Gejala Infeksi Virus pada Tanaman Padi di Lapangan
Hasil pengamatan gejala di lapangan dari sampel-sampel tanaman padi sakit yang diambil dari lapangan menunjukkan gejala terinfeksi virus tungro. Gejala umum yang diamati pada setiap sampel tanaman yang diambil antara lain perubahan warna daun, tinggi tanaman dan jumlah anakan (Lampiran 4). Variasi gejala dijumpai pada sampel-sampel tersebut. Variasi gejala dapat dibedakan menjadi dua kelompok berdasarkan jumlah anakan dan tinggi tanaman. Gejala kelompok pertama yaitu daun tanaman berwarna kuning sampai oranye, tanaman kerdil dan jumlah anakan sedikit (Gambar 8). Gejala kelompok kedua yaitu daun tanaman kaku berwarna kuning-oranye, tinggi tanaman normal dan jumlah anakan normal seperti tanaman sehat (Gambar 9).
Gambar 8 Variasi gejala kelompok pertama pada tanaman padi dari beberapa
daerah. A) Sumber Salak Barat (Jember); B) Gunung Bunder (Bogor); C) Ngawen (Sleman).
Gambar 9 Variasi gejala kelompok kedua pada tanaman padi dari beberapa daerah. A) Sumber Kejayan (Jember); B) Cikarawang (Bogor); C) Ciherang (Bogor) (tanaman pada stadia singgang).
Gejala yang ditunjukkan tanaman sampel pada variasi gejala kelompok pertama (Gambar 8) mengindikasikan tanaman padi terinfeksi virus tungro. Dasgupta et al. (1991) dan Hibino et al. (1978) menyebutkan bahwa gejala utama tanaman padi terinfeksi virus tungro adalah perubahan warna daun menjadi kuning sampai kuning-oranye, kerdil dan penurunan jumlah anakan. Pada variasi gejala kelompok pertama ini dijumpai variasi tingkat perubahan warna daun pada varietas tanaman padi yang berbeda. Padi varietas Ciherang (sampel 8A) menunjukkan perubahan warna menjadi kuning pada daun, sedangkan padi varietas IR64 (sampel 8B) dan Inpari (Sampel 8C) menunjukkan perubahan warna menjadi kuning- oranye. Suprihanto (2005) melaporkan adanya variasi gejala penyakit yang disebabkan infeksi virus tungro pada kultivar TN dan FK135. Pada tanaman padi TN1 terjadi perubahan warna daun dari kuning hingga oranye sedangkan pada tanaman padi FK135 menunjukkan adanya gejala garis dengan warna kuning hingga oranye pada daun. Su (1969) juga melaporkan adanya keragaman gejala tanaman padi yang terinfeksi virus menguning pada beberapa varietas yang berbeda. Srinivasulu dan Jeyarajan (1990) dalam Suprihanto (2005) menyebutkan bahwa adanya perbedaan warna kuning oranye pada daun terinfeksi virus adalah karena perbedaan kandungan pigmen hijau (klorofil), pigmen oranye (karoten) dan pigmen kuning (santofil) yang berbeda pada tingkat patogenisitas yang berbeda yang dapat dipengaruhi oleh virus yang berbeda maupun strain yang berbeda. Variasi gejala pada kelompok kedua (Gambar 9) mirip dengan gejala infeksi tungro yaitu perubahan warna daun menjadi kuning sampai oranye disertai penurunan jumlah anakan tetapi tanaman tidak kerdil.
Variasi gejala dapat disebabkan oleh perbedaan varietas tanaman, strain atau jenis virus dan umur tanaman saat terinfeksi. Ling (1972) melaporkan tentang perbedaan atau variasi gejala pada tanaman padi yang disebabkan oleh infeksi virus yang sama. Dilaporkan juga bahwa gejala yang sama dapat muncul karena infeksi virus yang berbeda. Oleh karena itu, variasi gejala pada tanaman padi dapat disebabkan oleh infeksi beberapa virus yang berbeda diantaranya virus tungro atau RGSV. Kemungkinan ini diperkuat oleh laporan Suprihanto (2008) bahwa terdapat variasi gejala daun menguning seperti gejala infeksi virus tungro tetapi disebabkan oleh RGSV.
