Bahan dan Alat
Benih padi transgenik didapat dari hasil penelitian sebelumnya yaitu galur C. 72, C. 83 dan C. 91 dan kultivar Ciherang. Bahan kimia yang umum digunakan biologi molekuler, Trizol, ninhidrin, asam asetat glasial, asam fosfat, asa absisat (ABA), NaCl, polyethilene glicol (PEG) dan KAPA SYBR FAST (universal). Peralatan yang digunakan meliputi oven, inkubator, laminar air flow, mesin PCR (Polymerase Chain Reaction), spektrofotometer, Eco Ilumina kuantitatif RT-PCR, aparatus gel elektroforesis dan illuminator UV.
Konstruksi Plasmid Rekombinan Pembawa Gen OsNAC6
Gambar 23 Konstruksi vektor pARNAC6, membawa transgen OsNAC6 dan hpt
dalam T-DNA. Menggunakan promoter konstitutif CaMV 35S;
OsNAC6: OsNAC6 coding sequence; hpt: hygromycin- phosphotransferase coding sequence; nos: nopaline synthase terminator; LB dan RB: left dan right border dari struktur T-DNA
Plasmid pARNAC6 yang mengandung OsNAC6 dan menggunakan pCAMBIA 1305 sebagai backbone yang berperan dalam adaptasi tanaman terhadap cekaman kekeringan. Pada T-DNA plasmid pC1305 ini terdapat gen
hygromycin phosphotransferase (hpt) yang dikendalikan oleh promoter CaMV 35S.
Uji Kekeringan
Kecambah umur 1 minggu dari galur C. 72, C.83 dan C. 91 T1 terpilih ditumbuhkan di media Yoshida mengandung higromisin 50 mg l-1 selama 2 minggu atau hingga semua tanaman kontrol yang tidak ditransformasi mati. Sebagai kontrol digunakan tanaman Ciherang yang tidak ditransformasi. Tanaman transgenik galur C.72, C. 83 dan C.91 yang tumbuh normal dipindahkan ke pot yang berisi campuran topsoil, pasir dan cocopeat (2:1:1). Masing-masing pot berisi 30 tanaman, setiap galur terdiri dari 3 pot. Tanaman ditumbuhkan selama dua minggu pada kondisi normal di rumah kaca. Sebelum perlakuan kekeringan dimulai, tanaman disiram hingga jenuh. Selanjutnya, tanaman dikeringkan (tidak disiram) selama 14 hari atau hingga tanaman kontrol tipe liar menunjukkan layu kritis atau mati. Pengamatan terhadap survival rate dilakukan pada hari ke-7 setelah tanaman disiram kembali dan dihitung berdasarkan jumlah tanaman yang segar kembali dibagi jumlah tanaman yang diuji. Tanaman kemudian dipindahkan ke pot yang lebih besar untuk memperoleh benih generasi berikutnya.
Uji PEG, Salinitas dan ABA pada Fase Vegetatif
Tanaman padi transgenik galur C.71, C. 83 dan C. 91 ditumbuhkan pada media seleksi yang mengandung higromisin 50 mg-l mg l-1 selama 7 hari, benih yang tumbuh digunakan untuk pengujian lebih lanjut. Pengujian perkecambahan dilakukan dengan 10 benih untuk tiap perlakuan dengan dua ulangan. Benih tanaman kontrol yang tidak ditransformasi dari kultivar Ciherang digunakan sebagai kontrol negatif dan galur padi transgenik yang diuji dikecambahkan dalam media yang mengandung polietilena glikol (PEG 20%), sodium klorida (NaCl 200 mM) dan asam absisat (ABA 10 µM) sesuai masing-masing perlakuan. Panjang akar dan panjang daun ditentukan pada hari ke-14 setelah perlakuan. RNA diisolasi pada 0 jam dan 24 jam setelah perlakuan PEG, ABA dan NaCl. RNA yang didapat digunakan dalam analisis ekspresi dengan kuantitatif RT-PCR.
