Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan di Bagian Patologi, Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Mulai pada bulan Maret sampai April 2007.
Bahan dan Alat
1. Hewan yang dipergunakan dalam penelitian ini adalah mencit jantan (Mus musculus albinus) sebanyak 15 ekor berumur 2 bulan dengan berat rata- rata 19-25 gram, yang didapat dari peternakan mencit di Ciampea, dengan pemeliharaan secara konvesional dan inbreed.
2. Ekstrak Buah Merah diperoleh langsung dari Wamena yang telah diolah dan dikemas dalam botol berwarna gelap dan disimpan dalam suhu 4-10
O
C (refrigerator).
3. Bahan yang dipergunakan dalam penelitian ini yaitu: parasetamol, pakan mencit, sekam, alkohol 70%, Buffer Netral Formalin (BNF) 10%, aquades dan NaCl fisiologis. Pada proses hidrasi bahan yang dipakai adalah alkohol 70%, 80%, 90%, 95%, alkohol absolut. Proses penjernihan (clearing) yang digunakan adalah xylol. Penanaman jaringan dalam paraffin (embedding) yang digunakkan yaitu, paraffin dan air dingin. Bahan untuk pewarnaan yang digunakan yaitu, Mayer Hematoxilin-Eosin (HE) dan alkohol serta litium karbonat. Mounting menggunakan permount. 4. Peralatan yang digunakan adalah: 6 kandang modifikasi, kawat, timbangan digital, sonde lambung, spoit 1 ml, botol tempat minum, talenan, stiroform, aluminium foil, jarum pentul, alat-alat nekropsi (skapel, pinset anatomis, pinset sirurgis dan gunting), kertas label, tali, cawan petri, kapas, 15 botol spesimen, staining jar, gelas objek, cover glass dan mikroskop cahaya.
Persiapan Kandang dan Adaptasi Mencit
Sebelum mencit disiapkan untuk penelitian, dilakukan persiapan kandang terlebih dahulu. Kandang mencit dibuat dari boks plastik yang dimodifikasi dan ditutup dengan kawat. Pada bagian bawah dialasi sekam yang diganti setiap 3 hari sekali. Kandang terdiri dari 3 kelompok yaitu; kontrol (-), kontrol (+) dan perlakuan, dengan masing-masing kandang diisi 5 ekor mencit. Mencit diberi pakan dan minum secara ad libitum. Sebelum diberi perlakuan, mencit terlebih dahulu diadaptasikan dan diberi treatment obat cacing dengan dosis 0.5 ml/kg BB dan ampicillin dosis 0.8 ml/kg BB.
Perlakuan Pada Mencit
Setelah treatment adaptasi selama 2 minggu, kemudian penelitian ini dilaksanakan. Selama penelitian berlangsung, semua kelompok mencit diberi pakan komersil dan air minum ad libitum sesuai kebutuhan. Kelompok kontrol (-) tidak diberikan perlakuan khusus hanya diberikan makan mencit dan minum. Kontrol (+) diberikan parasetamol dalam bentuk larutan, menggunakan sonde lambung dengan dosis 10 mg/ kg BB. Pada kelompok perlakuan diberikan ekstrak Buah Merah menggunakan sonde lambung dengan dosis 0.1 ml/ mencit dua kali sehari (pagi dan sore). Dosis dikonversikan dengan 50 kg bobot manusia dengan perhitungan sebagai berikut:
Dosis manusia dewasa ± 50 kg BB= 15 ml
Dosis per kg BB= 15 ml/50 kg BB= 0.3 ml/kg BB
Dosis mencit = 40 gram/1000 gram x 0.3 ml/ kg BB= 0.012 ml
Akan tetapi dosis yang dipergunakan, adalah 0.1 ml/mencit untuk memudahkan aplikasi dan mengetahui efek bahan penghambat kerusakan hati ekstrak Buah Merah.
Pada akhir penelitian dilakukan euthanasia. Mencit dimatikan dengan dimasukkan kedalam anaerobic jar yang telah terdapat kapas mengandung eter didalamnya. Ditunggu beberapa saat sampai mencit mati setelah itu dilakukan nekropsi.
Pembuatan Sediaan Histopatologi
Setelah sampel organ hati terfiksasi sempurna dilakukan trimming untuk proses dehidrasi. Potongan hati dengan ketebalan sekitar 3 mm dimasukkan ke dalam tissue cassette dan didehidrasi dengan meredam sediaan tersebut secara berturut-turut ke dalam alkohol 70%, 80%, 90%, alkohol absolut I, alkohol absolut II, xylol I dan xylol II untuk proses clearing, parafin I dan parafin II untuk embedding. Masing-masing proses perendaman pada setiap bahan tersebut dilakukan selama 2 jam pada Tissue Processor secara otomatis dengan program pengaturan tertentu. Kemudian jaringan dimasukkan ke dalam pencetak berisi parafin cair. Letak jaringan diatur sedemikian rupa agar tetap berada ditengah blok parafin. Setelah mulai membeku, parafin ditambah kembali hingga alat pencetak penuh dan dibiarkan hingga parafin dingin dan mengeras.
Pemotongan jaringan dengan mikrotom dilakukan pada ketebalan 5 μm. Hasil pemotongan yang berbentuk pita diletakkan diatas permukaan air hangat bersuhu 45 OC dengan tujuan menghilangkan lipatan-lipatan. Sediaan diangkat dari permukaan air dengan gelas objek yang telah diulasi larutan albumin yang berguna untuk merekatkan jaringan. Setelah itu, preparat dikeringkan semalam dalam inkubator bersuhu 60 OC.
Perwarnaan
Sediaan dimasukkan ke dalam xylol dua kali selama 2 menit (Deparafinisasi). Kemudian sediaan direhidrasi yang dimulai dari alkohol absolut sampai alkohol 80% dengan waktu masing-masing dua menit. Selanjutnya sediaan dicuci dalam air mengalir.
Sediaan yang sudah bersih diberi pewarnaan Mayer’s Hematoxylin selama 8 menit, kemudian dibilas dengan air mengalir dan dicuci dengan lithium karbonat selama 15-30 detik, dibilas dengan air dan akhirnya diwarnai dengan pewarna Eosin selama dua menit. Untuk menghilangkan warna Eosin yang berlebihan, sediaan dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. Kemudian sediaan dicelupkan kedalam alkohol 90% sebanyak 10 kali celupan, alkohol absolut I 10 kali celupan, alkohol absolut II selama 2 menit, xylol I selama satu menit, dan xylol II selama dua menit. Sediaan dikeringkan terlebih dahulu sebelum ditetesi
dengan perekat permount dan kemudian ditutup dengan penutup dan disimpan beberapa menit hingga zat perekat mengering. Setelah itu, preparat siap untuk diamati dengan menggunakan mikroskop cahaya. Identifikasi dan pengamatan preparat dilakukan di Bagian Patologi, Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
Pemeriksaan Histopatologi
Pemeriksaan histopatologi menggunakan mikroskop cahaya. Pada hati yang menjadi perhatian pada pemeriksaan histopatologi adalah perubahan- perubahan yang terjadi pada sel hati dengan melihat keadaan sitoplasma dan kondisi dari inti sel. Parameter yang diamati adalah degenerasi hidropik, degenerasi lemak dan nekrosa. Pengamatan dilakukan terhadap 40 lapang pandang dengan pembesaran 40x atau luas 180 μm2 dengan menggunakan mikrometer.
Analisa Data
Data yang telah diperoleh akan dianalisa dan diuji dengan metode statistik ANOVA dengan α pada 0.05 dilanjutkan metode Duncan program SAS.