Gejala yang ditunjukkan tanaman terinfeksi virus tungro sebenarnya sangat berbeda dengan tanaman terinfeksi RGSV. Gejala utama tanaman padi terinfeksi virus tungro adalah kerdil, perubahan warna daun menjadi kuning sampai oranye dan jumlah anakan yang sedikit (Dasgupta et al. 1991). Gejala utama tanaman
padi terinfeksi RGSV adalah kerdil, daun sempit, perubahan warna daun dari hijau pucat hingga kuning pucat dan jumlah anakan yang banyak (BBP2TP 2010). Tetapi, variasi gejala tanaman terinfeksi RGSV juga telah dilaporkan oleh Hibino (1996) yaitu perubahan warna daun menjadi kuning hingga oranye yang dilaporkan di Taiwan pada tahun 1977, di Filipina dan Thailand pada tahun 1982-1983 dan di India pada tahun 1984. Untuk memastikan apakah variasi gejala pada tanaman- tanaman sampel dari beberapa kabupaten di Pulau Jawa terinfeksi RTBV atau RGSV diperlukan deteksi secara molekuler.
Deteksi RTBV dan RGSV
Primer DA-F dan DA-R berhasil mengamplifikasi seluruh gen protein selubung RTBV dengan amplikon sebesar 1224 bp (Gambar 10). Amplifikasi gen protein selubung RTBV menggunakan pasangan primer lain yaitu RTBV-2L
(5‟-GGTCTTGGATGGATGGTAGA-3‟) dan RTBV-2R (5‟-GCTGAGGTGCTAC ATAGGTT-3‟) pernah dilakukan oleh Suprihanto (2005) dan Hikmahayati (2010). Primer tersebut tidak digunakan pada penelitian ini karena primer tersebut dirancang untuk mengamplifikasi sebagian gen protein selubung dan sebagian gen protease aspartat RTBV (Venkintesh et al. 1994).
Gambar 10 Hasil amplifikasi gen protein selubung RTBV menggunakan sepasang primer DA-F dan DA-R. M, Marker 200 bp ladder (Fermentas, USA); 1, Air; 2 sampai 11 berturut-turut, Isolat dari daerah Sumber Salak Timur, Sumber Salak Barat, Sembung, Cijambe, Tanjung Siang, Situ Gede, Cikarawang, Muara, Patok Besi dan Pamijahan
Sebagian gen protein selubung RGSV sebesar 243 bp berhasil diamplifikasi (Gambar 11). Amplifikasi sebagian gen tersebut menggunakan Primer F3 dan B3 RGSV (Le et al.2010). Primer ini mengamplifikasi bagian paling „conserved‟ dari gen selubung protein RGSV (Le et al. 2010; Miranda et al. 2000).
Gambar 11 Hasil amplifikasi sebagian gen protein selubung RGSV menggunakan sepasang primer F3 dan B3. M, Marker 200 bp ladder (Fermentas USA); 1, Air, 2 sampai 9 berturut-turut, Isolat dari daerah Blanakan, Patok Besi, Ngawen, Pamijahan, Songgon, Balak, Sragi dan Muruy.
