DAFTAR TABEL ... ix DAFTAR GAMBAR ... x PENDAHULUAN ... 1 Latar Belakang ... 1 Tujuan penelitian ... 3 Hipotesis ... 3 Manfaat Penelitian ... 3 TINJAUAN PUSTAKA ... 4 Gejala Penyakit Layu Nanas ... 4 Kisaran Inang dan Penularan PMWaV ... 5 Distribusi Geografi PMWaV ... 6 Ciri-ciri PMWaV ... 7 Metode Deteksi PMWaV ... 9 BAHAN DAN METODE ... 10 Tempat dan Waktu Penelitian ... 10 Metode Penelitian ... 10 Bahan Penelitian ... 10 Tissue Blot Immunoassay (TBIA) ... 10 Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) 11 Purifikasi Virus ... 12 SDS-PAGE dan Western Blotting ... 13 Mikroskopi Elektron ... 15 Perunutan Nukleotida ... 15 HASIL DAN PEMBAHASAN ... 16 Deteksi PMWaV dengan TBIA ... 16 Pemurnian PMWaV dan Visualisasi Visualisasi Morfologi
Partikel PMWaV dengan Mikroskop ... 18 Analisis Protein Selubung PMWaV dengan SDS-PAGE dan
Western Blotting ... 21 Deteksi Asam Nukleat PMWaV dengan RT-PCR ... 24 Analisis Runutan dan Hubungan Kekerabatan PMWaV Indonesia
dengan Anggota Famili Closterovirus Lainnya ... 25 KESIMPULAN DAN SARAN ... 31 Kesimpulan ... 31 Saran ... 31 DAFTAR PUSTAKA ... 32 LAMPIRAN ... 34
Halaman
1 Distribusi geografik PMWaV di dunia ... 7 2 Sekuen primer, ukuran produk, dan posisi nukleotida pada gen
PMWaV-1 dan PMWaV-2 ... 11 3 Deteksi PMWaVpada Jaringan daun nanas dan beberapa gulma serta
tanaman pisang yang tumbuh di sekitar pertanaman nanas di Kabupaten Subang ... 16 4 Visualisasi partikel PMWaV dengan mikroskop elektron hasil dari
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Gejala PMWaV pada tanaman nanas. A. Gejala layu nanas diambil dari CABI (2005). B. Gejala layu nanas di Kabupaten Subang, Jawa Barat; atas: tanaman nanas sehat, bawah: tanaman nanas sakit ... 5 2 Partikel PMWaV pada mikroskop elektron ... 8 3 Tissue blot dari potongan daun nanas. Kiri: daun nanas sehat (1,2), *)
reaksi tidak spesifik, daun nanas terinfeksi PMWaV-1 (3). Kanan: daun nanas sehat (1,2,5), daun nanas terinfeksi PMWaV-2 (3,4) ... 18 4 Hasil separasi protein virus dengan SDS-PAGE. Lajur M, low mixture
molecular-weight marker; 1, fraksi 1 pemurnian PMWaV; 2, fraksi 2 pemurnian PMWaV; 3, fraksi 3 pemurnian PMWaV; K, kontrol larutan penyangga ... 22 5 Analisis Western Blot terhadap protein selubung PMWaV.
