Kisaran Inang dan Penularan PMWa
BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, mulai bulan Agustus 2005 sampai April 2006.
Metode Penelitian Bahan Penelitian
Bahan penelitian yang digunakan adalah sampel daun nanas cv. Smooth Cayenne yang berasal dari pertanaman nanas di Kabupaten Subang Jawa Barat. Sampel daun nanas di ambil dari lahan perkebunan nanas secara acak terhadap tanaman nanas yang menunjukkan gejala layu nanas, serta sampel tanaman nanas sehat. Beberapa tumbuhan selain nanas yang tumbuh di sekitar areal penanaman nanas juga diambil untuk dianalisis.
Tissue Blot Immunoassay (TBIA)
Deteksi PMWaV secara serologi pada tanaman nanas dilakukan dengan menggunakan metode TBIA seperti yang dilaporkan oleh Hu et al. (1997). Daun dari tanaman nanas yang menunjukkan gejala maupun yang tidak bergejala layu, digunakan sebagai sampel yang akan dideteksi. Sampel daun dipotong melintang pada bagian dasar daun yang masih putih untuk membuat tepi potongan yang rata. Potongan ini kemudian ditempelkan pada 0,45 µm Nitro ME nitrocelulose membrane (Amersham Pharmacia Biotech, USA) selama 3-5 detik. Pola jaringan pembuluh daun akan menempel dan tertinggal pada membran. Membran kemudian disimpan kering diantara lipatan kertas saring pada suhu ruang sampai siap dianalisis.
Membran yang telah diblot ditempatkan dalam wadah plastik dan diblocking dengan 2% (wt/vol) susu skim yang dilarutkan dalam larutan penyangga tris buffer saline (TBS) (50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7,5) selama 30 menit pada suhu ruang. Membran kemudian diinkubasikan dalam
wadah plastik yang baru atau kantung plastik segel dengan antibodi monoklonal PMWaV (Agdia Inc., USA) dengan pengenceran 1:10 dalam TBS pada suhu ruang selama 1-2 jam, atau pada suhu 4°C selama 1 malam. Membran kemudian dicuci dengan TBST (TBS + 0,5% Tween 20) selama 10 menit sebanyak 3 kali pada suhu ruang. Setelah pencucian, membran kemudian diinkubasikan dengan konjugat alkaline phosphatase (Sigma Chemical Co. St. Louise, USA) pada pengenceran 1:1000 dalam TBS selama 2-3 jam pada suhu ruang. Membran kemudian dicuci sebagaimana di atas, dan diwarnai dengan substrat 5-bromo-4- chloro-3-Indolyl Phosphate/Nitro Blue Tetrazolium (BCIP/NBT) (Sigma Chemical Co., USA) menggunakan satu tablet BCIP/NBT yang dilarutkan dalam 10 ml larutan penyangga Alkaline Phosphate (AP). Pewarnaan dilakukan pada suhu ruang hingga terjadi perubahan warna pada membran. Reaksi pewarnaan dihentikan dengan mencuci membran dengan air mengalir dan dikeringanginkan.
Reverse Trancriptase - Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
Total RNA diekstrak dari 100 mg jaringan daun tanaman nanas menggunakan Rneasy Plant Mini Kits (Qiagen Inc., Chatsworth, CA., USA). Sampel RNA yang telah dimurnikan diresuspensikan dengan 40 µl air bebas RNase, kemudian disimpan pada suhu -80°C sampai akan digunakan. Amplifikasi sebagian genom PMWaV-1 dan PMWaV-2 dilakukan menggunakan sepasang primer 223 dan 224 untuk PMWaV-2 dan 225 dan 226 untuk PMWaV-1 (Tabel 2).
Tabel 2 Sekuen primer, ukuran produk, dan posisi nukleotida pada gen PMWaV- 1 dan PMWaV-2 (Sether et al. 2001)
PMWaV Primer Sekuen Ukuran
produk Nukleotidax 1 225y 5’-ACAGGAAGGACAACACTCAC-3’ 589 118 1 226z 5’-CGCACAAACTTCAAGCAATC-3’ ... 707 2 224y 5’-CATACGAACTAGACTCATACG-3’ 609 226 2 223z 5’-TCATTGCACTCACTTATCGTTG-3’ ... 835 x
Lokasi primer (posisi nukleotida dari awal) gen homolog HSP70 PMWaV y
Forward primer z
Reaksi RT dilakukan pada volume 20 µl terdiri dari 3 µl RNA hasil ekstraksi, 0,75 pmol primer, 500 mM dNTPs, 5 mM MgCl2, 4 µl bufer RT (250
mM Tris-HCl, pH 8,3, 375 mM KC, 15 mM MgCl2, 50 mM DTT), 20 unit
RNAsin Ribonuclease inhibitor (Promega, Madison, WI, USA), dan 65 unit MMLV reverse transcriptase (Promega, Madison, WI, USA). Reaksi RT dilakukan pada kondisi 25 °C selama 5 menit, 42 °C selama 60 menit, diikuti dengan inaktivasi pada 72 °C selama 15 menit.
