Tempat dan Waktu
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian IPB, dan Laboratorium serta Rumah Kaca Kelompok Penelitian Padi, Bidang Biologi Molekular Tanaman, Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI Cibinong. Sampel tanaman padi diambil dari Kabupaten/Kota Bogor, Kabupaten Pandeglang, Subang, Batang, Klaten, Sleman, Jember dan Banyuwangi. Penelitian dimulai pada bulan November 2011 hingga Juli 2012.
Metode Penelitian
Penelitian meliputi 3 kegiatan pokok, yaitu (1) pengamatan gejala di lapangan dan pengambilan sampel tanaman dari lapangan, (2) deteksi Rice tungro bacilliform tungrovirus (RTBV) dan Rice grassy stunt tenuivirus (RGSV), (3) analisis keragaman gen protein selubung RTBV dan RGSV.
Pengamatan Gejala di Lapangan dan Pengambilan Sampel Tanaman Bergejala Tungro maupun Mirip Tungro
Pengamatan gejala di lapangan dan pengambilan sampel tanaman padi sakit dilakukan di 8 kabupaten di Jawa yaitu Bogor, Pandeglang, Subang, Batang, Klaten, Sleman, Jember dan Banyuwangi. Daerah-daerah tersebut dipilih berdasarkan laporan Direktorat Perlindungan Tanaman Pangan (2011a dan 2011b) (Lampiran 1 dan 2) dan informasi dari penyuluh setempat tentang daerah yang diketahui sebagai daerah endemis penyakit tungro dan wereng batang coklat. Informasi tentang kejadian penyakit tungro maupun serangan wereng batang coklat didapatkan dari laporan luas tambah serang periode pengambilan sampel dari Kantor Dinas Pertanian di masing-masing kabupaten.
Pada masing-masing kabupaten diambil 8 sampel dari 8 tempat di beberapa desa dari beberapa kecamatan. Pengamatan gejala dikhususkan pada tinggi tanaman, perubahan warna dan tekstur pada daun, dan jumlah anakan (Tabel 1). Sampel tanaman yang diambil adalah tanaman bergejala tungro maupun mirip tungro. Rumpun tanaman padi sakit yang diambil dari lapangan selanjutnya ditanam kembali di dalam ember plastic berisi campuran tanah dan pupuk kandang Tabel 1 Deskripsi gejala penyakit tungro dan mirip tungro
Kriteria Gejala Gejala Penyakit
Tungro Mirip Tungro
Tinggi Tanaman Kerdil Agak kerdil atau normal
Perubahan warna daun Kuning sampai kuning oranye Kuning sampai kuning oranye
Tekstur daun Tidak kaku Kaku
dengan perbandingan 2:1, kemudian disungkup dan dipelihara di rumah kaca Kelompok Penelitian Padi, Laboratorium Bidang Biologi Molekular Tanaman, Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI Cibinong. Daun padi muda dari rumpun yang menunjukkan gejala kemudian diambil, ditimbang masing-masing sebanyak 0.1 g dan 0.2 g lalu dibungkus dengan aluminium foil dan dimasukkan ke dalam nitrogen cair sebelum disimpan pada suhu -80 oC. Sampel daun tersebut digunakan untuk tahapan isolasi DNA dan RNA total tanaman.