Elektroforesis protein yang telah didenaturasi dilakukan pada 10% SDS-PAGE. (A). Pita protein yang terdeteksi dengan antibodi PMWaV-1. (B). Pita protein yang terdeteksi dengan antibodi PMWaV-2. Lajur 1-5 pada gambar A dan B berturut-turut mewakili
fraksi 1 sampai 5 dari hasil pemurnian virus ... 23 6 Deteksi dan diferensiasi PMWaV-1 dan PMWaV-2 menggunakan RT-
PCR. Lajur 1, 100 bp DNA ladder; lajur 2, tanaman terinfeksi PMWaV-1; lajur 3, tanaman terinfeksi PMWaV-2, lajur 4, 1 kb plus DNA ladder; lajur 5 dan 6, tanaman sehat ... 24 7 Alignment antara genom HSP 70 PMWaV Indonesia dengan genom
PMWaV yang terdapat pada Gen Bank (www.ncbi.nlm.nih.gov). (A)
PMWaV-1, (B) PMWaV-2. ( | ) basa antara kedua sekuen sama, ( )
basa antara kedua sekuen tidak sama, ( - ) delesi/tidak ada basa ... 27 8 Dendogram pohon filogenetik antara isolat PMWaV Indonesia dengan
beberapa anggota Closterovirus. Analisis dilakukan menggunakan software Clustal W ... 29
Latar Belakang
Indonesia merupakan salah satu negara penghasil nanas di Asia Tenggara. Produksi nanas Indonesia pada tahun 2002 tercatat mencapai 300.000 ton yang menempati posisi tertinggi ketiga setelah Thailand dan Filipina (CABI 2005). Beberapa tahun terakhir, industri nanas di Indonesia dihadapkan pada suatu permasalahan penting yaitu munculnya penyakit layu pada tanaman nanas yang belum pernah dilaporankan sebelumnya. Berdasarkan laporan petani nanas, penyakit layu nanas muncul di beberapa daerah sentra produksi nanas di Indonesia seperti Jawa Barat, Jawa Timur, Lampung, dan Sumatera Utara.
Tanaman nanas yang terserang penyakit ini menunjukkan gejala berupa warna daun tanaman yang terserang menjadi berwarna kuning sampai kemerahan, daun menggulung ke bawah, pada ujung daun nekrotik, dan tanaman menjadi layu. Pada keadaan yang sudah parah, tanaman nanas menjadi kerdil dan dapat roboh akibat terhambatnya perkembangan perakaran tanaman. Penyakit ini juga dapat menyebabkan kegagalan dalam menghasilkan buah, atau mampu menghasilkan buah tetapi berukuran lebih kecil dari yang sehat.
Penyakit layu nanas merupakan salah satu penyakit penting pada industri nanas di dunia. Gejala penyakit layu pada tanaman nanas di Indonesia mirip dengan gejala penyakit layu tanaman nanas yang telah banyak dilaporkan di negara-negara produsen nanas. Tanaman yang terserang penyakit ini menunjukkan gejala mati pucuk daun yang parah, penggulungan tepi daun ke bawah, warna daun yang memerah, dan pelayuan daun yang dapat mengarah pada robohnya seluruh tanaman. Hawaii, sebagai salah satu daerah penghasil nanas terbesar di dunia, telah banyak mempublikasikan laporan mengenai penyakit layu pada tanaman nanas, yang dikenal dengan nama mealybug wilt of pineapple disease (MWP) yang disebabkan oleh pineapple mealybug wilt-associated virus (PMWaV) (Sether & Hu 2002). Sebelumnya, penyakit layu juga telah menjadi faktor pembatas penting terhadap produksi nanas di Hawaii pada awal tahun 1900an akibat penyakit ini (Carter 1933).
Di Malaysia, penyakit layu nanas menyebabkan tanaman yang terinfeksi menghasilkan buah yang tidak sesuai kriteria pasar dan buah menjadi tidak cocok untuk dikalengkan. Selain itu, kejadian penyakit layu nanas pada varietas Masmerah di Malaysia mencapai antara 0,4% sampai 7,6% (Lim 1985). Di Hawaii, Sether dan Hu (2002) melaporkan kehilangan hasil nanas sebesar 35% pada tanaman nanas yang menunjukkan gejala layu nanas yang diketahui terinfeksi PMWaV-2.
