Peralatan yang digunakan pada penelitian ini adalah autoklaf, laminar air flow, pipet mikro, cawan Petri, tabung reaksi, inkubator, oven, labu Erlenmeyer, dan spektrofotometer. Alat-alat lain yang digunakan adalah tabung Eppendorf, waterbath, sentrifus 5415 R, termometer, gelas piala, Takara PCR Thermal cycler, elektroforesis ATTO, printgraph ATTO, kertas uji, pinset, densitometer dengan program CS Analyzer, dan gunting.
Tabel 1 Isolat L. plantarum yang digunakan
Kode isolat Asal isolate
Mar A5 Markisa Bst 1 Manggis MarC7 Markisa TB (N) Terong Belanda Mg Tm 1 Manggis Mg PSM B3 Manggis TB(S) Terong Belanda Mkw 9 Mangga kweni Bst 5 Manggis Mar B4 Markisa
Bahan yang digunakan antara lain media glucose yeast extract (GYP), 10 Isolat Lactobacillus plantarum yang berasal dari berbagai macam buah (Tabel 1), 5 isolat bakteri uji (Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus cureus, dan Pseudomonas flouresense), potassium asetat, kloramfenikol 30 µg, fenol stop (5% fenol jenuh dalam 95% etanol absolut), kloroform, isopropanol, lisozim 5 mg/mL, SDS 10%, bufer TE pH 8, aqua bidestilata steril, etanol 70%, etanol absolut. Bahan lain yang digunakan adalah Agarosa, bufer Tris Acid EDTA (TAE) 1X, SuperScript III One-Step RT-PCR with Platinum Taq Invitrogen dan, Diethylpyrocarbonat (DEPC).
Metode Perancangan Primer
Perancangan primer dilakukan dengan mencari sekuen dari plantaricin F menggunakan http:www.ncbi.nlm.nih.gov/
.
Sekuen yang diambil adalah sekuen yang menyandikan gen tersebut. Kehomologian sekuen dicari dengan program BLAST untuk menentukan daerah yang terkonservasi. Daerah yang terkonservasi adalah daerah yang memiliki homologi yang signifikan dengan gen yang berfungsi sama pada spesies lain. Daerah terkonservasi didapatkan setelah melakukan pensejajaran atau multiple aligment dengan Crustal W2 yang dapat digunakan pada situs http:www.ebi.ac.uk. Primer yang dibuat harus memiliki syarat umum yaitu % G dan C lebih dari 50%, tidak memiliki kemungkinan saling komplemen antara basa dalam satu rantai primer atau primer lainnya, memiliki 18-25 pasang basa, tidak membentuk primer dimer, waktu melting temperature (Tm) tidak melebihi 700C (Sambrook & Russel 2001). Hasil rancangan diuji menggunakan bantuan program komputer yaitu gene runner.
Pembuatan Media Glucose Yeast Extract- Peptone (GYP) (Triana et al. 2006)
Media ini dibuat dalam 200 mL dengan komposisi yaitu 4 gram agar, 2 gram glukosa, 2 gram yeast extract, 0.4 gram beef extract, 1 gram pepton, Na-Asetat.3H2O 0.28 gram, 1 mL salt solution (0.1 gram MgSO4.7H2O, 0.1 gram MSO4.4H2O, 0.1 gram FeSO4.7H2O, 0.1 gram NaCl dilarutkan di dalam akuades sebanyak 50 mL), 2 mL Tween 80, CaCO3 0.0375 gram/mL, dH2O sampai dengan 200 mL.
Bahan-bahan ditimbang dan dimasukkan ke dalam gelas piala 1 L. Ditambahkan dH2O sampai dengan 200 mL lalu diaduk sampai homogen. Campuran dipanaskan dan diaduk dengan pengaduk stirer. Sebelum dipindahkan ke dalam cawan Petri terlebih dahulu campuran disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 0 C selama 15 menit. Media yang telah mengalami proses sterilisasi dipindahkan ke dalam cawan Petri yang telah disterilkan dan dibiarkan hingga membeku. Media GYP yang telah membeku siap digunakan untuk menumbuhkan bakteri.