Hasil kedua deteksi tersebut menunjukkan bahwa gejala mirip terinfeksi virus tungro ternyata positif terinfeksi RGSV. Hasil deteksi membuktikan bahwa pengamatan gejala di lapangan tidak dapat digunakan untuk membedakan tanaman tersebut terinfeksi RTBV atau RGSV. Kemiripan gejala pada tanaman padi seringkali disebabkan oleh virus yang berbeda atau infeksi bersama beberapa virus. Fakta ini membuat pengamatan gejala saja tidak cukup untuk mendiagnosis penyakit yang disebabkan oleh virus pada padi (Le et al. 2010). Deteksi sangat perlu terutama bila tanaman menunjukkan gejala yang sama. Gejala kelompok pertama dapat disebabkan oleh infeksi RTBV (sampel dari Sumber Salak Barat) atau RGSV (sampel dari Gunung Bunder dan Ngawen). Demikian pula, gejala kelompok kedua dapat disebabkan oleh infeksi RGSV (sampel dari Sumber Kejayan) atau infeksi bersama RTBV dan RGSV (sampel dari Cikarawang dan Ciherang).
Hasil deteksi pada tanaman stadia singgang yang diambil dari daerah Ciherang (Gambar 9 C) menunjukkan positif terinfeksi RTBV dan RGSV. Warna daun kuning-oranye yang sangat mencolok pada singgang tersebut diduga karena infeksi ganda oleh RTBV dan RGSV dan konsentrasi virus-virus tersebut yang tinggi. Dilaporkan oleh Hibino (1996) bahwa konsentrasi virus- virus pada padi yaitu Rice bunchy stunt virus (RBSV) dan Rice gall dwarf virus (RGDV) pada tanaman singgang tergolong tinggi. Kedua virus ini ditularkan oleh wereng sebagai vektor seperti halnya RTBV dan RGSV. Oleh karena itu, peran tanaman singgang sebagai sumber inokulum virus perlu diperhatikan untuk menghindari penularan virus yang lebih luas (BB Padi 2010).
Hasil amplifikasi menunjukkan bahwa infeksi RTBV tidak ditemukan di setiap kabupaten di tempat sampel diambil (Tabel 2). Infeksi RTBV paling banyak ditemukan di Kabupaten Bogor. Bogor dilaporkan sebagai daerah endemis virus tungro (Agustina 2007), dan varietas padi yang ditanam juga menentukan tingkat infeksi. Varietas padi yang ditanam petani di Bogor terutama adalah Ciherang dan IR 64 yang tidak tahan terhadap virus tungro (BB Padi 2012). Infeksi RTBV tidak ditemukan di Kabupaten Sleman kemungkinan karena varietas padi yang ditanam sebagian besar adalah Situ Bagendit yang dilaporkan tahan terhadap virus tungro (BB Padi 2012).
Tabel 2 Hasil deteksi RTBV dan RGSV dari beberapa sampel yang berasal dari 8 kabupaten di Jawa berdasarkan amplifikasi gen protein selubung
Kabupaten RTBV RGSV RTBV dan RGSV Bogor 6 3 2 Pandeglang 0 7 0 Subang 2 3 0 Batang 1 5 0 Klaten 0 1 0 Sleman 0 8 0 Jember 3 3 0 Banyuwangi 1 6 0 Total 13 36 2
Kondisi yang berbeda terjadi di Kabupaten Pandeglang dan Klaten. Hasil deteksi RTBV negatif di kedua daerah tersebut walaupun di kedua daerah tersebut ditanam varietas Ciherang yang dilaporkan tidak tahan terhadap virus tungro (BB Padi 2012). Walaupun tidak terdeteksi infeksi RTBV, tanaman padi di Kabupaten Pandeglang positif terinfeksi RGSV. Berbeda dengan kondisi di Kabupaten Klaten yaitu tidak terdeteksi infeksi RTBV dan hanya 1 dari 8 sampel terdeteksi infeksi RGSV. Gejala yang muncul kemungkinan dapat disebabkan karena kekurangan unsur hara abiotik seperti Nitrogen dan bukan karena infeksi virus. Dilaporkan oleh Dahal et al. (1992) bahwa tanaman padi yang kekurangan unsur hara Nitrogen dapat menunjukkan gejala seperti gejala tanaman terinfeksi virus tungro.