Isolasi RNA
Isolasi RNA total dilakukan dengan menggunakan reagen Trizol berdasarkan protokol Invitrogen (2007). Peralatan yang digunakan untuk isolasi RNA sebelumnya dicuci menggunakan larutan NaOH dan DEPC-H2O 0.01%. Sampel daun padi sebanyak 400 mg digerus dalam mortar berisi nitrogen cair sampai berbentuk bubuk halus kemudian dimasukan dalam tabung eppendorf dan ditambahkan 1 ml Trizol. Sampel selanjutnya diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit untuk proses homogenisasi selanjutnya ditambah 500 µl khloroform. Larutan dihomogenkan dengan cara tabung eppendorf dibolak-balik selama 15
detik, selanjutnya diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang, dan disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit pada pada suhu 4º C.
Supernatan yang diperoleh dipindahkan pada eppendorf baru dan ditambah dengan 500 µl isopropanol sebanyak 1 ml ditambahkan untuk presipitasi RNA, lalu sampel diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit. Sampel RNA selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang, sedangkan pelet dicuci dengan etanol 70%. Pelet divorteks dan disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4º C. Sisa etanol dibuang dengan bantuan mikropipet. Pelet dikeringkan dan dilarutkan dengan DEPC-H2O 0.01% sebanyak 30 µl.
Kuantifikasi RNA total hasil isolasi dilakukan dengan melarutkan 1 µl RNA total dalam 399 µl DEPC-H2O 0.01% kemudian dibaca dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Untuk mengetahui tingkat kemurnian RNA total dilakukan penghitungan rasio dari perbandingan OD 260/OD 280. Sampel RNA hasil isolasi kemudian divisualisasi melalui elektroforesis gel agarosa 0,8% (b/v) menggunakan 2x RNA
loading dye (95% formamide, 0.025% SDS, 0.025% bromophenol blue, 0.025%
xylene cyanol FF, 0.025% etidium bromida, 0.5 mM EDTA). Elektroforesis tersebut berlangsung selama 30 menit dengan besar arus listrik 100 V.
Kuantitatif RT- PCR
RNA diisolasi dari daun tanaman kontrol dan tanaman transgenik menggunakan Trizol (Invitrogen). Real-time PCR dilakukan dengan Eco Illumina real time PCR System menggunakan KAPA SYBR FAST (Universal). Kondisi siklus PCR denaturasi 95 oC selam 5 menit dan 40 siklus : 95 oC selama 3 detik, 60 oC selama 30 detik. Gen aktin digunakan sebagai gen referensi untuk menghitung tingkat transkrip relatif dengan primer (Tabel 12).
Tabel 12 Primer forward dan reverse yang digunakan dalam kuantitatif RT-PCR
Nama Primer Sekuen
OsNAC6 _F 5’ gccggcgttcccggacctggcggcg 3’ OsNAC6 _R 5’ ccgccgccgccgaggccgccgaggc 3’ AP2_F 5’ ttaccgcggtgtcaggcaacggaca 3’ AP2_R 5’ tgtgcagccagagttggcatctgtg 3’ Zincfinger_F 5’ ccatcggcgttcggcgactcggtgt 3’ Zincfinger_R 5’ ggtggtggcagatcccgacgacgaa 3’ MYB_F 5’ tgccgaggcaggccggccttctccg 3’ MYB_R Actin_F Actin_R 5’ cacacattcttgatctcgttgtccg 3’ 5’ catcaggaaggacttgtacgg 3’ 5’ gatggacctgactgactcgtcatac 3’
Kandungan Klorofil (mg g-1)
Analisis klorofil dan pengambilan sampel daun dilakukan pada 8 hari setelah perlakuan. Sampel daun yang diambil yaitu pada daun kedua dari atas. Cara kerjanya yaitu: daun tanaman padi dipotong kecil lalu ditimbang menggunakan timbangan analitik seberat 0.05 g dan dimasukkan dalam mortar porselen, sampel daun dihaluskan dengan cara menggerus sambil ditetesi aseton 80 % secukupnya, lalu supernatan dipindahkan kedalam labu ukur 100 ml melalui kertas saring. Prosedur diatas diulangi hingga warna hijau hilang (seluruh klorofil telah terekstrasi) kemudian tambahkan aseton 80 % kedalam labu ukur sampai mencapai 100 ml, setelah itu larutan tersebut diambil 5 ml dan dimasukkan kedalam labu ukur 50 ml dan diencerkan sampai volume 50 ml, lalu ekstraks tersebut dimasukkan kedalam micro tube 2 ml. Pengukuran absorban menggunakan spektrofotometer UV-Visible pada panjang gelombang ( ) 645 dan 663 nm. Untuk menghitung kandungan klorofil, digunakan rumus sebagai berikut (Yoshida 1979).
