Isolasi RNA total menggunakan elektroforesis gel agarosa 1.5%. Hasil menunjukkan RNA total dari sepuluh isolat L. plantarum yang digunakan dalam percobaan telah berhasil diisolasi. Kualitas RNA yang telah diisolasi diukur menggunakan metode spektrofotometri. Pengukuran kualitas RNA ini sangat diperlukan karena kualitas RNA yang baik akan mempengaruhi keberhasilan sintesis cDNA (Invitrogen 2007).
Tabel 2 Kuantifikasi RNA dari sepuluh isolat L. plantarum
Isolat A260 A280 A260/280
Mar A5 2,96 2,613 1,1328 Bst 1 2,737 2,709 1,0103 MarC7 2,552 2,27 1,1242 TB (N) 2,872 2,914 0,9856 Mg Tm 1 0,945 0,83 1,1386 Mg PSM B3 1,892 1,665 1,1363 TB(S) 0,877 0,788 1,1129 Mkw 9 2,466 2,28 1,0816 Bst 5 2,737 2,914 0,9393 Mar B4 1,199 1,051 1,1408
Hasil pengukuran kualitas RNA diperoleh dengan perbandingan absorban pada panjang gelombang 260 nm dengan 280 nm. Pengukuran pada panjang gelombang 260 nm untuk mengukur asam nukleat, sedangkan absorban dengan panjang gelombang 280 nm digunakan untuk mengukur protein (Clark & Cristopher 2001). Rasio pengukuran absorban tersebut digunakan untuk menunjukkan
kemurnian RNA terhadap kontaminasi protein. Nilai yang diharapkan dari pengukuran ini berkisar 1.8-2.1. (Sambrook & Russel 2001). Hasil pengukuran dapat dilihat pada Tabel 2. Hasil pengukuran kuantitas RNA menunjukkan bahwa sampel yang diisolasi tidak memiliki kemurnian yang tinggi terhadap kontaminasi dari protein atau pengotor lain. Kontaminasi protein atau pengotor lain dapat terjadi pada saat ekstraksi dengan kloroform tidak efisien dalam menghilangkan protein ataupun pengotor lain (Song et al. 2011).
Terdapat beberapa tahapan dalam isolasi RNA total, antara lain pemecahan membran dan solubilisasi membran, isolasi dan pemurnian RNA, dan pemekatan RNA. Seluruh tahapan ini memerlukan alat-alat seperti Eppendorf, tip, dan seluruh alat-alat gelas yang telah mendapatkan perlakuan DEPC. DEPC berfungsi untuk menginaktifkan RNase yang dapat mendegradasi RNA yang akan diisolasi pada percobaan.
Gambar 5 Elektroforegram Total RNA L.plantarum.
Hasil Perancangan Primer
Konstruksi marka gen plantaricin F dilakukan dengan perancangan primer. Sepasang primer yang spesifik digunakan untuk amplifikasi gen pln F dengan RT-PCR. Sekuen primer yang digunakan dapat mempengaruhi spesifitas dan sensitivitas reaksi dalam RT-PCR. Primer yang digunakan dirancang menggunakan situs NCBI dari daerah yang terkonservasi untuk gen pln F
dan 16s RNA. Hasil dari perancangan primer dapat dilihat pada Tabel 3.
Primer forward dan reverse dirancang berdasarkan kriteria primer yang dapat digunakan untuk amplifikasi, antara lain memiliki panjang primer berkisar 18-25 pasang basa, memiliki Tm tidak melebihi suhu 700C, % GC sekitar 40-60%, dan antara primer forward dan reverse tidak saling komplemen (Sambrook & Russel 2001). Sekuen yang dirancang terdapat pada Tabel 3. Hasil perancangan primer ini bila dianalisis dengan program Gene Runner akan didapatkan data, yaitu pada primer forward pln F terdapat kemungkinan dimer sekitar 6 pb dan tidak terdapat kemungkinan untuk internal loops dan hairpin loops. Pada primer reverse terdapat 3 hairpin loop, dimer sekitar 4 pb, dan internal loop sekitar 8 pb.