Beberapa penelitian yang telah dilakukan terhadap penyakit ini melaporkan bahwa penyakit layu nanas merupakan suatu penyakit yang melibatkan adanya partikel virus, serangga vektor, dan keadaan lingkungan yang mendukung munculnya gejala pada tanaman. Partikel virus Pineapple mealybug wilt- associated virus-1 (PMWaV-1) dan PMWaV-2 dilaporkan berhasil diekstrak dari tanaman nanas yang menunjukkan maupun yang tidak menunjukan gejala penyakit layu nanas (Sether et al. 2001). Dua spesies kutu putih yaitu Dysmicoccus brevipes (pink mealybug) (Hemiptera: Pseudococcidae), dan D. neobrevipes (grey mealybug) (Hemiptera: Pseudococcidae), dilaporkan berperan sebagai vektor PMWaV-1 dan PMWaV-2 di lapang (Sether et al. 1998 ).
Penyakit layu pada tanaman nanas di Indonesia merupakan penyakit baru yang belum pernah dilaporkan dan dikarakterisasi mengenai dugaan keberadaan partikel virus penyebab penyakit ini di Indonesia. Deteksi dan identifikasi virus penyebab penyakit layu nanas merupakan hal penting bagi penentuan strategi pengendalian penyakit layu nanas. Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian yang dapat mengungkapkan identitas virus yang berasosiasi dengan penyakit layu yang banyak ditemukan pada tanaman nanas di Indonesia dengan metode deteksi secara serologi dan identifikasi virus melalui pendekatan biologi molekuler.
Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah untuk mendeteksi dan mengidentifikasi partikel virus yang berasosiasi dengan penyakit layu pada tanaman nanas cv. Smooth Cayenne di Kabupaten Subang, Jawa Barat, Indonesia.
Hipotesis
PMWaV-1 dan PMWaV-2 berasosiasi dengan gejala penyakit layu pada tanaman nanas cv. Smooth Cayenne di Indonesia. Isolat PMWaV Indonesia memiliki ciri-ciri biomolekuler dan runutan nukleotida yang berkerabat dekat dengan PMWaV asal Hawaii.
Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat dalam memberikan informasi mengenai keberadaan PMWaV di Indonesia yang dapat digunakan sebagai dasar keilmuan bagi Badan Karantina Indonesia untuk menyusun ulang daftar Organisme Pengganggu Tumbuhan (OPT) Karantina, sehingga aturan mengenai lalu lintas bahan tanaman dengan negara lain atau antar daerah di Indonesia dapat disusun lebih tepat lagi.
TINJAUAN PUSTAKA
Nanas merupakan tanaman tropis yang dapat dibudidayakan di kisaran wilayah 25° LU sampai 25° LS. Nanas memiliki banyak varietas yang berbeda dalam ukuran tanaman dan buah, warna dan rasa daging buah, serta pola duri pada tepi daunnya (CABI 2005).
Dalam prakteknya, budi daya nanas memiliki beberapa kendala yang salah satunya adalah serangan hama dan penyakit. Dysmicoccus brevipes merupakan hama tanaman nanas yang paling serius di dunia. Serangga ini sangat umum di daerah tropis dan berperan dalam menyebabkan gejala layu nanas pada varietas Smooth Cayenne dan Masmerah, namun varietas Singapore Spanish menunjukkan sifat tahan terhadap hama ini (CABI 2005). Selain kerusakan akibat aktivitas makan, serangga ini juga diketahui berperan sebagai vektor PMWaV yang dapat menyebabkan penyakit layu pada tanaman nanas (Sether et al. 1998). Tanaman terinfeksi menjadi merah kekuningan hingga merah terang pada ujung daun yang segera menjalar ke daun lainnya, tanaman menjadi layu, dan buah yang dihasilkan kecil. Meskipun demikian, timbulnya gejala penyakit merupakan fenomena kompleks yang melibatkan adanya partikel virus, D. brevipes, dan faktor lingkungan yang mendukung terjadinya penyakit (Sether et al. 1998). Penyakit ini kemudian dikenal dengan nama penyakit layu nanas.
Gejala Penyakit Layu Nanas
Infeksi awal biasanya muncul pada tanaman-tanaman nanas yang berada di pinggir lahan kemudian menyebar ke tanaman-tanaman di bagian dalam lahan. Penyakit ini dicirikan dengan adanya gejala mati ujung daun dan kemerahan di sepanjang daun, diikuti dengan terjadinya perkembangan perubahan warna daun dari merah ke merah muda, kehilangan kebugaran daun, dan pada akhirnya daun menjadi layu (Gambar 1).