Deteksi Rice tungro bacilliform badnavirus (RTBV)
Isolasi DNA total tanaman. Isolasi DNA total tanaman padi sakit dilakukan menggunakan metode CTAB (cetyl trimethyl ammonium bromide). Metode yang digunakan mengikuti Doyle dan Doyle (1990) yang dimodifikasi dengan penambahan PVP (Polyvynilpyrrolidone) 2% pada bufer isolasi dan penambahan chloroform setelah fase penambahan chloroform:isoamylalcohol. Sebanyak 0.2 g daun padi sakit digerus dengan mortar dan pistil dengan bantuan nitrogen cair. Serbuk yang terbentuk kemudian dimasukkan ke dalam tabung mikro 2 ml dan ditambahkan sebanyak 1 ml bufer ekstraksi (2% CTAB; 0.1 M Tris-HCl, pH 8.0; 0.02 M EDTA, pH 8.0; 1.26 M NaCl; 2% PVP) yang mengandung 1% mercapto ethanol. Setelah serbuk daun dan bufer ekstraksi tercampur dengan baik, campuran kemudian diinkubasi pada 65 oC selama 30 menit, didiamkan sebentar pada suhu ruang. Setelah campuran dingin kemudian ditambahkan 750 µl campuran chloroform:isoamylalkohol (24:1), divorteks, kemudian disentrifugasi pada 11 000 rpm selama 10 menit. Supernatan selanjutnya dipindahkan pada tabung mikro 2 ml yang baru dan ditambahkan 1 ml chloroform, dicampur dan disentrifugasi pada 11 000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang terbentuk dipindahkan lagi pada tabung mikro yang baru dan ditambahkan sebanyak 1 ml isopropanol dingin kemudian dicampur dengan membalikkan tabung berulang kali dengan perlahan. Campuran kemudian diinkubasi pada suhu -20 oC selama 30 menit lalu disentrifugasi pada 11 000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang dan pelet diresuspensi dengan 200 µl TE pH 8.0 (10 mM Tris; 1 mM EDTA). Suspensi ini kemudian ditambahkan sebanyak 1/10 volum larutan 3 M sodium acetate pH 5.2 dan 2.5 volum ethanol absolute kemudian dicampur dengan membalikkan tabung berulang kali dengan perlahan. Campuran kemudian diinkubasi pada suhu -20 oC selama 30 menit untuk presipitasi DNA dan disentrifugasi pada 13 000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang dan pelet yang terbentuk dikeringkan dan diresuspensi dengan 100 µl bufer TE pH 8.0.
Perancangan primer. Sepasang primer dirancang menggunakan program online Primer3Plus untuk mengamplifikasi bagian gen protein selubung (Coat Protein) RTBV. Templat untuk perancangan primer ini adalah runutan basa nukleotida gen selubung protein RTBV yang didapatkan dari GenBank (isolat Phi1, nomor aksesi X57924.1). Runutan DNA tersebut selanjutnya diunggah ke program online Primer3Plus dan digunakan untuk analisis primer. Beberapa pasang primer yang diperoleh digunakan untuk mengamplifikasi gen selubung protein dengan ukuran produk amplifikasi berbeda-beda. Pasangan-pasangan primer yang didapatkan kemudian satu per satu dicobakan pada program Primer Premier 5 (Primer Biosoft International) hingga didapatkan pasangan primer yang tepat mengamplifikasi daerah runutan basa nukleotida yang diinginkan. Pada penelitian
ini didapatkan pasangan primer yang mengamplifikasi bagian gen selubung protein RTBV dengan ukuran 1206 bp. Untuk keperluan penggunaan primer yang lebih luas, misalnya untuk kloning gen, maka beberapa basa nukleotida dari enzim restriksi EcoRI ditambahkan pada ujung 5‟ primer forward dan KpnI pada ujung
5‟ primer reverse. Pasangan primer ini mengamplifikasi bagian gen selubung protein RTBV dengan produk sebesar 1224 bp (Gambar 6).
Gambar 6 Gambaran skematik penempelan primer DA-RTBV yang digunakan untuk mengamplifikasi gen protein selubung RTBV. (A) Ukuran genom 8000 bp adalah ukuran genom RTBV dengan NCBI Reference Sequence: X57924.1. Ukuran genom selubung protein RTBV adalah 945 bp (Nath et al. 2002). (B) Validasi ukuran amplikon pada program Primer Premier 5 (Premier Biosoft International) sebesar 1224 bp.