Reaksi PCR dilakukan pada volume 50 µl terdiri dari 0,75 pmol forward primer (224 untuk PMWaV-2 dan 226 untuk PMWaV-1) dan reverse primer (223 untuk PMWaV-2 dan 225 untuk PMWaV-1) (Tabel 2), 3 µl bufer reaksi (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl [pH 9,0 pada 25°C], 1,0% [vol/vol] triton X-100), dan 0,5 µl taq DNA polimerase (Promega, Madison, USA). Kondisi PCR awalnya adalah denaturasi pada suhu 94°C selama 4 menit, kemudian dilanjutkan dengan 45 siklus pada 94 °C selama 1 menit, 50 °C selama 1 menit, dan 72 °C selama 1 menit, dan diikuti dengan perpanjangan pada 72 °C selama 10 menit pada mesin PCR (Perkin Elmer 9700 thermocycler).
Separasi DNA produk RT-PCR dilakukan pada gel agarose 1% dalam larutan penyangga TBE (54 gr Tris base, 27,5 gr Asam Borat, 20 ml EDTA 0,5 M, pH 8,0 dalam 1000 ml air) pada kondisi 70 V selama 2 jam. Amplicon divisualisasi dengan 2 µg/ml ethidium bromida dalam larutan penyangga TBE untuk elektroforesis. Setelah pewarnaan, gel kemudian difoto di atas cahaya ultra violet (310 nm) menggunakan kamera polaroid Direct Screen DS34 dan film polaroid FP-3000B SS.
Purifikasi Virus
Seratus gram jaringan tanaman sakit dibekukan dengan nitrogen cair, ditumbuk hingga halus dengan mortar, dan dicairkan dengan bufer ekstraksi EB (500 mM Tris-Cl, pH 8,4, 4% Triton-X 100, 0,2% 2-mercaptoethanol) sebanyak 2 ml/g jaringan. Hasil gerusan dihomogenisasi menggunakan pengaduk selama satu jam pada suhu 4°C dan disaring menggunakan kain kasa, dan hasil saringan disentrifugasi pada 7.500 rpm selama 30 menit pada rotor P70AT (Hitachi).
Supernatan yang didapatkan kemudian disentrifugasi pada 44.500 rpm selama 60 menit pada rotor P70AT, dan peletnya dilarutkan dalam bufer TM (100 mM Tris- Cl, pH 8,5, dan 10 mM MgCl2) menggunakan 1/8 volume bufer ekstraksi.
Suspensi ini diklarifikasi dengan sentrifugasi pada 7.500 rpm selama 15 menit pada rotor P70AT, dan supernatan yang didapatkan dilapiskan diatas 5 ml 0,48 molal Cs2SO4 dalam bufer TM dan disentrifugasi pada 46.000 rpm selama 16 jam
dalam rotor P80AT pada suhu 8°C. Pelet yang dihasilkan dilarutkan dalam 200 µl bufer TM (Gunasinghe & German 1989).
Sodium Dodecyl Sulphate – Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) dan Western Blotting
Berat molekul protein selubung PMWaV dianalisis dengan menggunakan metode SDS-PAGE. Analisis dilakukan terhadap fraksi-fraksi hasil pemurnian virus, tanaman terinfeksi virus gemini, dan tanaman terinfeksi TMV sebagai pembanding. Fraksi hasil pemurnian virus dihomogenisasi dengan 200 µl larutan penyangga (62 mM Tris-HCl, pH 6,7, 2% SDS, 5% 2-mercaphtoethanol, 10% glycerol, dan 0.004% bromophenolblue), kemudian dipanaskan sampai mendidih (100 °C) selama 10 menit, dan disentrifugasi 13.000 rpm (rotor Tomy MRX-151) selama 10 menit. Supernatan dapat langsung digunakan atau disimpan pada suhu - 20 °C.
Analisis SDS-PAGE membutuhkan dua jenis gel yang berbeda yaitu separating gel (gel pemisah) dan stacking gel.Gel pemisah dibuat dengan cara mencampur acrylamide 10% (1,8 ml) dengan bis-acrylamide 0,25% (1,5 ml), Tris-HCl 0,375 M pH 8,8 (2,5 ml), SDS 0,1% (0,005 ml), TEMED 0,025% (0,006 ml), APS (amonium persulphate) 0,025% (0,17 ml), dan 4 ml air. Setelah bahan- bahan tercampur rata kemudian dimasukkan ke dalam pelat gelas ukuran 10 x 7,2 cm yang telah dipasang pada gel stand. Permukaan atas gel diratakan dengan menambah air di atas lapisan gel sekaligus untuk mempercepat pembekuan gel. Air dapat dibuang setelah terlihat batas tegas antara air dan gel yang membeku. Stacking gel dibuat dengan cara mencampur acrylamide 3% (0,06 ml) dengan bis- acrylamide 0,08% (0,04 ml), Tris-HCl 0,125 M (2,5 ml), pH 6,8, SDS 0,1% (0,1
ml), TEMED 0,025% (0,006 ml), APS 0,025% (0,1 ml), dan 6,3 ml air. Campuran tersebut selanjutnya dituang di atas gel pemisah, kemudian dipasang sisir (comb), dan setelah gel membeku comb dapat dicabut dan gel siap digunakan.