Gambar 1 Gejala PMWaV pada tanaman nanas. A. Gejala layu nanas diambil dari CABI (2005). B. Gejala layu nanas di Kabupaten Subang, Jawa Barat; atas: tanaman nanas sehat, bawah: tanaman nanas sakit.
Tanaman yang terinfeksi pada fase awal pertumbuhan tidak membentuk buah, atau hanya menghasilkan buah yang kecil. Beberapa tanaman, bahkan yang terlihat sangat layu, dapat pulih selama daun yang bergejala layu pada ujungnya telah gugur dan daun yang tumbuh baru tumbuh secara normal. Penyakit ini juga menghambat pertumbuhan akar dan menyebabkan tanaman menjadi layu (Samson, 1986).
Kisaran Inang dan Penularan PMWaV
Nanas merupakan satu-satunya tanaman yang diketahui sebagai inang PMWaV. Meskipun demikian, rumput liar yang tumbuh disekitar tanaman nanas seperti Andropogon insularis dan Paspalum urvillei diduga dapat menjadi inang alternatif dari PMWaV (Gunasinghe 1989). Penyakit layu nanas dilaporkan dapat ditularkan melalui perbanyakan vegetatif tanaman nanas dan melalui vektornya yaitu D. brevipes. Rohrbach et al. (1988) melaporkan bahwa D. brevipes merupakan hama kosmopolitan pada tanaman nanas dan merupakan vektor bagi virus penyebab penyakit layu nanas. Selain itu, D. brevipes bersifat polifagus dengan kisaran inang lebih dari 100 genus dari 53 famili tanaman, termasuk beberapa gulma yang tumbuh di sekitar tanaman nanas seperti A. insularis dan P. urvillei sehingga gulma ini diduga dapat menjadi inang dari PMWaV.
Meskipun demikian, hasil berbeda dilaporkan oleh Sether et al. (1998) yang mendapatkan bahwa tidak ditemukan adanya infeksi PMWaV pada sampel tanaman yang dikumpulkan dari lapang, yaitu gulma, tumbuhan semak, dan pohon yang tumbuh disekitar lahan nanas. Sether et al. (1998) juga melaporkan tidak ada infeksi PMWaV pada Agave, pisang, ketela pohon, Chenopodium, tembakau, dan rumput-rumputan, dimana tanaman nanasnya sendiri menjadi terinfeksi setelah diinokulasi dengan D. brevipes yang viruliferous, meskipun beberapa dari tanaman non-nanas ini dapat dijadikan inang oleh D. brevipes.
Penyakit layu nanas dapat ditularkan oleh dua spesies kutu putih yang menjadi vektor PMWaV, yaitu D. brevipes (pink mealybug), dan D. neobrevipes (grey mealybug). Kedua serangga ini mampu menularkan PMWaV secara semi persisten, meskipun kemampuan menularkannya akan berkurang setelah beberapa hari setelah akuisisi. Sether et al. (1998) melaporkan adanya korelasi antara kehadiran semut dengan tingkat penyebaran penyebaran penyakit layu nanas di lapang. Hal yang sama juga dilaporkan oleh Lim (1985) yang melaporkan bahwa populasi D. brevipes biasanya berasosiasi dengan semut. Semut akan melindungi dan memelihara D. brevipes dari predasi dan memanen embun madu yang dihasilkan oleh D. brevipes.