Hasil dari perancangan primer gen pln F ini diharapkan akan dapat menghasilkan produk sekitar 70 pb. Hal ini berdasarkan sekuen yang dapat diapit oleh primer. Perancangan primer ini menggunakan sekuen dengan panjang 156 pb. Pada primer forward sekuen dirancang dari urutan 58 sampai dengan urutan 79, sedangkan primer reverse dirancang dari urutan 127 sampai 107. Hal lain yang harus diperhatikan adalah primer yang dihasilkan. Primer ini menentukan suhu dalam penempelan primer pada proses PCR. Suhu penempelan primer terletak 2-10 dibawah nilai melting tempetrature (Tm) dari primer (Sambrook & Russel 2001). Primer 16s RNA merupakan primer universal. Primer ini digunakan sebagai kontrol positif dalam percobaan ini.
Amplikon dan Ekspresi Gen Pln F dengan RT-PCR
Amplifikasi gen pln F menggunakan sepuluh isolat L. plantarum dengan metode RT-PCR. Primer yang digunakan adalah primer gen pln F dan 16s RNA. Primer 16s RNA berfungsi sebagai kontrol positif dalam reaksi ini. 16s RNA merupakan salah satu ribosomal RNA dan hanya terdapat pada prokariot. 70s RNA yang terdapat dalam prokariot terdiri atas dua subunit, yaitu 30s dan 50s. Komponen dari 30s RNA terdiri atas 16s RNA dan 21 protein (Garrett & Grisham 2007)
Tahap awal dari proses RT-PCR adalah sintesis cDNA yang berasal dari sampel RNA dengan menggunakan m-RNA sebagai cetakan (Hogg 2005). Program yang digunakan dalam reaksi RT-PCR, antara lain
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Ket: 1= Mar A5 6 = Mg PSM B3 2= Bst 1 7 = TB (S) 3= Mar C7 8 = Mkw 9 4= TB (N) 9 = Bst 5 5= Mg Tm 1 10 = Mar B4 RNA Total
1 siklus 550C selama 30 menit digunakan untuk sintesis cDNA dari RNA hasil isolasi, 1 siklus 940C selama 4 menit berfungsi dalam tahapan denaturasi atau pemutusan ikatan ganda dari RNA. Selanjutnya, amplifikasi dari PCR dengan menggunakan program 40 siklus yang terdiri atas 940C selama 30 detik untuk denaturasi, 550C selama 30 detik untuk penempelan primer, 720C selama 1 menit untuk sintesis DNA. Tahap akhir dari reaksi adalah 1 siklus 720C selama 7 menit yang digunakan untuk sintesis DNA tahap akhir, dan 1 siklus 40C untuk menjaga agar DNA hasil PCR tidak rusak (Invitrogen 2007).
Hasil amplifikasi dilihat dengan melakukan elektroforesis gel agarosa 2% untuk melihat apakah gen tersebut berhasil diamplifikasi. Elektroforesis menggunakan agarosa 2% menunjukkan pita DNA berukuran 70 pb dengan marker berukuran 100 pb (Gambar 6,7, dan 8). Berdasarkan ukuran pita yang dihasilkan dengan gen yang dirancang, gen tersebut merupakan gen pln F yang diinginkan.
Hasil amplifikasi dapat menentukan nilai ekspresi gen yang ada pada tiap isolat L.plantarum. Nilai ekspresi gen pln F dan 16s RNA dianalisis menggunakan program CS Analyzer. Ekspresi gen merupakan proses yang membawa keterangan mengenai satu gen atau lebih gen ke dalam data fenotip, dalam proses ini melibatkan transkripsi dan translasi (Smith et al. 2000).
Hasil ekspresi gen didapatkan dari elektroforesis RNA total dengan produk hasil RT-PCR. Penentuan masing-masing ekspresi ini dapat menentukan nilai ekspresi relatif gen pln F. Nilai ekspresi relatif gen pln F merupakan nilai perbandingan antara nilai ekspresi gen pln F dengan 16s RNA. Nilai ekspresi gen pln F yang dihasilkan oleh sepuluh isolat L. plantarum memiliki nilai berbeda-beda. Nilai ekspresi relatif gen pln F paling tinggi ditunjukkan oleh isolat TB (S) dengan nilai 28.3 Au, sedangkan isolat Bst 5 tidak memiliki nilai ekspresi relatif gen pln F (Gambar 9). Perhitungan dari nilai ekspresi relatif gen pln F terdapat pada Lampiran 6.
Gambar 6 Elektroforegram hasil produk RT- PCR
Gambar 7 Elektroforegram hasil produk RT- PCR.
