Kerang Anadara antiquata dari perairan Cilincing diaklimatisasi selama 72 jam di dalam akuarium berisi air laut bersih, yang dilengkapi dengan pompa filter dan aerator untuk menjamin sirkulasi yang baik.
Induksi merkuri
Konsentrasi merkuri (HgCl2) yang dipaparkan pada kerang yaitu 0,0025; 0,005; 0,01; dan 0,02 ppm dalam 5 liter air laut, dari larutan stok merkuri 100 ppm yang telah disiapkan sebelumnya. Kerang uji digunakan sebanyak 5 ekor untuk setiap perlakuan konsentrasi. Rataan panjang kerang uji 31,57 ± 0,66 mm. Percobaan menggunakan Rancangan Acak Kelompok. Pada hari ke 2, 4 dan 6 induksi, diambil seekor kerang uji dari masing-masing perlakuan, kemudian dipisahkan organ insangnya, dan difiksasi dalam larutan Buffered Neutral Formalin (BNF) sebelun diproses lebih lanjut.
Pembuatan preparat histologis
Prosedur preparasi dan pewarnaaan histologis jaringan insang mengacu pada Sahin (2006), sebagai berikut :
Fiksasi : Jaringan insang dipotong 10 mm2 dan difiksasi dalam larutan BNF 48 jam, untuk memudahkan pemotongan dan pewarnaan jaringan. Dehidrasi : jaringan direndam dalam larutan alkohol 70% (2 x 15 menit), alkohol 80% (30 menit), alkohol 90% (2 x 15 menit), dan terakhir alkohol absolut (24 jam). Clearing : jaringan dipindahkan ke dalam larutan campuran alkohol : xilol (1:1) dengan tiga kali pemindahan, masing-masing selama 30 menit, dan terakhir dalam xilol absolut selama 30 menit. Infiltrasi : jaringan direndam dalam larutan campuran xilol : alkohol 47°C perbandingan 1:1 dengan tiga kali pemindahan, masing-masing selama 30 menit, terakhir direndam dalam alkohol 47°C selama 24 jam. Embedding: jaringan direndam dalam alkohol keras 52°C sampai alkohol dingin dan mengeras. Sliding: Proses sliding/pengirisan dilakukan setelah alkohol pada proses embedding mengeras, pengirisan setebal 5-6 µm menggunakan mikrotom. Afixing: Hasil sliding diletakkan pada permukaan gelas obyek yang
telah diolesi Meyer’s Hoff albumin, selanjutnya gelas obyek diletakkan di atas hot plate-parafin di sekeliling preparat, kemudian dibersihkan menggunakan cotton bud secara hati-hati setelah alkohol di sekeliling preparat bersih. Preparat kemudian didiamkan selama 24 jam. Staining: proses pewarnaan menggunakan metode Hematoxilin-Eosin (HE), yaitu merendam gelas obyek dalam larutan xylol dengan dua kali pemindahan, lalu diganti dengan alkohol yang diturunkan konsentrasinya secara gradual, mulai dari 100% sampai 50%, masing-masing selama 3 menit. Selanjutnya diwarnai dengan HE dan dicuci, lalu didehidrasi dan direkat dengan gelas tutup yang telah ditetesi Canadia balsam. Preparat siap untuk diobservasi.
HASIL PENELITIAN
Proses aklimatisasi kerang dalam air laut bersih bertujuan mengkondisikan kerang dalam lingkungan yang baru, sekaligus menurunkan kandungan merkuri dalam tubuhnya. Secara umum, kondisi morfologis insang yang terpapar merkuri terlihat lebih pucat, jika dibandingkan dengan insang hewan kontrol (Gambar 17).
Gambar 17. Morfologi insang: (a) kontrol ; (b) dengan induksi Hg 0,02 ppm Pengaruh lamanya paparan dan gradient konsentrasi Hg terhadap morfologi insang, ditampilkan berikut ini.
a
b
Gambar 18. Morfologi insang kontrol. Jaringan insang tampak segar.
Pengamatan sediaan histologi insang menjumpai bahwa hari ke dua terpapar merkuri, tidak terjadi kerusakan berarti pada struktur histologis insang, kecuali pada konsentrasi Hg 0,02 ppm yang dijumpai hyperplasia, yaitu pembentukan jaringan secara berlebihan yang mengakibatkan penebalan jaringan epitel di ujung filamen, seperti bentuk pemukul bisbol (Gambar 23). Kondisi sel- sel epitel insang masih cukup baik dan rapat memenuhi lamella insang. Peningkatan konsentrasi merkuri, relatif tidak menyebabkan perbedaan berarti pada struktur histologis lamella insang.