Distribusi Geografi PMWaV
Berikut adalah laporan mengenai keberadaan PMWaV yang berhasil dideteksi penyebarannya di dunia (Tabel 1). Carter (1933) dalam laporannya menyebutkan keberadaan vektor penyakit layu nanas yaitu D. brevipes di Indonesia (pulau Jawa) yang telah menyebar luas. Setelah itu, hingga saat ini belum ada laporan detail yang menyebutkan tentang penyebaran penyakit layu nanas di Indonesia. Meskipun demikian, berdasarkan pengamatan di lapang, gejala penyakit layu nanas ditemukan di beberapa daerah sentra produksi nanas di Indonesia seperti di Kabupaten Subang Jawa Barat, Lampung, Jawa Timur, dan Sumatera Utara (Arta 2006, Komunikasi pribadi). Diduga penyakit layu nanas telah menyebar luas di beberapa wilayah di Indonesia, mengingat bibit yang dihasilkan umumnya berasal dari perbanyakan vegetatif dari tanaman induk yang
sebelumnya telah terinfeksi PMWaV. Di dunia, penyakit layu nanas telah banyak dilaporkan di berbagai negara sentra produksi nanas (Tabel 1).
Tabel 1 Distribusi geografik PMWaV di dunia*
Benua Negara Propinsi Keterangan
Eropa Spanyol Dilaporkan ada, tanpa
keterangan detail
Asia Cina Taiwan Tersebar luas
India Uttar Pradesh Dilaporkan ada, tanpa keterangan detail
Indonesia Jawa Dilaporkan ada, tanpa
keterangan detail
Malaysia Semenanjung
Malaysia
Tersebar luas
Sabah Tersebar luas
Sarawak Tersebar luas
Filipina Tersebar luas
Afrika Mauritius Tersebar luas
Afrika Selatan Tersebar luas
Western Hemisphere
Brazil Dilaporkan ada, tanpa
keterangan detail
Guatemala Dilaporkan ada, tanpa
keterangan detail
Jamaika Tersebar luas
Peru Dilaporkan ada, tanpa
keterangan detail
Puerto Rico Tersebar luas
USA Florida Dilaporkan ada, tanpa
keterangan detail
Hawaii Tersebar luas
Oseania Australia Queensland Dilaporkan ada, tanpa
keterangan detail
* sumber: CABI (2005)
Ciri-ciri PMWaV
Kepadatan partikel PMWaV dalam caesium sulphate adalah 1,5 g/cm3. Rasio A260/A280 virus yang telah dimurnikan adalah 1,8. Genom RNA utas
tunggalnya (single stranded RNA/ssRNA) bersifat linear dalam satu bagian (monopartit). Ukuran RNA utas gandanya (double stranded RNA/dsRNA) adalah 8,35 x 106 Da (Gunasinghe & German 1989).
Pada tahun 1986, dsRNA berhasil diisolasi dari tanaman nanas terinfeksi di Hawaii (Gunasinghe & German 1989) dan menyimpulkan bahwa virus dengan RNA utas tunggal berasosiasi dengan penyakit layu nanas. Pada tahun 1987, suatu virus berhasil diisolasi dari tanaman terinfeksi. Virus ini berbentuk batang lentur, tidak beramplop, dan memiliki panjang 1200-1500 nm. Partikel virus, ketika diwarnai dengan uranyl formate jenuh dalam methanol, menunjukkan suatu struktur lubang pada sub unit selubung protein yang merupakan karakteristik closterovirus (Gunasinghe & German 1989) (Gambar 2).
Gambar 2 Partikel PMWaV dibawah Mikroskop Elektron (CABI 2005).
Metode Deteksi PMWaV
Cara terbaik untuk mendeteksi PMWaV adalah dengan mengisolasi dsRNA yang diikuti dengan seperasi RNA pada gel elektroforesis (Gunasinghe & German 1989). Metode serologi seperti Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) atau Serological Specific Electron Microscopy (SSEM) dapat digunakan jika tersedia antiserum (Gunasinghe dan German 1989), tetapi hasil deteksi serologi yang lebih baik didapatkan dengan menggunakan metode Tissue Blot Immunoassay (TBIA) (Hu et al. 1997). Virus ini dapat dimurnikan dengan
menggunakan presipitasi polyethyleneglycol (PEG) yang diikuti dengan cesium sulphate gradient centrifugation menggunakan metode yang digunakan oleh Gunasinghe dan German (1989). Ullman et al. (1989) berhasil menghasilkan antiserum terhadap partikel mirip Closterovirus yang berasosiasi dengan penyakit layu nanas. Hasil positif didapatkan dari tanaman yang terinfeksi virus menggunnakan deteksi secara serologi dengan uji difusi ganda Ouchterloney, ELISA, dan Serological Specific Electron Microscopy (SSEM).