Sampel selubung protein virus yang berasal dari pemurnian virus, didenaturasikan dengan cara memanaskan protein selubung virus pada suhu 100 °C selama 10 menit di dalam water bath. Setelah itu, sebanyak 15 µl masing- masing sampel protein dimasukkan ke dalam lubang gel poliakrilamid 10% yang dibuat sebagaimana disebutkan di atas, dalam penyangga 10 ml Tris-HCl pH 8,3 yang mengandung 3.2 ml glisin 0,2 M dan 2 ml SDS 10%. Elektroforesis dilakukan pada suhu ruang (24 °C) pada 80 volt selama 120-180 menit. Selubung protein PMWaV dibandingkan dengan berat molekul penanda seperti phosphorilase b (97 kDa), albumin (66 kDa), ovalbumin (45 kDa), carbonic anhydrase (30 kDa), trypsin inhibitor (20,1 kDa), α-lactabumin (14,4 kDa), yang terdapat dalam satu ladder (Amersham Bioscience, UK).
Setelah dielektroforesis, protein divisualisasi dengan pewarnaan Coomassie Blue (Bio-Rad Laboratories, USA). Gel direndam dalam asam asetat glasial 12,5% selama 5 menit kemudian direndam dalam larutan Coomassie blue 0,25% dan diinkubasi selama 12 jam di atas shaker. Gel dicuci menggunakan larutan penghilang warna yang terdiri atas metanol 50% dan larutan asam asetat 10% sebanyak 3 x 10 menit.
Analisis protein dengan Western Blotting dilakukan untuk mengkonfirmasi keberadaan protein selubung PMWaV dengan menggunakan metode He et al. (1997). Protein murni virus dielektroforesis pada 10% gel SDS-PAGE, kemudian ditransfer ke 0,45 µm Nitro ME nitrocelulose membrane (Amersham Pharmacia Biotech, USA). Membran kemudian diinkubasi dalam antibodi monoklonal PMWaV (Agdia Inc., USA) dengan pengenceran 1:10 dalam TBS pada suhu ruang selama 1-2 jam, atau pada suhu 4°C selama 1 malam. Membran kemudian dicuci dengan TBST (TBS + 0,5% Tween 20) selama 10 menit sebanyak 3 kali pada suhu ruang. Setelah pencucian, membran kemudian diinkubasi dalam konjugat alkaline phosphatase (Sigma Chemical Co., USA) pada pengenceran
1:1000 dalam TBS selama 2-3 jam pada suhu ruang. Membran kemudian dicuci sebagaimana di atas, dan diwarnai dengan substrat tablet BCIP/NBT yang dilarutkan dalam 10 ml larutan penyangga AP per 1 tablet (Sigma Chemical Co., USA) pada suhu ruang hingga terjadi perubahan warna. Reaksi pewarnaan dihentikan dengan mencuci membran dengan air mengalir dan dikeringanginkan.
Analisis Partikel Virus
Partikel virus diamati dibawah mikroskop elektron. Virus hasil pemurnian dengan gradien cesium sulfat masing-masing fraksi dipisahkan untuk diamati dengan mikroskop elektron transmisi model JEOL 1010 yang dioperasikan pada 80 kV. Preparat disiapkan dengan mencampur satu tetes sampel dengan satu tetes amonium persulphate (PTA), kemudian grid berukuran 400 mesh yang telah dilapisi colodion dan dikarbonisasi ditempelkan pada preparat tersebut selama 1-2 menit. Diharapkan partikel virus yang ada pada preparat sampel akan menempel pada grid. Pengamatan partikel virus dilakukan dengan pembesaran 15.000 – 30.000 kali.
Perunutan Nukleotida
Perunutan sebagian genom PMWaV dilakukan dengan merunut nukleotida gen HSP 70 PMWaV dari hasil PCR dengan menggunakan sepasang primer 223 dan 224 untuk PMWaV-2 serta 225 dan 226 untuk PMWaV-1 (Tabel 2). Perunutan nukleotida dilakukan di Laboratorium Research and Development Centre PT. Charoen Pokhpand, Jakarta Indonesia dengan menggunakan mesin sequencer ABI-Prism 3100-Avant Genetic Analyzer (ABI PRISM 3100 version 3.7). Hasil runutan kemudian dianalisis menggunakan software Wu-Blastn (www.ebi.ac.uk) yang terdapat dalam situs The European Bioinformatic Institute
(EBI). Sekuen DNA untuk Closterovirus lainnya didapatkan dari bank gen (www.NCBI.nml.nih.gov) dan hubungan filogenetik didapatkan melalui program