Pada hari ke 4 induksi merkuri, secara umum struktur histologis insang masih cukup baik (Gambar 24). Lamanya paparan dan gradien konsentrasi Hg tidak menyebabkan kerusakan terlalu berat pada insang, kecuali pada konsentrasi Hg 0,01 ppm yang terlihat keadaan hyperplasia.
Gambar 19. Morfologi insang dengan induksi Hg 0,0025 ppm, pada hari ke 6. Jaringan insang relatif masih segar, namun berwarna sedikit pucat.
Gambar 20. Morfologi insang dengan induksi Hg 0,005 ppm, hari ke 6. Warna insang sedikit pucat, kesegaran insang tampak berkurang.
Gambar 21. Morfologi insang dengan induksi Hg 0,01 ppm, hari ke 6. Warna insang pucat, kesegaran berkurang, insang mulai mengerut.
Gambar 22. Morfologi insang dengan induksi Hg 0,02 ppm, hari ke 6.
Insang tampak pucat, mengerut. Tampak bercak-bercak putih di permukaan insang, dan jaringan lunak (soft tissues).
Gambar 23a. Kontrol
Gambar 23b. Hg 0,0025 ppm hari ke 2. Gambar 23c. Hg 0,005 ppm hari ke 2
Gambar 23d. Hg 0,01 ppm hari ke 2. Gambar 23e. Hg 0,02 ppm hari ke 2 (Keterangan: semua gambar pada perbesaran 10 x 40; h = hyperplasia)
Gambar 24a. Hg 0,0025 ppm hari ke 4. Gambar 24b. Hg 0,005 ppm hari ke 4.
Gambar 24c. Hg 0,01 ppm hari ke 4. Gambar 24d. Hg 0,02 ppm hari ke 4
(Ket: semua gambar pada perbesaran 10 x 40; h = hyperplasia).
Pada hari ke 6 induksi merkuri, A. antiquata tampak masih mampu bertahan terhadap gradien konsentrasi Hg yang diinduksikan (Gambar 25). Kerusakan pada struktur histologis insang mulai dijumpai berupa nekrosis, namun tidak terlalu parah. Peningkatan konsentrasi Hg di medium air relatif tidak menyebabkan tingkat kerusakan yang berbeda. Struktur histologis insang tampak tidak terlalu berbeda, pada konsentrasi Hg tertinggi (0,02 ppm) maupun konsentrasi terendah (0,0025 ppm).
Gambar 25a. Hg 0,0025 ppm hari ke 6. Gambar 25b. Hg 0,005 ppm hari ke 6.
Gambar 25c. Hg 0,01 ppm hari ke 6. Gambar 25d. Hg 0,02 ppm hari ke 6 (Ket: semua gambar pada perbesaran 10 x 40; h = hyperplasia).
h
PEMBAHASAN
Kemampuan insang mentoleransi masuknya Hg2+ sangat penting dalam proses bioakumulasi di tubuh kerang. Penghambatan kerja enzim dipengaruhi oleh konsentrasi terlarut, laju pengambilan, dan lamanya paparan Hg2+ dari medium air. Pengaruh toksik yang ditimbulkan oleh Hg2+ antara lain, mengurangi ion-ion cairan tubuh, meningkatkan permeabilitas ion dengan menggantikan Ca2+ dari kanal membran, dan menghambat kerja enzim Na+K+ATPase (Morgan et al.
2004). Di lain pihak, avertebrata akuatik mampu menyeimbangkan logam yang masuk dengan meningkatkan proses ekskresi, sampai batas konsentrasi subletal, ketika konsentrasi Hg2+ dalam tubuh mencapai kesetimbangan dengan konsentrasinya di air. Avertebrata akuatik mampu melakukan detoksifikasi, dan menyimpan logam di tubuh, tanpa membahayakan dirinya (Yap et al. 2007).
Merkuri yang masuk ke tubuh kerang akan ikut dalam sirkulasi cairan tubuh, selanjutnya terakumulasi, terutama pada insang (Gupta & Singh 2011). Berdasarkan gambaran histologis insang, peningkatan konsentrasi dan lamanya induksi Hg, relatif tidak menimbulkan kerusakan berat pada struktur histologis insang A. antiquata. Demikian pula kondisi histologi insang pada hari terakhir induksi (hari ke 6), relatif tidak terlalu berbeda dengan kondisi awal pengamatan (hari ke 2 induksi). Hal ini memberikan gambaran bahwa A. antiquata mampu meregulasi cekaman masuknya Hg2+dari lingkungan sekitarnya, dengan melakukan mekanisme tertentu yang tidak menyebabkan kerusakan insang, sebagaimana disebutkan oleh Yap et al. (2007).