Gambar 8 Elektroforegram hasil produk RT- PCR. Sekuen Ukuran (pb) Konsentrasi (nmol) Tm % GC pln FF:5’-TTCCATGCCTATAGCGCGCGTG-3’ 22 50 66.4 59.1 pln F R: 5’-TGATCCAATCGGCAGGCCCAA-3’. 21 50 57.1 57.1 16S RNA F: 5’-CAAGCCACCATTCAAGGTT-3' 20 50 44.6 45 16S RNA R: 5’pln F R: 5’F:5’ -CCCTACTGATCCCGCAATTA-3’.3’3’ 20 50 46.7 50 16S RNA F: 5’ 16S RNA R: 5’ 3’
Gambar 9 Tingkat ekspresi relatif gen pln F dari masing-masing isolat L. plantarum.
Aktivitas Antibakteri Isolat L. plantarum
Terhadap Bakteri Uji
Pengujian aktivitas sepuluh isolat L. plantarum dilakukan terhadap lima bakteri yang mewakili hasil perwarnaan Gram yang berbeda, yaitu bakteri Gram positif dan negatif. Bakteri Gram positif yang diujikan adalah Staphylococcus aureus dan Bacillus cureus. Bakteri Gram negatif yang diujikan antara lain Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Pseudomonas flourosense.
Gambar 10 Hasil uji daya hambat isolat L. plantarum terhadap pertumbuhan bakteri P. flouresense dan E. coli.
Pengujian didasarkan atas pembentukan zona bening disekitar kertas uji yang memiliki diameter sekitar 0.6 cm (Gambar 10). Menurut Paynter et al. (2007) isolat yang mengandung plantaricin F dapat menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Proses penghambatan
plantaricin F dalam menghambat pertumbuhan bakteri dengan menggunakan mekanisme barrel stave. Pada mekanisme ini plantaricin akan berikatan dengan membran target dan membentuk pori sehingga membran target menjadi rusak (Jorgenrud 2009).
Sepuluh isolat pengujian aktivitas L. plantarum (Mar A5, Bst 1, Mar C7, TB(N), Mg Tm 1, Mg PSM B3, TB(S), MKw 9, Bst 5, Mar B4) yang digunakan menghasilkan tingkat penghambatan yang berbeda-beda (Gambar 11). Berdasarkan metode David stout, aktivitas antibakteri dapat dibagi berdasarkan ukuran diameter daerah hambat yang terbentuk. Pembagian diameter berdasarkan metode tersebut antara lain antibakteri yang menghasilkan daerah hambat sebesar <5 mm termasuk sebagai antibakteri yang lemah; 5-10 mm termasuk sebagai antibakteri yang sedang; 10-20 mm termasuk sebagai antibakteri yang kuat; dan > 20 mm termasuk antibakteri yang sangat kuat (Yani 2011).
Hasil penelitian menunjukkan bahwa terdapat beberapa isolat yang tidak dapat menghambat bakteri Staphylococcus aureus antara lain Bst 1, Bst 5, dan Mar B4. Penghambatan tertinggi terhadap bakteri S. aureus terdapat pada isolat Mg PSM B3 dengan diameter penghambatan bakteri uji 2.5 cm. Penghambatan ini termasuk kategori aktivitas antibakteri yang sangat kuat. Pada bakteri B. cureus isolat yang dapat menghambat pertumbuhan paling besar adalah Bst 5 dan Mar B4 dengan diameter penghambatan 0.5 cm. Proses penghambatan termasuk kategori penghambatan antibakteri yang berkekuatan sedang, sedangkan untuk penghambatan terhadap bakteri Gram negatif yang terdiri atas S. typhimurium, E. coli, dan P. flouresense adalah daya hambat paling besar terdapat pada isolat Mar A5. Hasil pengukuran secara berurutan memiliki ukuran penghambatan sekitar 1.33 cm, 1.83 cm, dan 1.16 cm. Penghambatan tertinggi pada ketiga bakteri uji (S. typhimurium, E. coli, dan P. flouresense) ini memiliki daya hambat yang temasuk antibakteri kuat (Yani 2011).
Uji aktivitas dari L. plantarum menggunakan kontrol positif yaitu kloramfenikol. Kloramfenikol merupakan antibiotik yang berspektrum luas dan aktif dalam menghambat bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Cara kerja dari kloramfenikol dalam menghambat bakteri adalah dengan bergabung bersama subunit- subunit ribosom sehingga mengganggu sintesis protein (Pelczar & Chan 2005).
.
Gambar 11 Efektifitas penghambatan isolat L. plantarum terhadap bakteri uji, yaitu S. typhimurium, S. aureus, E. coli, P. flouresense, dan B. cureus.