Metode pendeteksian secara molekuler dengan reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) juga dapat digunakan untuk mendeteksi PMWaV dari tanaman nanas yang terinfeksi. Amplikon genom HSP 70 dari PMWaV-1 dan PMWaV-2 berhasil dideteksi dari tanaman nanas yang terinfeksi oleh PMWaV menggunakan primer yang spesifik terhadap PMWaV-1 dan PMWaV-2 (Sether et al. 2001).
BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, mulai bulan Agustus 2005 sampai April 2006.
Metode Penelitian Bahan Penelitian
Bahan penelitian yang digunakan adalah sampel daun nanas cv. Smooth Cayenne yang berasal dari pertanaman nanas di Kabupaten Subang Jawa Barat. Sampel daun nanas di ambil dari lahan perkebunan nanas secara acak terhadap tanaman nanas yang menunjukkan gejala layu nanas, serta sampel tanaman nanas sehat. Beberapa tumbuhan selain nanas yang tumbuh di sekitar areal penanaman nanas juga diambil untuk dianalisis.
Tissue Blot Immunoassay (TBIA)
Deteksi PMWaV secara serologi pada tanaman nanas dilakukan dengan menggunakan metode TBIA seperti yang dilaporkan oleh Hu et al. (1997). Daun dari tanaman nanas yang menunjukkan gejala maupun yang tidak bergejala layu, digunakan sebagai sampel yang akan dideteksi. Sampel daun dipotong melintang pada bagian dasar daun yang masih putih untuk membuat tepi potongan yang rata. Potongan ini kemudian ditempelkan pada 0,45 µm Nitro ME nitrocelulose membrane (Amersham Pharmacia Biotech, USA) selama 3-5 detik. Pola jaringan pembuluh daun akan menempel dan tertinggal pada membran. Membran kemudian disimpan kering diantara lipatan kertas saring pada suhu ruang sampai siap dianalisis.
Membran yang telah diblot ditempatkan dalam wadah plastik dan diblocking dengan 2% (wt/vol) susu skim yang dilarutkan dalam larutan penyangga tris buffer saline (TBS) (50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7,5) selama 30 menit pada suhu ruang. Membran kemudian diinkubasikan dalam
wadah plastik yang baru atau kantung plastik segel dengan antibodi monoklonal PMWaV (Agdia Inc., USA) dengan pengenceran 1:10 dalam TBS pada suhu ruang selama 1-2 jam, atau pada suhu 4°C selama 1 malam. Membran kemudian dicuci dengan TBST (TBS + 0,5% Tween 20) selama 10 menit sebanyak 3 kali pada suhu ruang. Setelah pencucian, membran kemudian diinkubasikan dengan konjugat alkaline phosphatase (Sigma Chemical Co. St. Louise, USA) pada pengenceran 1:1000 dalam TBS selama 2-3 jam pada suhu ruang. Membran kemudian dicuci sebagaimana di atas, dan diwarnai dengan substrat 5-bromo-4- chloro-3-Indolyl Phosphate/Nitro Blue Tetrazolium (BCIP/NBT) (Sigma Chemical Co., USA) menggunakan satu tablet BCIP/NBT yang dilarutkan dalam 10 ml larutan penyangga Alkaline Phosphate (AP). Pewarnaan dilakukan pada suhu ruang hingga terjadi perubahan warna pada membran. Reaksi pewarnaan dihentikan dengan mencuci membran dengan air mengalir dan dikeringanginkan.
