Waktu dan Tempat
Penelitian ini dimulai pada bulan Juni 2009 hingga Juni 2010 bertempat di Kandang Unit Hewan Laboratorium dan Laboratorium Histopatologi, Bagian Patologi, Departemen Klinik, Reproduksi, dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
Hewan percobaan
Hewan percobaan yang digunakan adalah mencit betina usia 2 bulan sebanyak 30 ekor dengan bobot badan 20-25 gram yang diinduksi hiperglikemik dan dikelompokkan menjadi 3 kelompok dengan perlakuan yang berbeda. Kelompok pertama yaitu kontrol negatif, kelompok kedua yaitu kontrol positif menggunakan sediaan komersil dengan kandungan aktif campuran ekstrak plasenta 0,5%, neomycin sulfat 5% dan jelly base. Kelompok ketiga yaitu kelompok mencit yang diberi salep fraksi etil asetat rimpang kunyit.
Pelarut dan Bahan Lainnya
Bahan yang digunakan sebagai pelarut dalam penelitian ini adalah etanol, hexan, air, dan etil asetat. Sedangkan bahan dasar salep yang digunakan dalam pembuatan salep adalah vaselin.
Alat
Alat yang digunakan adalah kandang mencit, alat bedah, tissue processor, mikrotom, gelas objek, gelas penutup, mikroskop cahaya, dan mikroskop videomikrometer.
Metodologi
Pembuatan Salep Ekstrak Etil Asetat Kunyit
Salep merupakan sediaan setengah padat, mudah dioleskan dan digunakan sebagai obat luar pada membran mukosa atau kulit (Wientarsih dan Prasetyo 2006). Pembuatan salep ekstrak etil asetat kunyit dimulai dengan ekstrak etil asetat kunyit kental yang telah dihasilkan kemudian ditimbang dan dihomogenisasi dengan vaselin kuning menggunakan mortar. Homogenisasi dilakukan hingga merata dan tidak terasa lagi butiran serbuk kunyit. Setelah itu disimpan dalam tabung dan diberi label.
Perlakuan Pada Mencit
Seluruh mencit ini diinduksi hiperglikemia dengan menggunakan streptozotocin (STZ). Aplikasi STZ dilakukan secara intraperitonial dengan dosis 40 mg/kgBB (Hussain 2002; Srinivanan et al 2003). Kemudian ditunggu selama 1-2 minggu hingga kadar gula darah meningkat hingga 200 mg/dl.
Tiga puluh ekor hewan coba mencit dibagi menjadi 3 kelompok dengan perlakuan yang berbeda, dibutuhkan sebanyak 10 mencit setiap perlakuan dengan kandang yang bersekat yang diisi dengan 3 ekor mencit dalam setiap kandangnya (Gambar 10).
Setiap mencit terlebih dahulu dicukur pada bagian punggungnya kemudian dilukai dengan cara disayat dengan scalpel sepanjang 1,5 cm dan sampai sub kutis. Selama masa pemeliharaan mencit diberi obat secara topikal pada luka sesuai dengan perlakuannya dengan menggunakan cutton buds. Tiap kelompok perlakuan, mencit diambil sampel kulit pada hari ke 2, 4, 7, 14, dan 21 pasca perlukaan sebanyak 2 ekor tiap perlakuan. Pengambilan sampel kulit dilakukan dengan mengambil bagian yang luka pada kulit punggung mencit yang sebelumnya telah dieuthanasi dengan menggunakan eter dosis berlebih secara perinhalasi. Kulit yang telah diambil difiksasi dengan larutan BNF (Buffer Neutral Formaline) 10% selama 48 jam.
Pengamatan Patologi Anatomi
Pengamatan patologi anatomi dilakukan terhadap semua mencit pada setiap perlakuan dengan metode deskriptif. Kondisi luka diamati setiap hari dengan memperhatikan parameter perbandingan, yaitu panjang luka, kering luka, warna luka, dan keropeng luka.
Pembuatan Sediaan Haematoxillin-Eosin
Sediaan sampel kulit yang telah difiksasi dengan larutan BNF 10% selama ± 48 jam ditipiskan (trimming) dengan cara dipotong kecil pada daerah tengah luka. Setelah itu potongan dimasukkan ke dalam kaset. Kemudian sediaan kulit didehidrasi menggunakan tissue processor dengan dimasukannya berturut-turut ke dalam alkohol 70%, alkohol 80%, alkohol 90%, alkohol 95% I, alkohol 95% II, alkohol 100% I, dan alkohol 100% II masing-masing selama 2 jam. Setelah itu dilakukan penjernihan (clearing) sediaan kulit dengan dimasukkan ke dalam xylol dengan 2 kali penggantian masing-masing selama 2 jam. Setelah dilakukan penjernihan, lalu dilanjutkan dengan proses pencetakkan (embedding). Sediaan kulit dimasukkan ke dalam alat pencetak dan dibiarkan sampai parafin mengeras. Kemudian setelah mengeras parafin dikeluarkan dari cetakan dan disimpan dalam lemari pendingin sebelum dilakukan pemotongan.