Ion-ion Hg2+ masuk ke dalam insang melalui protein channel sodium, yang dipicu oleh gradient elektrik, yang difasilitasi oleh enzim H+ATPase, dan terakumulasi untuk sementara di dalam insang. Tahap berikutnya, ion-ion Hg2+ diangkut sepanjang membran basolateral insang, lalu masuk ke dalam. Enzim Na+K+ATPase yang ada di membran basolateral se linsang, merespon zat toksik, termasuk merkuri. enzim ini bertugas memindahkan ion-ion Na+ dalam pergantion ion K+ sepanjang membrane basolateral insang ke dalam cairan intraseluler darah (Morgan et al. 2004). Paparan Hg2+ dapat menghambat aktivitas enzim ini, sehingga mengganggu kerja insang.
Hasil histologis insang ini ternyata mendukung hasil percobaan bioakumulasi secara biokinetik, yang dilakukan sebelumnya (topik 1 disertasi ini). Pada dua hari pertama, laju bioakumulasi berlangsung lambat, lalu meningkat secara linier, sampai tercapai kondisi tunak. Pada penelitian ini, hari ke 2 induksi Hg tidak menyebabkan kerusakan pada jaringan insang. Pada hari ke 4, kerusakan insang baru dijumpai meskipun relatif ringan berupa hyperplasia, yang mengindikasikan terjadinya gejala pencemaran di lingkungan sekitar biota (Tanjung 1997). Pada hari ke 6, kondisi insang relatif tidak berbeda di antara perlakuan konsentrasi Hg.
Sebagai perbandingan, dijumpai kerusakan berat insang kerang Lamellidens marginalis setelah 96 jam induksi nikel, sehingga struktur insang menjadi tak beraturan (Andhale et al. 2011). Pada insang kerang Potamocorbula amurensis
dijumpai nekrosis setelah diinduksi kadmium 0,01 ppm (Werner et al. 2003). Keadaan nekrosis adalah kematian sel karena rusaknya jaringan insang, dan hal ini menandakan telah terjadi pencemaran berat di lingkungan (Tanjung 1997).
Arockia et al. (2012) menyebutkan Hg walaupun dalam konsentrasi rendah namun memiliki toksisitas tinggi, dan berdampak negatif, terutama bagi biota akuatik. Kondisi toksik mendorong tubuh kerang untuk mengendalikan metabolisme, berupa peningkatan atau penurunan jumlah molekul enzim, perubahan enzim yang bekerja, maupun pengendalian fungsi enzim. Dengan regulasi tersebut, kerang dapat bertahan terhadap toksistas logam berat. Salah satu bentuk regulasi internal terhadap akumulasi Hg, adalah sintesis protein
metallothionein (MT).
MT adalah protein kecil berukuran 4-10 kDa, mengandung 26-33% cysteine
(Cys) yang mampu mengikat ion-ion logam dengan ikatan kovalen dan menimbunnya, serta tidak memiliki asam amino aromatik atau histidin (Baird et al. 2006; Gagné et al. 2007). MT ditemukan tidak hanya pada jaringan/organ (missal hati, ginjal, insang, testis, usus, otot, plasma, eritrosit, sel-sel epitel), namun juga di sitoplasma dan nukleus. Jaringan yang paling baik digunakan untuk observasi MT pada bivalvia, adalah insang (Amiard et al. 2008; Bernal- Hernandez et al. 2010). Pengikatan logam oleh MT melindungi biota terhadap pengaruh toksik logam berat, karena membatasi bioavailabilitas kation logam pada tempat-tempat yang tidak diinginkan (Baird et al. 2006). Selama MT berfungsi baik, dan/atau kandungan logam berat yang masuk tidak melebihi kemampuan MT mengikat logam tersebut, biota tidak akan mengalami gangguan keracunan logam berat (Amiard et al. 2008).
SIMPULAN
1. Lamanya perlakuan induksi, dan gradien konsentrasi merkuri di medium air, relatif belum menimbulkan kerusakan berat pada struktur histologis insang
A.antiquata; insang tetap berfungsi, dan kerang uji tetap hidup sampai dengan hari terakhir induksi merkuri.
2. Lamanya induksi dan gradien konsentrasi merkuri, relatif tidak menyebabkan tingkat kerusakan berbeda terhadap struktur histologis insang A.antiquata. 3. Diduga terjadit mekanisme detoksifikasi yang dilakukan oleh A. antiquata
untuk menetralisir dampak toksisitas merkuri, sehingga kerang uji tidak mengalami kerusakan jaringan insang yang berat, dan mampu tetap hidup sampai akhir masa induksi.
3. EKOBIOLOGI KERANG BULU Anadara antiquata