Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan sejak bulan Maret sampai dengan Juli 2008. Kegiatan penelitian dilakukan di Laboratorium Bakteriologi Balai Veteriner Bogor, Laboratorium Biokimia IPB dan Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka IPB. Identifikasi GC-MS dilakukan di Laboratorium Kesehatan Daerah Jakarta dan Laboratorium Kriminal Mabes Polri Jakarta. Scanning electron microscopy
dilaksanakan di Laboratorium Zoologi-Biologi LIPI Cibinong.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi daun zodia, pelarut organik , media padat Mueler Hinton, plat silika gel 60 G F254, allumunium foil, kertas saring Whatman 42, telur Artemia salina, bakteri biakan uji
Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli, dan
Salmonella enteritidis.
Alat yang digunakan adalah alat –alat gelas, perangkat destilasi, mikrosentrifuse, mikropipet, shaker, bejana KLT, lampu UV panjang gelombang 254 nm dan 365 nm, microwell, aerator, perangkat GC-MS, scanning electron microscop tipe JSM-5000.
Metode Penelitian
Isolasi Minyak Atsiri (Lopes et al. 1997)
Minyak atsiri daun zodia diisolasi mengunakan metode destilasi uap. Daun zodia dicuci dan dikeringudarakan. Selanjutnya sebanyak 400g daun kering didestilasi uap selama 4 jam sampai. Destilat diambil, air yang tercampur dipisahkan dengan penambahan Na2SO4 anhidrat. Minyak atsiri dipisahkan dengan cara memipetnya menggunakan pipet tetes.
Karakterisasi menggunakan GC-MS (Lopes et al. 1997)
Senyawa aktif dilarutkan dalam metanol. Larutan kemudian diinjeksikan ke dalam alat GC-MS. Adapun spesifikasi alat GC-MS yang digunakan adalah
sebagai berikut:
instrumen GC-MS Agilent Technologies 6890 GC dengan auto sampler 5973 Mass Selective Detector
chemstation data system.
Kolom innowax dengan panjang kolom kapiler 30 m diameter 0.25 mm dan ketebalan 0.25 μm.
Gas pembawa adalah helium dengan kecepatan alir 0.6 µl/menit
Pengujian Aktifitas Antibakteri (Simons & Craven, 1980)
Pengujian antibakteri dilakukan dengan metode disc difusion. Bakteri biakan uji diinkubasikan pada temperatur 370C selama 24 jam. Ke dalam media Mueller Hinton yang telah membeku dalam cawan petri diinokulasikan bakteri biakan uji dengan densitas bakteri 108 (menggunakan standard Mac Farland no. 2.
Paper disc yang telah ditetesi contoh sebanyak 15 μl diletakkan pada permukaan media. Pengamatan dan pengukuran zona bening dilakukan setelah inkubasi selama 18 jam pada suhu 370C.
Uji Toksisitas Minyak Atsiri (Latha et al. 2007)
Uji toksisitas minyak atsiri menggunakan metode Brine-Shrimp Letality Test. Disiapkan larutan uji minyak atsiri dengan konsentrasi 0, 100, 500, dan 1000 ppm dalam akuades dengan Tween 80 sebanyak 0,1% sebagai penurun tegangan permukaan. Ke dalam setiap sumur yang berisi larutan dimasukkan larva udang Artemia salina berumur 28 jam. Interaksi artemia dan larutan uji dilakukan selama 24 jam, selanjutnya jumlah larva udang yang mati dihitung. Data persen larva udang hidup diplotkan terhadap konsentrasi minyak atsiri dalam kurva regresi linier. Nilai LC50 ditentukan dengan menggunakan persamaan kurva yang dihasilkan.