Reverse Trancriptase - Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
Total RNA diekstrak dari 100 mg jaringan daun tanaman nanas menggunakan Rneasy Plant Mini Kits (Qiagen Inc., Chatsworth, CA., USA). Sampel RNA yang telah dimurnikan diresuspensikan dengan 40 µl air bebas RNase, kemudian disimpan pada suhu -80°C sampai akan digunakan. Amplifikasi sebagian genom PMWaV-1 dan PMWaV-2 dilakukan menggunakan sepasang primer 223 dan 224 untuk PMWaV-2 dan 225 dan 226 untuk PMWaV-1 (Tabel 2).
Tabel 2 Sekuen primer, ukuran produk, dan posisi nukleotida pada gen PMWaV- 1 dan PMWaV-2 (Sether et al. 2001)
PMWaV Primer Sekuen Ukuran
produk Nukleotidax 1 225y 5’-ACAGGAAGGACAACACTCAC-3’ 589 118 1 226z 5’-CGCACAAACTTCAAGCAATC-3’ ... 707 2 224y 5’-CATACGAACTAGACTCATACG-3’ 609 226 2 223z 5’-TCATTGCACTCACTTATCGTTG-3’ ... 835 x
Lokasi primer (posisi nukleotida dari awal) gen homolog HSP70 PMWaV y
Forward primer z
Reaksi RT dilakukan pada volume 20 µl terdiri dari 3 µl RNA hasil ekstraksi, 0,75 pmol primer, 500 mM dNTPs, 5 mM MgCl2, 4 µl bufer RT (250
mM Tris-HCl, pH 8,3, 375 mM KC, 15 mM MgCl2, 50 mM DTT), 20 unit
RNAsin Ribonuclease inhibitor (Promega, Madison, WI, USA), dan 65 unit MMLV reverse transcriptase (Promega, Madison, WI, USA). Reaksi RT dilakukan pada kondisi 25 °C selama 5 menit, 42 °C selama 60 menit, diikuti dengan inaktivasi pada 72 °C selama 15 menit.
Reaksi PCR dilakukan pada volume 50 µl terdiri dari 0,75 pmol forward primer (224 untuk PMWaV-2 dan 226 untuk PMWaV-1) dan reverse primer (223 untuk PMWaV-2 dan 225 untuk PMWaV-1) (Tabel 2), 3 µl bufer reaksi (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl [pH 9,0 pada 25°C], 1,0% [vol/vol] triton X-100), dan 0,5 µl taq DNA polimerase (Promega, Madison, USA). Kondisi PCR awalnya adalah denaturasi pada suhu 94°C selama 4 menit, kemudian dilanjutkan dengan 45 siklus pada 94 °C selama 1 menit, 50 °C selama 1 menit, dan 72 °C selama 1 menit, dan diikuti dengan perpanjangan pada 72 °C selama 10 menit pada mesin PCR (Perkin Elmer 9700 thermocycler).
Separasi DNA produk RT-PCR dilakukan pada gel agarose 1% dalam larutan penyangga TBE (54 gr Tris base, 27,5 gr Asam Borat, 20 ml EDTA 0,5 M, pH 8,0 dalam 1000 ml air) pada kondisi 70 V selama 2 jam. Amplicon divisualisasi dengan 2 µg/ml ethidium bromida dalam larutan penyangga TBE untuk elektroforesis. Setelah pewarnaan, gel kemudian difoto di atas cahaya ultra violet (310 nm) menggunakan kamera polaroid Direct Screen DS34 dan film polaroid FP-3000B SS.
Purifikasi Virus
Seratus gram jaringan tanaman sakit dibekukan dengan nitrogen cair, ditumbuk hingga halus dengan mortar, dan dicairkan dengan bufer ekstraksi EB (500 mM Tris-Cl, pH 8,4, 4% Triton-X 100, 0,2% 2-mercaptoethanol) sebanyak 2 ml/g jaringan. Hasil gerusan dihomogenisasi menggunakan pengaduk selama satu jam pada suhu 4°C dan disaring menggunakan kain kasa, dan hasil saringan disentrifugasi pada 7.500 rpm selama 30 menit pada rotor P70AT (Hitachi).
