Ketahanan tanaman sangat tergantung pada kondisi lingkungan di mana tanaman tersebut berada. Secara alami tanaman telah dilengkapi dengan mekanisme adaptasi terhadap suatu kondisi lingkungan tertentu. Upaya untuk meningkatkan ketahanan tanaman padi terhadap cekaman kekeringan dan salinitas adalah dengan mengkontrol gen regulator atau faktor transkripsi yang berperan dalam cekaman abiotik. Keunggulan dari upaya ini adalah bahwa secara tidak langsung akan mengaktifkan sejumlah gen yang terlibat dalam respon tanaman terhadap cekaman.
Faktor transkripsi mempunyai peranan penting dalam regulasi selular dan perubahan fisik sebagai respon terhadap cekaman lingkungan pada tanaman. C- repeat binding factor/dehydration responsive element binding factor
(CBF/DREB), faktor transkripsi NAM, ATAF, dan CUC, Zinc Finger Protein dan faktor transkripsi lainnya merupakan regulator yang penting pada respon tanaman terhadap cekaman lingkungan (Huang et al. 2009). Pengetahuan mengenai struktur domain DNA-binding pada faktor transkripsi sangat penting untuk mengetahui fungsi dan mekanismenya. Nama famili gen NAC berasal dari tiga faktor transkripsi yaitu (i) NAM (no apical meristem), (ii) ATAF1–2, dan (iii) CUC2 (cup-shaped cotyledon), yang semuanya memiliki domain DNA-binding yang sama. Famili ini pertama kali diidentifikasi pada tanaman petunia (Souer et al. 1996) dan Arabidopsis (Aida et al. 1997).
Bentuk dan Struktur Faktor Transkripsi NAC
Bagian N-terminus dari protein NAC diketahui merupakan bagian yang terkonservasi dan didalamnya terdapat DNA-binding NAC domain. Secara umum, protein NAC memiliki daerah yang terkonservasi pada bagian N-terminus yang terdiri atas 150–160 asam amino dan terbagi dalam 5 sub-domain: A hingga E (Ooka et al. 2003). Fungsi dari NAC domain diasosiasikan dengan lokalisasi inti sel, DNA binding, dan formasi dari homodimers atau heterodimers (Olsen et al.
2005). Penelitian terhadap struktur protein NAC domain pada tanaman padi yang responsif terhadap cekaman (SNAC1;Stress-Responsive NAC1) telah dilakukan oleh Chen et al. (2011). Dari penelitian tersebut diketahui bahwa NAC domain pada tanaman padi yang responsif terhadap cekaman memiliki kemiripan sturktur dengan NAC domain pada Arabidopsis (ANAC019).
Struktur Daerah Terkonservasi Group NAC
Hasil pensejajaran faktor transkripsi OsNAC6 dari ketiga kultivar Rojolele, Nipponbare dan Batutegi dengan data yang terdeposit dalam pangkalan data GenBank dapat diketahui bahwa terdapat persamaan sebesar 99% dan terdapat perbedaan satu basa pada ketiga sampel dengan sekuen acuan, yaitu basa ke-663. Basa ke-663 pada sekuen acuan adalah basa guanin (G), sedangkan basa ke-663 sekuen ketiga sampel adalah basa adenin (A). Perubahan basa yang terjadi pada sekuen sampel diduga diakibatkan mutasi. Mutasi yang terjadi dapat berupa mutasi alami (spontan) pada organisme tanaman atau berupa mutasi
terinduksi pada saat penelitian dilakukan. Menurut Snustad et al. (1997) mutasi spontan terjadi karena penyebab yang tidak diketahui, sedangkan mutasi terinduksi terjadi karena adanya mutagen, seperti radiasi ionisasi, cahaya ultraviolet, dan berbagai zat kimia.
Adanya perbedaan satu basa pada faktor transkripsi OsNAC6 yang diisolasi dari ketiga kultivar dibanding dengan sekuen acuan ternyata tidak menyebabkan perubahan asam amino yang dibentuk. Hal ini dikarenakan memiliki kodon yang menyandikan asam amino yang sama. Kodon merupakan deret nukleotida pada mRNA yang terdiri atas kombinasi tiga nukleotida berurutan yang menyandi suatu asam amino tertentu sehingga sering disebut sebagai kodon triplet asam amino yang disandikan. Kodon pada ketiga kultivar yaitu CAA, sedangkan sekuen acuan CAG yang keduanya menyandikan asam amino Glutamina. Banyak asam amino yang disandikan oleh lebih dari satu jenis kodon (Dale dan Park 2004).