Hasil amplifikasi juga menunjukkan bahwa 56.25% (36 sampel dari total 64 sampel tanaman) sampel-sampel tanaman padi terinfeksi RGSV (Tabel 2). Sampai bulan April 2012, data mengenai luas serangan akibat infeksi RGSV belum ditemukan pada semua kabupaten tersebut. Data yang terangkum lebih kepada luas tambah serang akibat wereng batang coklat sebagai vektor RGSV. Data luas serangan akibat infeksi RGSV hanya didapatkan dari Kabupaten Klaten, Batang, Jember dan Banyuwangi. Melalui komunikasi dengan penyuluh setempat, data tersebut hanyalah didasarkan pada gejala yang dilihat dan belum berdasarkan deteksi molekuler atau deteksi lainnya yang memastikan gejala tersebut akibat infeksi RGSV.
Berdasarkan data luas tambah serang infeksi virus kerdil rumput di 4 kabupaten tersebut di atas dan dari komunikasi pribadi dengan penyuluh
setempat, dapat disimpulkan bahwa infeksi virus kerdil rumput meningkat seiring meningkatnya populasi serangga vektor wereng batang coklat. Dilaporkan oleh Baehaki (2011) bahwa infeksi virus kerdil rumput meningkat bersamaan dengan terjadinya ledakan serangan wereng batang coklat pada tahun 2010. Ledakan wereng batang coklat ini dapat disebabkan beberapa faktor yaitu antara lain faktor lingkungan dan aktifitas manusia. Faktor lingkungan yang dapat diamati pada saat penulis mengambil sampel di lapangan dan dari komunikasi dengan penyuluh setempat adalah curah hujan yang cukup tinggi. Curah hujan yang cukup tinggi ini menyebabkan meningkatnya populasi wereng batang coklat. Susanti et al. (2009) melaporkan bahwa curah hujan yang tinggi menyebabkan kelembaban udara meningkat sehingga menyebabkan populasi wereng batang coklat juga meningkat.
Aktifitas manusia terutama menentukan pola bercocok tanam dapat mempengaruhi kondisi organisme pengganggu tanaman. Informasi bahwa masyarakat belum menerapkan pola tanam serempak didapatkan oleh penulis pada waktu pengambilan sampel yaitu melalui komunikasi dengan penyuluh setempat dan petani. Pola tanam yang tidak serempak menyebabkan usia tanaman pada satu hamparan akan berbeda-beda dan ini membuat ketersediaan makanan tak pernah habis bagi serangga penular penyakit. Dilaporkan oleh Baehaki (2011) bahwa pola tanam tidak serempak akan memicu meluasnya penyakit kerdil rumput yang disebabkan infeksi RGSV dengan wereng batang coklat sebagai vektornya. Berdasarkan informasi dari petugas penyuluh diketahui bahwa pola tanam tidak serempak disebabkan antara lain karena ketersediaan air yang cukup (dengan pengairan yang baik) sepanjang musim. Dilaporkan pula oleh Baehaki (2010) bahwa kelimpahan air akan menyebabkan perkembangan wereng batang coklat semakin cepat.
Hasil deteksi menunjukkan bahwa terdapat dua sampel terinfeksi bersama- sama RTBV dan RGSV yaitu sampel dari Kabupaten Bogor (Cikarawang dan Ciherang). Infeksi bersama ini dapat terjadi karena adanya sumber inokulum kedua virus tersebut disertai keberadaan wereng hijau dan wereng batang coklat bersama- sama sebagai vektor dari RTBV dan RGSV. Dilaporkan oleh Ling et al. (1978) bahwa infeksi dua virus yaitu RGSV dan Rice Ragged Stunt Virus (RRSV) dapat terjadi dalam satu tanaman padi di lapangan.