Amplifikasi gen protein selubung RTBV. Gen protein selubung RTBV diamplifikasi dari DNA total tanaman dengan metode PCR menggunakan sepasang primer spesifik RTBV yaitu primer forward DA-F (5‟-GGAATTCCGG CCCTCAAAAACCTAGAAG-3‟) dan primer reverse DA-R (5‟-GGGGGTACCC CCCTCCGATTTCCCATGTATG-3‟). Primer ini didapatkan dari hasil perancangan primer seperti diuraikan sebelumnya.
Sebanyak 0.4 pmol masing-masing primer, 1x DreamTaqTM DNA Polymerase (Fermentas, USA), dan 1 µl DNA hasil isolasi dalam volum akhir 25 µl digunakan dalam amplifikasi. Amplifikasi dilakukan pada T-Gradient® ThermoBlock (Biometra, Germany) dengan masa denaturasi selama 1 menit pada suhu 94 oC, penempelan primer selama 1 menit pada suhu 62.2 oC, sintesis selama 2 menit pada suhu 72 oC dan diulang sebanyak 34 kali. Hasil PCR dielektroforesis dengan gel
agarosa 1% dan diwarnai dengan merendam gel di dalam larutan ethidium bromide 0.5 µg/ml selama ± 15 menit, kemudian diamati dengan sinar ultraviolet pada UV transilluminator.
Deteksi Rice grassy stunt virus (RGSV)
Isolasi RNA total tanaman. Isolasi RNA total dilakukan dengan menggunakan TRIZOL (TRIzol® reagent) (Invitrogen, USA) menurut
Chomczynski dan Mackey (1995). Sebanyak 0.1 g daun padi sakit digerus dengan mortar dan pistil dengan bantuan nitrogen cair. Serbuk daun kemudian dimasukkan ke dalam tabung mikro 1.5 ml dan ditambahkan 1 ml pereaksi TRIZOL. Setelah serbuk daun dan pereaksi TRIZOL tercampur dengan baik, kemudian diinkubasi pada 30 oC selama 5 menit dan setelah itu ditambahkan sebanyak 0.2 ml chloroform. Campuran ini kemudian dikocok perlahan selama 15 detik dan disentrifugasi pada 10 000 rpm (tidak lebih dari 12 000 gravitasi) pada suhu 4 oC selama 10 menit. Supernatan kemudian dipindahkan pada tabung mikro 2 ml yang baru dan ditambahkan 0.5 ml isoprophanol. Campuran ini diinkubasi pada suhu 30 oC selama 10 menit dan disentrifugasi pada 10 000 rpm pada suhu 4 oC selama 10 menit. Supernatan dibuang dan pelet yang terbentuk dicuci dengan 1 ml ethanol 70% (1 ml ethanol per 1 ml TRIZOL yang digunakan). Campuran ini divorteks dan disentrifugasi pada 10 000 rpm pada suhu 4 oC selama 5 menit. Pelet dikeringanginkan di Laminar Air Flow sampai tidak ada lagi sisa ethanol (pelet jangan terlalu kering) dan kemudian diresuspensi dengan 100 µl air bebas RNAse (Fermentas, USA).
Transkripsi balik RNA. Sebelum dilakukan amplifikasi, RNA total tanaman hasil isolasi terlebih dahulu ditranskripsi balik menjadi cDNA. Transkripsi balik RNA menggunakan kit RevertAidTM (Fermentas, USA). Sebanyak 1 µl RNA total tanaman hasil isolasi, 1x bufer RT, 1.75 mM DTT (di-thio-threitol), 2 mM dNTP, 10 u RevertAidTM MmuLv Reverse transcriptase, 1 u RibolockTM RNAse Inhibitor, dan 15 pmol primer B3. Primer B3 adalah primer reverse spesifik RGSV
(5‟-TCTAGAGCAGTTTCCTGTAGTC-3‟) (Le et al. 2010). Reaksi transkripsi balik dilakukan pada T-Gradient® ThermoBlock (Biometra, Germany) dengan inkubasi awal pada suhu 25 oC selama 5 menit lalu pada suhu 42 oC selama 60 menit dan pada suhu 70 oC selama 15 menit. cDNA yang dihasilkan kemudian dapat digunakan sebagai templatdalam tahap amplifikasi.