Berdasarkan hasil alignment dan Blastp terlihat bahwa faktor transkripsi
OsNAC yang berasal dari cDNA padi Rojolele, Batutenggi, Nipponbare dan dari GenBank mempunyai identity 100% (BAA89800) dan mempunyai motif EVQSQPK pada daerah TAR, sehingga dapat disimpulkan bahwa fragmen gen tersebut adalah
OsNAC6 dan termasuk dalam subfamili ATAF, seperti yang dinyatakan oleh Ooka et al. (2003). Hasil analisis filogenetik memperlihatkan bahwa ketiga fragmen OsNAC6
(RL, NB dan BT) sama atau identik dengan OsNAC6 yang terdeposit dalam pangkalan data NCBI. Selain itu meskipun semua fragmen gen yang dianalisis termasuk dalam subfamili ATAF, OsNAC6 berada dalam satu kluster dengan gen
NAC yang berasal dari tanaman monokotil yang lain (H. vilgare, T. Aestivum, S. officinarum dan Z. Mays), dan terpisah dengan OsNAC yang berasal dari tanaman dikotil.
Transformasi Genetik Gen OsNAC6 Melalui A. tumefaciens
Transformasi genetik merupakan salah satu teknik yang sering digunakan untuk memindahkan berbagai sifat penting pada tanaman dan untuk analisis fungsi gen. Keberhasilan transformasi menggunakan gen target dan gen penyeleksi pada kultivar Ciherang menjadi dasar dalam melakukan transformasi menggunakan gen target OsNAC6 yang dikendalikan promotor konstitutif CaMV 35S. Kesulitan dalam transformasi padi indica antara lain rendahnya kemampuan embrio membentuk kalus embriogenik, rendahnya kalus beregenerasi, dan pencoklatan jaringan setelah kokultivasi (Mulyaningsih et al.2010). Keberhasilan transformasi menggunakan Agrobacterium sangat tergantung pada genotipe tanaman serta species atau strain bakteri yang digunakan (Broothearts et al. 2005, Wendt et al. 2010). Selain itu, bahan tanaman (eksplan) yang digunakan sangat berpengaruh terhadap keberhasilan transformasi. Beberapa protokol transformasi
Agrobacterium yang sesuai untuk genotipe tanaman padi tertentu telah dikembangkan (Hiei dan Komari 2008).
Dari hasil penelitian menunjukkan bahwa jumlah kalus embriogenik dan tahan higromisin yang diperoleh setelah transformasi akan mempengaruhi nilai efisiensi transformasi. Tingginya kalus yang tahan terhadap higromisin akan memberikan kemungkinan untuk mendapatkan tanaman transgenik lebih besar. Secara umum nilai efisiensi transformasi pada kultivar Ciherang relatif sangat
rendah yaitu 0,3-3,5 %. Selain itu, diduga bahwa kultivar ini termasuk indica grup I (Zhang et al.1998) yang sebagian besar bersifat rekalsitran untuk kegiatan kultur jaringan (Wunn et al.1996). Dari 39 sampel yang diuji dengan analisis PCR didapat 21 tanaman positif hpt.
Aspek penting lain yang juga perlu dilihat adalah kemungkinan penyisipan daerah di luar T-DNA. Penyisipan daerah tulang punggung plasmid di luar T-DNA ini tidak diinginkan, terutama jika disertai dengan penyisipan gen penyandi antibiotik (misalnya, ampisilin, tetrasiklin) yang tidak diperbolehkan ada di dalam tanaman transgenik, sehingga dapat menimbulkan masalah dalam pelepasan (EFSA 2004). Kemungkinan penyisipan daerah di luar T-DNA pada transformasi menggunakan Agrobacterium adalah 20-30% (Martineau et al.
1994).
Dari hasil analisis menggunakan Chi square bahwa hpt diwariskan secara Mendellian dengan pola 3:1, bersifat dominan dan terintegrasi dalam inti sel pada semua galur transgenik yang diuji. Pola segregasi gen hpt menjadi indikasi pewarisan faktor transkripsi OsNAC6. Tanaman transgenik OsNAC6 yang diharapkan mengoverekspresikan OsNAC6 digunakan untuk analisis selanjutnya. Hasil analisis Southern blot pada kultivar Ciherang diperoleh jumlah salinan gen sisipan antara antara 1-3. Berdasarkan posisi integrasi dalam genom, gen sisipan dapat dipetakan. Tanaman-tanaman dari satu embrio yang sama dianggap seragam secara genetik apabila jumlah dan posisi gen sisipan dalam genom berada dalam pola yang sama.
Ekspresi OsNAC6 pada Tanaman Transgenik
Untuk mempelajari fungsi gen OsNAC6 diperlukan tanaman transgenik yang mengekspresikan gen OsNAC6 berlebih yang berbeda dengan kondisi normalnya, yaitu dengan meningkatkan ekspresi (overekspresi) dan menghilangkan ekspresi (knockout) OsNAC6. Untuk meningkatkan ekspresi
OsNAC6, tanaman padi ditransformasi menggunakan plasmid yang mengandung faktor transkripsi OsNAC6 yang dikendalikan oleh promoter CaMV 35S. Pola ekspresi OsNAC6 di bawah kondisi perlakuan ABA, PEG dan NaCl memperlihatkan peningkatan ekspresi baik pada tanaman kontrol maupun tanaman transgenik. Pada tanaman kontrol, peningkatan ekspresi lebih rendah dibanding tanaman transgenik. Ekspresi OsNAC6 pada tanaman transgenik baik pada 0 atau 24 jam tidak menunjukan adanya perbedaan ekspresi. Hal ini diduga oleh penggunaan promoter konstitutif CaMV 35S yang berekspresi terus menerus baik ada maupun tidak ada cekaman. Peningkatan ekspresi OsNAC6 pada tanaman dapat mengaktifkan gen-gen lain yang responsif terhadap kekeringan dan salinitas.