Supernatan yang didapatkan kemudian disentrifugasi pada 44.500 rpm selama 60 menit pada rotor P70AT, dan peletnya dilarutkan dalam bufer TM (100 mM Tris- Cl, pH 8,5, dan 10 mM MgCl2) menggunakan 1/8 volume bufer ekstraksi.
Suspensi ini diklarifikasi dengan sentrifugasi pada 7.500 rpm selama 15 menit pada rotor P70AT, dan supernatan yang didapatkan dilapiskan diatas 5 ml 0,48 molal Cs2SO4 dalam bufer TM dan disentrifugasi pada 46.000 rpm selama 16 jam
dalam rotor P80AT pada suhu 8°C. Pelet yang dihasilkan dilarutkan dalam 200 µl bufer TM (Gunasinghe & German 1989).
Sodium Dodecyl Sulphate – Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) dan Western Blotting
Berat molekul protein selubung PMWaV dianalisis dengan menggunakan metode SDS-PAGE. Analisis dilakukan terhadap fraksi-fraksi hasil pemurnian virus, tanaman terinfeksi virus gemini, dan tanaman terinfeksi TMV sebagai pembanding. Fraksi hasil pemurnian virus dihomogenisasi dengan 200 µl larutan penyangga (62 mM Tris-HCl, pH 6,7, 2% SDS, 5% 2-mercaphtoethanol, 10% glycerol, dan 0.004% bromophenolblue), kemudian dipanaskan sampai mendidih (100 °C) selama 10 menit, dan disentrifugasi 13.000 rpm (rotor Tomy MRX-151) selama 10 menit. Supernatan dapat langsung digunakan atau disimpan pada suhu - 20 °C.
Analisis SDS-PAGE membutuhkan dua jenis gel yang berbeda yaitu separating gel (gel pemisah) dan stacking gel.Gel pemisah dibuat dengan cara mencampur acrylamide 10% (1,8 ml) dengan bis-acrylamide 0,25% (1,5 ml), Tris-HCl 0,375 M pH 8,8 (2,5 ml), SDS 0,1% (0,005 ml), TEMED 0,025% (0,006 ml), APS (amonium persulphate) 0,025% (0,17 ml), dan 4 ml air. Setelah bahan- bahan tercampur rata kemudian dimasukkan ke dalam pelat gelas ukuran 10 x 7,2 cm yang telah dipasang pada gel stand. Permukaan atas gel diratakan dengan menambah air di atas lapisan gel sekaligus untuk mempercepat pembekuan gel. Air dapat dibuang setelah terlihat batas tegas antara air dan gel yang membeku. Stacking gel dibuat dengan cara mencampur acrylamide 3% (0,06 ml) dengan bis- acrylamide 0,08% (0,04 ml), Tris-HCl 0,125 M (2,5 ml), pH 6,8, SDS 0,1% (0,1
ml), TEMED 0,025% (0,006 ml), APS 0,025% (0,1 ml), dan 6,3 ml air. Campuran tersebut selanjutnya dituang di atas gel pemisah, kemudian dipasang sisir (comb), dan setelah gel membeku comb dapat dicabut dan gel siap digunakan.
Sampel selubung protein virus yang berasal dari pemurnian virus, didenaturasikan dengan cara memanaskan protein selubung virus pada suhu 100 °C selama 10 menit di dalam water bath. Setelah itu, sebanyak 15 µl masing- masing sampel protein dimasukkan ke dalam lubang gel poliakrilamid 10% yang dibuat sebagaimana disebutkan di atas, dalam penyangga 10 ml Tris-HCl pH 8,3 yang mengandung 3.2 ml glisin 0,2 M dan 2 ml SDS 10%. Elektroforesis dilakukan pada suhu ruang (24 °C) pada 80 volt selama 120-180 menit. Selubung protein PMWaV dibandingkan dengan berat molekul penanda seperti