Infeksi RTBV di Bogor telah dilaporkan oleh peneliti-peneliti sebelumnya seperti Suprihanto (2005), Arfianis (2006), dan Hikmahayati (2010), tetapi infeksi RGSV di Bogor belum pernah dilaporkan sebelumnya. Dengan demikian hasil penelitian ini melaporkan ditemukannya infeksi RGSV di daerah endemis virus tungro di Bogor.
Tingkat Kesamaan Runutan Basa Nukleotida dan Asam Amino Gen Protein Selubung RTBV
Panjang gen protein selubung RTBV adalah 945 bp (Ganesan et al. 2009) tetapi pada penelitian ini hanya berhasil mendapatkan perunutan gen protein selubung dengan panjang berkisar antara 597 hingga 1208 bp (Tabel 3 dan Lampiran 5). Runutan nukleotida gen protein selubung isolat-isolat RTBV dari Jawa (setelah disejajarkan terhadap isolat-isolat RTBV dari luar Indonesia) terletak antara nukleotida ke-2333 sampai 3572 pada runutan nukleotida genom RTBV. Isolat-isolat RTBV luar Indonesia yang digunakan sebagai referensi diambil dari GenBank (Tabel 4). Perunutan dan penyejajaran basa nukleotida dilakukan untuk memastikan bahwa runutan tersebut adalah runutan gen selubung protein RTBV yang berada pada ORF 3 dari genom RTBV (Nath et al. 2002) yang dimulai dari nukleotida ke-2427 sampai 3372 (Ganesan et al. 2009).
Hasil analisis kesamaan runutan basa nukleotida gen protein selubung dari 10 isolat RTBV memiliki tingkat kesamaan berkisar 40% sampai 100% (Lampiran 6). Tingkat kesamaan dengan rentang yang jauh antara isolat-isolat RTBV tersebut memberikan indikasi bahwa isolat-isolat RTBV dari Jawa memiliki variasi genetik yang tinggi.
Tabel 3 Posisi dan panjang runutan gen protein selubung isolat-isolat RTBV dari 8 kabupaten di Jawa
No. Kabupaten Isolat RTBV Posisi Nukleotida Pada Genom RTBV
Panjang Runutan (bp)*
1 Subang Cijambe 2400 – 3549 1149
2 Subang Tanjung Siang 2366 – 3541 1175
3 Bogor Gunung Bunder 2918 - 3515 597
4 Bogor Situ Gede 2359 - 3572 1213 5 Bogor Cikarawang 2333 – 3541 1208 6 Bogor Pamijahan 2379 – 3538 1159 7 Batang Sembung 2377 – 3509 1132 8 Jember Sumber Salak Barat 2375 – 3535 1160 9 Jember Garahan Timur 2918 - 3515 597 10 Banyuwangi Sumber Kencono 2417 – 3546 1129
11 Bogor Muara a) a)
12 Bogor Ciherang a) a)
13 Jember Sumber Salak Timur a) a)
Keterangan: * Hasil perunutan dan penyejajaran asam amino gen protein selubung RTBV disajikan pada Lampiran 7.
a)
Tidak dilakukan perunutan basa nukleotida karena sampel nomor 1 sampai 10 telah cukup mewakili setiap kabupaten.