Analisis kesesuaian primer gen protein selubung RGSV. Pasangan primer yang digunakan merupakan primer spesifik RGSV (Le et al. 2010). Untuk memastikan pasangan primer tersebut mengamplifikasi di bagian gen selubung protein RGSV maka dilakukan analisis pada program Primer Premier 5 (Primer Biosoft International). Analisis dilakukan dengan menggunakan urutan basa DNA gen protein selubung RNA (Gambar 7).
Hasil analisis menunjukkan bahwa pasangan primer tersebut mengamplifikasi sebagian dari gen selubung protein yang berada di RNA5 genom RGSV dan menghasilkan produk amplifikasi sebesar 243 bp.
Gambar 7 Gambaran skematik penempelan primer F3 dan B3 yang digunakan
untuk mengamplifikasi sebagian gen protein selubung RGSV. (A) Ukuran genom 2700 bp adalah ukuran genom RNA5 RGSV dengan NCBI Reference Sequence: NC_002327.1 dan 978 adalah ukuran gen selubung protein RGSV dengan NCBI Reference Sequence
GenBank: CBA12676.1 (Toriyama et al. 1997). (B) Validasi ukuran amplikon pada program Primer Premier 5 (Premier Biosoft International) sebesar 243 bp.
Amplifikasi sebagian gen protein selubung RGSV. Amplifikasi sebagian gen protein selubung RGSV dilakukan dengan metode PCR menggunakan sepasang primer spesifik RGSV yaitu primer forward F3 (5‟-AGACCAACTCAG AGGCA-3‟) dan primer revers B3 (5‟-TCTAGAGCAGTTTCCTGTAGTC-3‟) (Le et al. 2010). Sebanyak 0.4 pmol masing-masing primer, 1x DreamTaqTM DNA Polymerase (Fermentas, USA), dan 1 µl cDNA hasil transkripsi balik dalam volum akhir 25 µl digunakan dalam amplifikasi. Amplifikasi dilakukan pada T-Gradient® ThermoBlock (Biometra, Germany) dengan masa denaturasi selama 1 menit pada suhu 94 oC, penempelan primer selama 1 menit pada suhu 53 oC, sintesis selama 1 menit pada suhu 72 oC dan diulang sebanyak 34 kali. Hasil PCR diamati dengan cara yang sama pada amplifikasi gen protein selubung RTBV.
Analisis Keragaman Genetik RTBV dan RGSV
Perunutan dan penyejajaran basa DNA RTBV dan RNA RGSV.
Perunutanbasa nukleotida dilakukan terhadap fragmen DNA gen protein selubung RTBV dan RGSV dari hasil amplifikasi berturut-turut adalah sebanyak 10 dari 13 isolat dan 20 dari 36 isolat. Perunutan basa nukleotida gen protein selubung
RTBV dan RGSV dilakukan dengan memanfaatkan layanan berturut-turut pada Automatic DNA Sequencing 1st-BASE Laboratories Singapura dan DNA SequencingBioSM Laboratories Malaysia.
Elektroferogram yang didapatkan dilihat menggunakan program Sequence Scanner v1.0 (Applied Biosystems, USA). Hasil perunutan nukleotida yang diperoleh kemudian dikonfirmasi ke GenBank dengan program Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) pada The National Centre for Biotechnological Information (NCBI). Runutan nukleotida yang telah dikonfirmasi kemudian disejajarkan dengan menggunakan penyejajaran berganda ClustalW pada program Bioedit (Hall 1999).
Analisis keragaman. Analisis keragaman runutan nukleotida dari gen protein selubung isolat-isolat RTBV dan RGSV menggunakan beberapa perangkat lunak diantaranya Bioedit (Hall 1999), CLC Sequence Viewer 6.7 dan MEGA 5.05. Menggunakan perangkat lunak yang sama dilakukan pula analisis filogenetika. Rujukan runutan nukleotida isolat RTBV dan RGSV dari luar Indonesia yang digunakan didapatkan dari GenBank.