Pembuatan media GYP cair dilakukan dengan mencampurkan semua bahan kecuali agar dan CaCO3 ke dalam labu Erlenmeyer dan dikocok dengan pengaduk magnetik hingga homogen. Setelah itu dibagi rata ke dalam beberapa tabung reaksi sebanyak 5 mL dan ditutup dengan sumbat kapas. Media cair GYP ini kemudian disterilkan dengan autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit dan digunakan untuk kultivasi bakteri.
Kultivasi Bakteri
Isolat bakteri L. plantarum yang digunakan untuk isolasi RNA terdapat pada Tabel 1. Biakan bakteri yang telah disiapkan digores sebanyak satu ose dalam media GYP padat. Pekerjaan ini dilakukan dalam laminar air flow secara aseptik. Media GYP padat kemudian diinkubasi dalam inkubator selama 24-48 jam pada suhu 370C. Hasil yang terbentuk berupa koloni tunggal yang menunjukkan bahwa koloni tersebut murni. Biakan murni yang tumbuh pada media padat dipindahkan dalam media cair. Pekerjaan ini juga dilakukan dalam Laminar air flow. Media kemudian diinkubasi selama 12-18 jam pada suhu 370C. Hasilnya dapat dilakukan pemanenan sel yang dapat digunakan untuk proses isolasi RNA.
Isolasi Total RNA (Sambrook et al. 1989) Prosedur isolasi total RNA dimulai dengan pemanenan L. plantarum. Kultur bakteri yang telah tumbuh dalam media cair dipindahkan dalam tabung Eppendorf 2 mL dan disentrifus 7000 rpm selama 5 menit. Pelet yang terbentuk ditambahkan dengan 1 mL fenol stop (5% fenol jenuh dalam 95% etanol absolut) dan dicampurkan hingga homogen. Campuran tersebut disentrifus 8000 rpm selama 5 menit.
Pelet yang terbentuk ditambahkan dengan 800 µL lisozim 5 mg/mL lalu dihomogenkan dengan cara dibolak-balik dan di-vortex. Campuran diinkubasi pada suhu 370C selama
15 menit dan ditambahkan 300 µL SDS 10% lalu dihomogenkan kembali. Campuran tersebut diinkubasi kembali pada suhu 650C selama 3 menit dan ditambahkan 200 µL potassium asetat. Campuran tersebut kemudian dipanaskan pada suhu 800C-900C selama 5 menit dan disimpan dalam ice box selama 3 menit. kemudian sebanyak 80 µL hot phenol ditambahkan dalam campuran tersebut.
Campuran dipanaskan pada suhu 800C- 900C selama 5 menit dan disentrifus selama 5 menit pada 8000 rpm. Supernatan diambil dan ditambahkan kloroform dengan perbandingan 1:1 dan dibolak-balik. Campuran disentrifus 8000 rpm selama 5 menit sehingga terbentuk dua lapisan. Lapisan atas diambil dan ditambahkan 500 µL isopropanol lalu dibolak-balik. Hasilnya disentrifus 8000 rpm selama 5 menit. Pelet yang terbentuk ditambahkan sebanyak 500 µL etanol 70% dan disentrifus 8000 rpm selama 5 menit. Tahapan penambahan etanol 70% dilakukan sebanyak dua kali. Pelet yang terbentuk dikeringkan sampai tidak terdapat etanol. Bila sudah kering ditambahkan 50 µL DEPC 0.1%. Hasil isolasi dicek menggunakan agarosa 1.5%.
Pengukuran Kualitas RNA (Microarrays 2000)
Kualitas RNA dapat diukur menggunakan alat spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm/280 nm. Sampel RNA sebanyak 10 µL diambil dan ditambahkan 990 µL air yang telah mendapat perlakuan Diethylpyrocarbonat (DEPC). Kuvet yang digunakan dalam keadaan bersih dari kontaminasi RNase. Baca absorban pada 260 nm/280 nm.
Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) (Invitrogen 2007)
Bahan-bahan berasal SuperScript III One- Step RT-PCR with Platinum Taq Invitrogen. Campuran reaksi disiapkan yang terdiri atas 12.5 µL 2X reaction mix, 1 µL primer reverse, 1 µL primer forward, 1 µL taq mix, 9.5 µL aqua bidestilata steril, dan 1 µL sampel total RNA. Campuran tersebut disentrifugasi singkat selama 1 menit agar homogen. Campuran dimasukkan kedalam mesin PCR. Reaksi dimulai dengan program 1 siklus 550C selama 30 menit, 1 siklus 940C selama 4 menit, 40 siklus yang terdiri atas 940C selama 30 detik, 550C selama 30 detik, 720C selama 1 menit, 1 siklus 720C selama 7
menit, dan 1 siklus 40C. Hasil disimpan pada suhu -200C.
Elektroforesis Hasil PCR
Elektroforesis hasil PCR dimulai dengan menyiapkan agarosa 2%. Sebanyak 2.6 gram agarosa ditimbang dan dilarutkan dalam 130 mL TAE 1X. Campuran kemudian dipanaskan dalam microwave. Campuran ditempatkan pada bak elektroforesis yang telah disusun. Agarosa yang dapat digunakan bila sudah keras. Elektroforesis sampel selama 60 menit pada 100 volt. Hasil dapat dilihat di alat Printgraph ATTO .
Pengukuran Ekspresi gen pln F
(Nurhidayat 2010)
Pengukuran ekspresi gen pln F menggunakan software CS Analyzer. Cara kerja CS Analyser adalah setelah dilakukan analisis elektroforesis gel agarosa, data hasil elektroforesis berupa gambar di scanner dan diubah menjadi data digital untuk mencari data yang diperlukan. Proses perhitungan dimulai dengan mengitung 1 µL RNA dari RNA total dan RNA produk yang dielektroforesis dari hasil CS Analyzer. Hasil yang didapatkan akan menghasilkan ekspresi gen dari plantaricin F dan 16s RNA.
Ekspresi gen
Hasil perhitungan dari ekspresi gen pln F dan 16s RNA dapat menjelaskan ekspresi relatif gen pln F yang terdapat pada masing- masing isolat.
Uji Aktivitas Antibakteri (Gong et al. 2010) Kultur cair dari sepuluh isolat L. plantarum disiapkan dalam tabung Eppendorf ukuran 2 mL dan disentrifus 12000 rpm selama 3 menit. Supernatan yang dihasilkan digunakan pada uji aktivitas. Lalu disiapkan media padat GYP dan dibuat tanda pada cawan Petri untuk kontrol positif, kontrol negatif, dan sampel. Tahapan selanjutnya, bakteri patogen yang telah ditumbuhkan dalam media cair disebar dalam media GYP padat sebanyak 100 µL. Bakteri patogen yang digunakan ialah Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Pseudomonas flouresense, dan Bacillus cureus. Kertas uji yang telah direndam di dalam isolat Lactobacillus plantarum ditempatkan pada cawan Petri yang telah
diberi tanda. Kontrol positif yang digunakan pada percobaan ini adalah kloramfenikol dan kontrol negatif ialah akuades steril. Lalu inkubasi dalam inkubator selama 1 hari pada suhu 370C.
Pengukuran Aktivitas Antibakteri (Gong et al. 2010)
Hasil dari uji aktivitas yang telah diinkubasi selama satu malam dilihat aktivitas penghambatannya. Aktivitasnya dapat dilihat apabila dari masing-masing sampel yang diuji dapat menghasilkan zona bening. Zona bening yang dihasilkan diukur diameternya dengan menggunakan penggaris. Semakin besar diameter zona bening maka akan semakin tinggi aktivitas penghambatan dari bakteri tersebut. Hasilnya dikoreksi dengan kontrol, yaitu ukuran kertas uji sebesar 0.6 cm.
Diameter Penghambatan