Tabel 4 Isolat-isolat yang tersedia pada GenBank yang digunakan sebagai referensi perbandingan analisis gen protein selubung RTBV
Hampir semua gen protein selubung RTBV (asam amino ke-476 hingga 791) menunjukkan runutan asam amino yang terpelihara (conserved). Peraza et al. (2005) menunjukkan bahwa daerah C-terminal dari gen protein selubung RTBV adalah daerah yang terpelihara (asam amino nomor 745-771) dan ditemui sebagai penanda gen protein selubung pada semua protein pararetroviral tanaman lainnya (Rothnie et al. 1994). Mutasi ditemukan di daerah terpelihara ini pada isolat RTBV dari Tanjung Siang yaitu penghapusan (deletion) asam amino N (756) dan asam amino R (761). Kano et al. (1992) menyebutkan bahwa terdapat daerah terpelihara yang identik pada gen protein selubung yang dimiliki oleh semua virus dari famili Caulimoviridae. Nath et al. (2002) menyebutkan daerah ini sebagai
“cys” motif dengan runutan CX2CX4HX4C dan pada penelitian ini ditemui pada
asam amino ke-777 sampai 790 (CYICQDENHLANRC). Pada penelitian ini hampir semua daerah tersebut terpelihara kecuali runutan pada isolat RTBV dari Tanjung Siang yang mengalami penghapusan 4 asam amino (runutan ke 780, 782,
No. Aksesi Isolat Negara
AF076470.1 Serdang Malaysia
AF220561.1 Chainat Thailand
AF113831.1 G2 Philippina
AF113832.1 Ic Philippina
D10774.1 Tsukuba Jepang
784 dan 788) dan dari Garahan Timur yang mengalami penghapusan 1 asam amino (runutan ke 785).
Hasil analisis kesamaan runutan basa nukleotida gen protein selubung dari 10 isolat RTBV memiliki tingkat kesamaan berkisar 40% sampai 100% (Lampiran 6), sedangkan analisis kesamaan runutan asam amino gen protein selubung tersebut berkisar 88% sampai 100% (Lampiran 8). Hasil analisis tersebut memberikan indikasi bahwa keragaman genetik isolat-isolat RTBV hanya tinggi pada tingkat runutan basa nukleotidanya. Zao et al. (2003) dengan kriterianya melaporkan bahwa isolat-isolat virus yang memiliki tingkat kesamaan yang tinggi yaitu lebih besar atau sama dengan 90% dapat dinyatakan sebagai isolat-isolat virus yang identik. Hasil menunjukkan bahwa isolat-isolat RTBV dari Jawa identik satu sama lain berdasarkan runutan asam amino. Hasil juga menunjukkan bahwa keragaman yang tinggi pada runutan basa nukleotida isolat-isolat RTBV disandikan menjadi asam amino yang sama.
Tingkat Kesamaan Runutan Basa Nukleotida dan Asam Amino Gen Protein Selubung RGSV
Panjang gen protein selubung RGSV adalah 978 bp (Toriyama et al. 1997). Panjang sebagian gen protein selubung RGSV yang berhasil dirunut dan disejajarkan pada penelitian ini adalah berkisar antara 233 hingga 271 bp (Tabel 5 dan Lampiran 9). Runutan nukleotida sebagian gen protein selubung isolat-isolat RGSV dari Jawa (setelah disejajarkan terhadap isolat-isolat RGSV dari luar Indonesia) terletak antara nukleotida ke-587 sampai 853 pada runutan nukleotida RNA 5 genom RGSV. Perunutan dan penyejajaran basa nukleotida ini dilakukan untuk memastikan bahwa runutan tersebut adalah runutan sebagian gen selubung protein RGSV yang berada pada RNA 5 dari genom RGSV (Toriyama et al. 1997). Isolat-isolat RGSV luar Indonesia yang digunakan sebagai referensi diambil dari GenBank (Tabel 6). Hasil analisis kesamaan runutan basa nukleotida sebagian gen protein selubung RGSV dari 20 isolat memiliki tingkat kesamaan gen protein selubung berkisar 30% sampai 98% (Lampiran 10).
Perunutan dan penyejajaran asam amino juga dilakukan untuk memastikan bahwa runutan tersebut adalah runutan sebagian gen protein selubung RGSV (Lampiran 11). Hasil analisis kesamaan runutan asam amino gen protein selubung dari 20 isolat RGSV memiliki tingkat kesamaan berkisar 20% sampai 100% (Lampiran 12). Tingkat kesamaan runutan basa nukleotida dan asam amino dengan rentang yang jauh antara isolat-isolat RGSV tersebut memberikan indikasi bahwa isolat-isolat RGSV dari Jawa memiliki variasi genetik yang tinggi.