Klorofil a = 0.0127 x A663-0.00269 x A645 Klorofil b = 0.0229 x A645-0.00468 x A663 Klorofil total = 0.0202 x A645 + 0.00802 x A663 A663 = Absorbansi pada 663 nm
A645 = Absorbansi pada 645 nm Kerapatan Stomata
Daun padi bagian bawah diolesi cat kuku bening secara rata dan tipis, lapisan cat kuku bening yang telah kering dikelupas menggunakan selotape. Kemudian potongan selotape yang mengandung lapisan cat kuku bening (epidermis daun) diletakkan pada kaca objek. Pengamatan stomata dilakukan menggunakan mikroskop, dengan pembesaran 40x dan diameter bidang pandang 0.5 mm (sehingga didapat luas bidang pandang = ¼ x 33.14 x (0.5)2= 0.19625 mm). Kerapatan stomata (per mm2) dihitung berdasarkan perbandingan antara jumlah stomata dengan luas bidang pandang (rumus yang digunakan adalah sebagai berikut:
Kerapatan stomata =
Luas bidang pandang
Analisis Prolin
Kandungan prolin bebas dianalisis mengikuti metode Bates et al. (1973) menggunakan spektrofotometer. Untuk menentukan konsentrasi prolin dalam sampel digunakan prolin murni yang dilarutkan dalam asam sulfosalisilik 3% dengan konsentrasi: 20: 10: 5: 2.5: 1.25: 0.625 ppm sebagai larutan standar. Asam ninhidrin disiapkan sebagai pereaksi dengan menghangatkan 1.25 g ninhidrin dalam 30 ml asam asetat glasial dan 20 ml 6 M asam fosfat pada oven dengan
suhu 60 °C sampai larut. Kemudian didinginkan dan di simpan pada suhu 4 °C. Sebanyak 0.5 g sampel daun diekstraksi dalam 10 ml asam sulfosalisilik 3%, dan difiltrasi dengan kertas saring Wattman no 1. Selanjutnya 2 ml filtrat direaksikan dengan 2 ml asam ninhidrin dan 2 ml asam asetat glasial pada tabung reaksi selama 1 jam pada suhu 100°C. Setelah 1 jam, larutan didinginkan segera di dalam ice-bath. Campuran ini selanjutnya diekstraksi dengan 4 ml toluen, di vorteks selama 20 detik. Hasil pemisahan larutan tersebut di ambil dengan pipet kemudian diukur absorbansi pada 520 nm dengan spektrofotometer, dengan menggunakan toluene sebagai blanko. Konsentrasi prolin ditentukan dari kurva standar dan dihitung berdasarkan persamaan sebagai berikut:
=
= g prolin/ g bobot segar
Hasil dan Pembahasan
Padi Ciherang adalah kultivar padi sawah irigasi yang tidak toleran kekeringan, untuk itu dilakukan overekspresi gen OsNAC6 yang dikendalikan oleh promoter konstitutif CaMV 35S untuk mempelajari fungsi gen OsNAC6
yang diharapkan dapat meningkatkan ketahanan terhadap cekaman kekeringan.
Gambar 24 Seleksi tanaman transgenik dengan menggunakan media yang mengandung higromisin 50 mg l-1, A) tanaman transgenik yang tahan pada media seleksi yang mengandung higromisin 50 mg-l, B) tanaman yang tidak tahan pada media seleksi.
Tanaman yang digunakan dalam percobaan ini adalah tanaman dari generasi pertama yang bersegregasi dan belum homozigot maka tanaman terlebih dahulu diseleksi pada media mengandung higromisin 50 mg-1 (Gambar 24). Oleh karena itu, untuk evaluasi tingkat toleransi tanaman padi transgenik terhadap kekeringan maka pengamatan difokuskan pada ke-3 galur padi Ciherang yaitu
A
B
[( g prolin/ml) x ml toluen]/[ml tera/ml contoh]