. Khan. 2006. Screening of free-living rhizospheric bacteria for their multiple plant growth promoting activities. Microbiology Research, 36: 1-9. Antonius,S., Laili, N., Yanti, Nurkanto, A., & Agustyani, D. 2009. Exploration and screening
of microbial biofertilizer agents from Malinau-East Borneo. Proceeding Environmental life science, XX the National seminar and XIV Conference of Indonesian Biological association-UIN Maliki Malang 24-25 July 2009.
Antonius, S., Nur Laili and Dwi Agustyani. 2011. Great Potential of Microbial Isolates from Forest Ecosystem in Malianu -East Kalimantan as Bio-fertilizer and Bio-control Agents In P Phartama, A F Mas’ud, N Mindawati, G Pari, H Krisnawati, Krisdianto, A Subiakto, R Maryani, T Setyawati, B Leksono, M Turjaman, Y Yovy, L Sundawati, R Nurruchmat (Eds). Proceeding Inafor 2011, International conference of Indonesia Forest researchers 5-7 December 2011 “Strengthening Forest Science and technology for Better Forestry Development”, Ministry of Forestry, Forestry Research and Development Agency. Page- 169-175, ISBN- 978-979-8452-45-1.
Antonius, S., Nur Laili, Hartati Imamuddin and Dwi Agustiyani. 2012. Development of Sustainable Agriculture- The Role of Beyonic-StarTmik LIPI Biofertilizer on Yield Improvement of Various Crops and Conservation of Soil Biochemical Properties of various Ecosystem in Indonesia. In Abdulhadi, R., Tjahjono, B.S.E., Waluyo, E.B., Delinom, R.M., Prijono, S.N., Fizzanty, T., Lesmana, T. (eds). Proceedings “Mobilizing Science Toward Green Economy”, The 12 th Sciences Council os Asia (SCA) Conference and International Symposisum 10-12 July, 2012-Bogor, Indonsia.p.119-126.
Ashrafuzzaman, M., F.A. Hossen, M.R. Ismail, M.A. Hoque, M.Z. Islam, S.M. Shahidullah & S. Meon. 2009. Efficiency of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) for the enhancement of rice growth. African Journal of Biotechnology, 8(7): 1247--1252. Cattelan, A.J., P.G. Hartel & J.J. Fuhrmann. 1999. Screening for plant growth-promoting
rhizobacteria to promote early soybean growth. Soil Science Society for America, 63: 1670--1680.
Dave, R., R. Patel, J. Patel & H. Chauhan. 2010. Effect of cryoprotectant on lyophilisation of doxorubin-HCl loaded chitosan nanoparticles. International Journal of Pharmacy and Life Science, 3(6): 1769-1772.
El Fattah, D.A.A., W.E. Eweda, M.S. Zayed & M.K. Hassanein. 2013. Effect of carrier materials. Sterilization method, and storage temperature on survival and biological activities of Azotobacter chroococcum inoculant. Annals of Agricultural Science, 58(2): 111-118.
Egamberdiyeva, D. 2007. The effect of plant growth-promoting bacteria on growth and nutrient uptake of maize in two different soils. Applied Soil Ecology, 36: 184--189. Glick, B.R., D.M. Penrose & W. Ma. 2001. Bacterial promotion of plant growth.
Jalali, M., D. Abedi, J. Varshosaz, M. Najjarzadeh, M. Mirlohi & N. Tavakoli. 2012. Stability evaluation of freeze-dried Lactobacillus paracasei subsp. Tolerance and Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus in oral capsules. Research in Pharmaceutical Sciences, 7(1): 31-36.
Joshi, P. & A.B. Bath. 2011. Diversity and function of plant growth-promoting rhizobacteria associated with wheat rhizosphere in North Himalaya Region. International Journal of Environmental Sciences, 1(6): 1135--1143.
Khalid, A., M. Arshad & Z.A. Zahir. 2004. Screening plant growth-promoting rhizobacteria for improving growth and yield of wheat. Journal of Applied Microbilogy, 96: 473--480. Krishnaveni, M.S. (2010). Studies on phosphate solubilizing bacteria (PSB) in rhizosphere and non-rhizosphere soils in different varieties of foxtail millet (Setariatalica). International Journal Agricultural and Food Science Technology, 1(1): 23-39.
Kumar, V. 2014. Characterization, bioformulation development and shelf-life studies of locally isolated biofertilizer strains. Octa Journal of Environmental Research, 2(1): 32- 37.
Li, B., F. Tian, X. Liu, J. Zhao, H. Zhang & W. Chen. 2011. Effect of cryoprotectant on viability of Lcatobacillus reuteri CICC6226. Applied Microbiology & Biotechnology, 92: 609-616.
Malusa, E., L. Sus-Paszt & E. Zurawicz. 2007. The effect of a mycorrhiza-bacteria substrate and foliar fertilization on growth response and rhizosphere pH of three strawberry cultivars. International Journal of Fruit Science, 6(4): 25-41.
Malusa, E., L. Sus-Paszt & J. Ciesielska. 2012. Technologies for beneficial microorganisms inocula as biofertilizers. The Scientific World Journal, 1-12.
Mrkovacki, N. & V. Milic. 2001. Use of Azotobacter chroococcum as potentially useful in agriculture application. Annual Microbiology, 51: 145--158.
Salantur, A., A. Ozturk & S. Akten. 2006. Growth and yield response of spring wheat (Triticum aestivum L.) to inoculation with rhizobacteria. Plant Soil Environment, 52(3): 111--118.
Savini, M., C. Cecchini, M.C. Verdenelli, S. Silvi, C. Orpianesi & A. Cresci. 2010. Pilot-scale production and viability analysis of freeze-dried probiotic bacteria using different protective agents. Nutrients, 2; 330-339.
Shaharoona, B., M. Arshad, Z.A. Zahir & A. Khalid. 2006. Performance of Pseudomanas spp. containing ACC-diaminase for improving growth and yield of maize (Zea mays L.) in the presence of nitrogenous fertilizer. Soil Biology and Biochemistry, 38: 2971- -2975.
Siddiqui, Z.A. 2006. PGPR: Prospective biocontrol agents of plant pathogens. In: Siddiqui, Z.A (ed.). 2006.Biocontrol and Biofertilization. Springer, Amsterdam, 111-142. Verma, S.C., J.K. Ladha & A.K. Tripathi. 2001. Evaluation of plant growth promoting and
colonization ability of endophytic diazotrophs from deep water rice. Journal of Biotechnology, 91: 127--141.
Zayed, G. & Y.H. Roos. 2004. Influence of trehalose and moisture content on survival of Lactobacillus salivarius subjected to freeze-drying and storage. Process Biochemistry, 39: 1081-1086.
LT 23.
EVALUASI PERTUMBUHAN AWAL VEGETATIF JATI TETRAPLOID DAN