Dua puluh (20) isolat RGSV dari Jawa memiliki keragaman genetik yang tinggi baik pada tingkat basa nukleotida maupun asam amino gen protein selubung. Fakta ini memberikan indikasi bahwa perbedaan runutan basa nukleotida menyebabkan perbedaan asam amino.
Tabel 5 Posisi dan panjang runutan gen protein selubung isolat-isolat RGSV dari 8 kabupaten di Jawa No Kabupaten Isolat RGSV Posisi Nukleotida Pada RNA 5 Genom RGSV Panjang Runutan (bp)*
1 Subang Patok Besi 597 – 839 242
2 Subang Ciasem 601 – 848 247
3 Pandeglang Sukamanah 591 – 829 238
4 Pandeglang Sampang Bitung 597 – 846 249
5 Pandeglang Cimanuk 591 – 832 241
6 Bogor Cikarawang 597 – 835 228
7 Bogor Ciherang 592 – 833 241
8 Bogor Ciampea 597 – 832 235
9 Klaten Joton 1 589 – 835 246
10 Batang Sido Mulyo 597 – 828 231 11 Batang Kali Salak Timur 589 – 827 238
12 Batang Boja 591 – 850 259
13 Sleman Mandungan 591 – 834 242
14 Sleman Ngawen 587 – 848 261
15 Sleman Jetis Timur 592 – 853 261 16 Jember Sumber Kejayan 597 – 828 231 17 Jember Sumber Bulus Barat 598 – 833 235 18 Banyuwangi Songgon 591 – 832 241 19 Banyuwangi Balak 593 – 848 255 20 Banyuwangi Sragi 592 – 846 254 21 Subang Pabuaran a) a) 22 Pandeglang Cening a) a) 23 Pandeglang Munjul a) a) 24 Pandeglang Panarayan a) a) 25 Pandeglang Kuronji a) a)
26 Batang Harjowi Barat a) a)
27 Batang Kali Salak Selatan a) a)
28 Sleman Jetak 2 Barat a) a)
29 Sleman Prenggan a) a)
30 Sleman Semarangan a) a)
31 Sleman Jetak 2 Utara a) a)
32 Sleman Jetis Barat a) a)
33 Jember Sumber Bulus Utara a) a)
Keterangan: * Hasil perunutan dan penyejajaran asam amino gen protein selubung RGSV disajikan pada Lampiran 11.
a)
Tidak dilakukan perunutan basa nukleotida karena sampel nomor 21 sampai 33 telah cukup mewakili setiap kabupaten.
Tabel 6 Isolat-isolat yang tersedia pada GenBank yang digunakan sebagai referensi perbandingan analisis CP-RGSV
Filogenetika Berdasarkan Runutan Basa Nukleotida Gen Protein Selubung RTBV
Pohon filogenetika berdasarkan runutan basa nukleotida gen protein selubung RTBV menunjukkan adanya 3 kelompok kekerabatan dari isolat-isolat RTBV dari Jawa (Gambar 12). Kelompok pertama terbagi menjadi 3 sub kelompok. Sub kelompok pertama dari kelompok pertama terdiri dari 7 isolat RTBV yaitu isolat-isolat dari daerah Cikarawang, Pamijahan, Gunung Bunder, Garahan Timur, Cijambe, Sembung dan Tanjung Siang. Sub kelompok kedua terdiri dari 4 isolat RTBV dari luar Indonesia yaitu isolat-isolat Chainat, IC, G2 dan Tsukuba. Sub kelompok ketiga hanya terdiri dari isolat RTBV dari Sumber Salak Barat. Kelompok kedua hanya terdiri dari isolat RTBV dari luar Indonesia yaitu isolat Serdang dan kelompok ketiga terdiri dari isolat-isolat RTBV dari Sumber Kencono dan Situ Gede.