Proses pemotongan dilakukan dengan menggunakan mikrotom dengan tebal irisan ± 5 µm. irisan diletakan di atas air hangat dengan temperature ± 460C
untuk memperbaiki potongan jaringan yang keriput. Irisan yang diletakkan di atas permukaan air hangat tersebut diangkat menggunakan gelas objek dengan posisi irisan diatas gelas objek. Preparat kemudian dikeringkan dan diberi tanda dengan alat grafir dan disimpan dalam inkubator bertemperatur 600C minimal 2 jam. Setelah itu dilanjutkan dengan proses pewarnaan.
Proses pewarnaan ini dimulai dengan melarutkan sisa parafin dengan dimasukkan ke dalam xylol. Kemudian sediaan direhidrasi dengan cara dimasukkan ke dalam alkohol bertingkat dimulai dari alkohol 100% sampai alkohol 80%. Setelah itu preparat dicuci dengan air selama 1 menit lalu dimasukkan kedalam larutan Haemtoxylin selama 8 menit dan dicuci kembali dengan air selama 30 detik. Selanjutnya sediaan dimasukkan ke dalam larutan lithium carbonat selama 15-30 detik dan dicuci dengan air. Setelah sediaan dicuci dengan air, selanjutnya sediaan dimasukkan kedalam larutan Eosin selama 2-3 menit dan dibilas dengan air selama 30-60 detik. Kemudian sediaan didehidrasi dengan alkohol bertingkat mulai dari alkohol 95% sebanyak 10 celupan, alkohol 100% I sebanyak 10 celupan dan alkohol 100% II selama 2 menit. Setelah itu sediaan dimasukkan ke dalam larutan xylol I selama 1 menit dan xylol II selama 2 menit. Selanjutnya sediaan dikeringkan diberi mounting media dan ditutup dengan
cover glass.
Pembuatan Sediaan Masson-Trichome (MT)
Pembuatan sediaan Masson-Trichome dimulai dengan deparafinasi dan rehidrasi sediaan juga pencucian sediaan dengan air dan aquades. Setelah itu, sediaan dimasukkan ke dalam larutan Mordant slama 30-40 menit.dan dicuci dengan aquades. Selanjutnya sediaan dimasukkan ke dalam larutan Carrazi’s Haematoxylin selama 40 menit dan dibilas dengan aquades. Kemudiaan sediaan dimasukkan kedalam larutan Orange G 0.75% selam1-2 menit dan dicuci dengan asam asetat 1% sebanyak 2 kali, setelah itu sediaan dimasukkan ke dalam larutan Ponceau Xylidine Fuchsin selama 15 menit dan dibilas dengan asam asetat 1% sebanyak 2 kali celupan. Selanjutnya preparat dimasukkan kedalam Aniline Blue selama 15 menit dan dicuci dengan asam asetat 1% sebanyak 2 kali celupan. Sediaan selanjutnya didehidrasi dengan alkohol bertingkat mulai dari alkohol 95%
sebanyak sebanyak 10 celupan, alkohol 100% I sebanyk 10 celupan dan alkohol 100% II selama 2 menit. Setelah didehidrasi, sediaan dimasukkan kedalam larutan Xylol I selama 1 menit dan Xylol II selama 2 menit. Kemudian preparat dikeringkan dan ditutup dengan cover glass.
Pengamatan Histopatologi
Pada pengamatan histopatologi dilakukan pengamatan dengan membandingkan setiap kelompok perlakuan dengan peubah jumlah sel radang (Polimorfonuklear), jumlah makrofag, jumlah neovaskularisasi, persentase reepitelisasi, dan luasan jaringan ikat kolagen.
Pewarnaan Hematoxillin Eosin (HE) digunakan untuk pengamatan jumlah sel radang (Polimorfonuklear), jumlah makrofag, dan jumlah neovaskularisasi,. Diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran objektif 40x dan 5 lapang pandang. sedangkan pewarnaan Masson-Trichome (MT) digunakan untuk pengamatan pertumbuhan jaringan ikat (fibroblast) dan diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran objektif 40x dan 2 lapang pandang.
Analisis Data
Data pengamatan histopatologi terhadap jumlah sel polymorfonuklear (neutrofil), makrofag, neovaskularisasi, persentase reepitelisasi, dan jaringan ikat dianalisis dengan Uji Analisis Anova dengan penelusuran lanjutan Wilayah Duncan.