Kromatografi Lapis Tipis (Stahl, 1969)
Pemisahan senyawa antibakteri dilakukan dengan teknik kromatografi lapis tipis dengan mencari eluen yang cocok. Lempeng lapis tipis silika gel 60 G F254 dengan ukuran panjang 10 cm dan lebar 2.5 cm diberi tanda garis dengan pensil pada jarak 1 cm dari setiap ujung lempeng. Fraksi aktif dilarutkan dalam pelarut asal. Eluen dimasukkan dalam tabung kromatografi hingga tingginya mencapai 0.5 cm dari dasar tabung dan ditutup rapat lalu dibiarkan agar tabung jenuh dengan uap pelarut. Larutan ektrak sampel diteteskan pada lempeng silika gel. Plat dicelupkan ke dalam larutan pengembang. Setelah mencapai batas 1 cm dari bagian atas plat, elusi dihentikan selanjutnya plat dikeringkan pada suhu ruang. Spot hasil pemisahan dideteksi menggunakan sinar UV dengan panjang gelombang 254 nm dan 365 nm dan diberi tanda dengan pensil lalu dihitung nilai
retardation factor (Rf) masing-masing noda yang terbentuk. Rf = jarak tempuh analit dari titik awal
Jarak tempuh pelarut
Penentuan Minimum Inhibitory Concentration (MIC) (Edberg, 1986 yang dimodifikasi)
Nilai MIC adalah konsentrasi terendah yang mematikan semua bakteri yang diinokulasikan ke dalam medium. MIC ditentukan menggunakan metode
broth dillution menggunakan kaldu Mueller Hinton. Minyak atsiri diencerkan dalam suatu rangkaian konsentrasi dalam kaldu Mueller Hinton dengan bantuan pengemulsi. Bakteri patogen dibuat konsentrasinya menjadi 105 sampai 106 organisme/ml. Ke dalam setiap tabung dimasukkan inokulum termasuk juga satu tabung yang hanya berisi kaldu Mueller Hinton sebagai kontrol. Setelah inokulasi, tabung ditempatkan dalam inkubator suhu 370C selama 18 jam. Selanjutnya kultur bakteri disubkultur kembali pada media padat Mueller Hinton dan diinkubasi kembali pada suhu 370C selama 18 jam. Setelah inkubasi selesai, dilakukan pengamatan terhadap adanya pertumbuhan bakteri. Konsentrasi minyak atsiri yang menyebabkan bakteri tidak tumbuh pada subkultur merupakan konsentrasi yang dipilih sebagai nilai MIC.
Penentuan Waktu Kontak Minyak Atsiri (metode Bintang, 1993)
Disiapkan media cair Mueller Hinton yang mengandung ekstrak dengan konsentrasi 2%. Disiapkan pula satu tabung yang hanya berisi media cair sebagai kontrol. Semua tabung diinkubasi pada 200C selama 5 menit. Selanjutnya ke dalam setiap tabung dimasukkan bakteri biakan uji S. aureus sebanyak 100 μl dengan interval waktu 30 detik untuk setiap tabung. Setelah diinkubasi selama 1 jam, diambil 20 μl kultur untuk disubkulturkan pada media padat Mueller Hinton. Subkultur dilakukan lagi pada setiap jam berikutnya selama 24 jam. Media yang telah diinokulasi diinkubasi pada 370C selama 24 jam. Setelah itu jumlah bakteri yang tumbuh dalam setiap media subkultur dihitung.
Analisis Perubahan Morfologi Sel (Ritz et al. 2001)
Tahap ini bertujuan untuk mengetahui perubahan morfologi dan struktur sel bakteri. Perubahan-perubahan yang diamati diantaranya adalah perubahan penampakan sel secara umum, ketebalan dinding sel, ukuran sel dan lainnya yang dapat diamati dengan SEM.
Suspensi bakteri yang telah diinteraksikan dengan minyak atsiri daun zodia dengan konsentrasi 2% selama 17 jam disentrifus dengan kecepatan 3500 rpm selama 15 menit. Supernatan dibuang, contoh direndam dengan glutaraldehyde 2% selama beberapa jam. Contoh disentrifus kembali, larutan fiksatif dibuang, ditambahkan buffer caccodylate, dilakukan perendaman selama 10 menit. Perendaman dilakukan dua kali. Contoh disentrifus kembali, buffer dibuang, lalu ditambahkan osmium tetra oksida 1% dan direndam selama 1 jam. Contoh disentrifuse, larutan dibuang, ditambahkan alkohol 50 % dan direndam selama 10 menit sebanyak 2 kali. Selanjutnya berturut-turut tambahkan alkohol 70 % , alkohol 80%, dan 95 %, masing 2 kali 10 menit dan alkohol absolut selama 10 menit. Pengerjaan ini dilakukan sekali lagi. Contoh disentrifus, larutan dibuang, ditambahkan t- butanol, contoh direndam 2 kali 10 menit, sentrifus dilakukan lagi, butanol dibuang, ditambahkan butanol, dibuat suspensi dalam butanol, Potongan cover slip dibekukan, dibuat ulasan suspensi pada cover slip lalu coverslip dikeringkan dengan dengan Freeze Drier dan dilapisi dengan. Preparat siap diamati. Semua proses dilakukan pada suhu 40C.
Isolasi Senyawa Aktif Antibakteri (Atkins, 1994)
Minyak atsiri daun zodia didinginkan mencapai suhu 18oC sampai terbentuk kristal. Kristal yang dihasilkan dipisahkan dari fase cair. Kristal dicuci beberapa kali menggunakan akuades. Kristal hasil cucian dilarutkan dalam heksan. Fraksi heksan dipisahkan kemudian kristal sisa dilarutkaan dalam etil asetat. Pelarut dari setiap fraksi kemudian dihilangkan dengan metode penguapan pada suhu kamar. Selanjutnya aktivitas antibakteri diuji kembali serta dilakukan analisis kemurnian kristal dengan metode KLT dan GC-MS.