Kelompok pertama dan kedua memiliki tingkat kekerabatan yang dekat dengan koefisien jarak genetik sebesar 0.04. Kedua kelompok tersebut memiliki kekerabatan yang jauh dengan kelompok ketiga dengan koefisien jarak genetik sebesar 0.80. Semakin tinggi koefisien jarak genetik menunjukkan perbedaan runutan nukleotida pada gen protein selubung yang semakin tinggi. Dilaporkan oleh Wei et al. (2009) bahwa jarak genetik adalah rerata dari jumlah perubahan basa nukleotida antara runutan basa nukleotida dua gen.
Berdasarkan jarak genetik tersebut maka isolat-isolat RTBV dari Jawa berbeda dengan semua strain dari luar Indonesia. Hal ini sebelumnya dilaporkan oleh Suprihanto (2005) yang menggunakan analisis RFLP in-siliko dengan program Primer Premier 5 (Premier Biosoft International), yaitu bahwa semua isolat RTBV dari daerah endemik tungro di Indonesia berbeda dengan semua isolat RTBV dari Filipina.
No. Aksesi Isolat Negara
FR696603.1 Cantho Vietnam
FR696600.1 LongAn Vietnam
FR696602.1 Baclieu Vietnam
AB023779.1 Philippina Philippina
AF290947.1 China China
AAG01865.1 CP China China
ABU53648.1 CP Hanoy Vietnam
NP_158536.1 CP Jepang Jepang
Gambar 12 Pohon filogenetika yang menggambarkan hubungan kekerabatan gen protein selubung isolat-isolat RTBV dari Jawa dengan isolat-isolat RTBV yang tersedia pada GenBank dengan analisis UPGMA menggunakan program CLC Sequence Viewer 6.7 dan MEGA 5.05. Skala di bawah gambar adalah skala nilai koefisien jarak genetik yang menggambarkan jumlah rata-rata perubahan nukleotida diantara isolat. Isolat-isolat yang dicetak dengan tinta merah adalah isolat- isolat RTBV dari Jawa
Isolat-isolat RTBV dari Jawa yang terbagi dalam beberapa kelompok dapat menunjukkan tingkat keragaman gen protein selubung RTBV isolat-isolat Jawa. Tingkat keragaman tersebut terletak pada banyak atau sedikitnya perbedaan antara dua strain dan perbedaan tersebut dapat disebabkan salah satunya oleh mutasi. Dilaporkan oleh Mangrauthia et al. (2012) bahwa jarak genetik dapat menggambarkan banyak sedikitnya perbedaan antara dua strain virus dan mutasi dapat dikatakan bertanggungjawab akan perubahan-perubahan tersebut. Tersebarnya isolat-isolat RTBV dari Jawa pada beberapa kelompok menunjukkan bahwa keragaman isolat-isolat Jawa ini tidak spesifik lokasi.
Filogenetika Berdasarkan Runutan Basa Nukleotida Gen Protein Selubung RGSV
Pohon filogenetika berdasarkan runutan basa nukleotida gen protein selubung RGSV menunjukkan adanya 4 kelompok kekerabatan isolat-isolat RGSV dari Jawa (Gambar 13). Kelompok pertama terbagi menjadi 2 sub kelompok. Sub kelompok pertama terdiri dari 6 isolat RGSV dari Jawa yaitu isolat-isolat dari daerah Cimanuk, Joton 1, Boja, Songgon, Mandungan, dan Jetis. Sub kelompok kedua hanya terdiri dari isolat RGSV dari Ciherang. Kelompok kedua hanya terdiri dari isolat RGSV dari Ciampea. Lima isolat RGSV dari luar Indonesia yang digunakan sebagai referensi yaitu isolat-isolat dari Cantho, LongAn, Baclieu, Filipina dan