Asam absisat (ABA) adalah hormon yang dihasilkan tanaman dan mempunyai peranan yang sangat penting dalam merespon terhadap berbagai sinyal cekaman. Faktor transkripsi OsNAC6 memiliki enam abscisic acid responsive elements (ABREs) di daerah promotornya, sehingga ekspresinya terkait dengan lintasan ABA-dependent. Cekaman tersebut menyebabkan ABA terakumulasi dan ABRE yang terdapat di daerah promotor gen OsNAC6
merespons sinyal tersebut. Akibatnya, faktor transkripsi OsNAC6 terekspresi dan menghasilkan protein NAC6 yang akan mengaktivasi banyak gen lain yang
berperan dalam respons tanaman terhadap cekaman kekeringan (Ohnishi et al.
2005). ABA mempunyai peranan penting dalam memberi sinyal dan perlindungan terhadap cekaman kekeringan. ABA diketahui merupakan hormon yang terinduksi cekaman dan inhibitor pertumbuhan tanaman serta berperan sebagai mediator yang berpotensi terhadap sifat toleransi tanaman terhadap cekaman kekeringan (Alcazar et al. 2012). ABA juga berperan dalam konversi sinyal lingkungan ke dalam perubahan ekspresi gen tanaman (Zhang et al. 2004). Banyak gen responsif kekeringan yang aktif dan terinduksi oleh ABA
Adanya peningkatan ekspresi faktor transkripsi OsNAC6 berkorelasi positif dengan pertumbuhan tanaman pada saat terjadi cekaman baik pada cekaman kekeringan yang disimulasikan dengan PEG maupun cekaman salinitas. Peningkatan toleransi tanaman terhadap salinitas akibat adanya ekspresi OsNAC6
yang tinggi mempengaruhi kemampuan tanaman dalam menghadapi cekaman kekeringan dan salinitas. Tanaman padi transgenik menunjukkan pertumbuhan tinggi tanaman dan panjang akar yang lebih baik dibanding tanaman kontrol.
Pada penelitian ini ekspresi OsNAC6 berlebih memiliki peran dalam mengontrol respon terhadap cekaman kekeringan dan salinitas. Akan tetapi, ekspresi OsNAC6 yang berlebihan terus menerus pada padi transgenik yang dikendalikan oleh promoter 35S dapat menimbulkan pengaruh negatif pada tanaman. Kontrol ekspresi OsNAC6 perlu diatur agar fenotipe yang dihasilkan tidak menimbulkan pengaruh negatif dari sisi agronomi. Pendekatan dapat dilakukan untuk mengontrol ekspresi OsNAC6 yang berlebih dengan menggunakan promoter terinduksi cekaman kekeringan. Pada kondisi ini,
OsNAC6 hanya akan terekspresi pada saat tanaman padi terpapar kekeringan. Sejumlah promoter gen yang terinduksi kekeringan seperti rd29A dari A. thaliana
(Yamaguchi-Shinozaki dan Shinozaki 2001) dan salT dari O. sativa (Claes et al.
1998) HVA22, RD29A, dan OsLEA (Xiao et al. 2009; Kasuga et al. 2004; Xiao et al. 2007) dapat menjadi kandidat untuk mengontrol tingkat ekspresi OsNAC6.
Tanaman transgenik overekspresi OsNAC6 selain meningkatkan ekspresi
OsNAC6 juga dapat meningkatkan ekspresi gen regulator lain yang terkait dengan toleransi terhadap cekaman abiotik. Dari hasil analisis kuantitatif RT- PCR tanaman transgenik yang mengoverekspresi OsNAC6 meningkatkan ekspresi relatif AP2, Zinc Finger Protein dan MYB. Faktor transkripsi
AP2/EREBP merupakan famili yang cukup besar pada tanaman dan mempunyai peranan penting terhadap cekaman lingkungan atau cekaman biotik (Ohto et al.
2009). Dari beberapa penelitian melaporkan bahwa overekspresi MYB
meningkatkan toleransi terhadap temperatur rendah dan salinitas pada tanaman
Arabidopsis (Zhang et al. 2012; Ding et al. 2009; Abe et al. 2003; Urao et al. 1996). Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa faktor transkripsi OsNAC6
diduga merupakan gen regulator terhadap gen lain yang responsif terhadap kekeringan dan salinitas.