Mencit yang hanya diberi parasetamol yaitu, kontrol (+) menghasilkan kerusakan pada hepatosit. Kerusakan yang terlihat akibat parasetamol yaitu; degenerasi hidropik, degenerasi lemak dan nekrosa sesuai dengan Mohapatra (1993); Maronpot (1999) dan Anonimus (2006b). Sementara perubahan histopatologi pada jaringan interstitium hati adalah kongesti yang terlihat sebagai perluasan pada sinusoid.
Adanya kongesti dan perluasan sinusoid terjadi pada semua kelompok baik kontrol (-), kontrol (+) maupun perlakuan. Perubahan ini terjadi karena penggunaan eter overdosis sebagai reagen euthanasia. Oleh karena itu, perubahan- perubahan tersebut tidak dapat dijadikan sebagai parameter dalam analisa perubahan mikroskopis akibat pemberian parasetamol dan ekstrak buah merah. Hal ini sesuai dengan pendapat Ganiswara (1995) dan Handoko (2003) yang menyatakaan bahwa penggunaan anastesi ringan dapat menyebabkan dilatasi pembuluh darah. Vasodilatasi yang biasanya terjadi di daerah perifer akan dapat mengakibatkan penurunan tekanan darah pada saat menggunakan eter.
Dalam membandingkan derajat kerusakan dari ketiga kelompok mencit penelitian, maka dilakukan penghitungan persentase hepatosit yang mengalami perubahan degenerasi hidropik, degenerasi lemak dan nekrosa pada tiap lapang pandang seluas 180 μm2 dengan 40X lapang pandang. Hasil perhitungan presentase perubahan hepatosit yang mengalami lesio ditampilkan dalam Tabel 3 dan Gambar 5 dibawah ini.
Tabel 3 Persentase lesio hepatosit mencit pada pemberian ekstrak Buah Merah Kelompok Nekrosa Deg. lemak Deg. hidropik Normal Kontrol (-) 7,00 ± 1,23a 3,60 ± 1,14a 24,80 ± 10,01ab 64,00 ± 9,57a Kontrol (+) 16,20±3,83b 3,80 ± 2,28a 40,80 ± 19,28a 37,00 ± 21,01b Perlakuan 6,40 ± 4,16a 11,20 ± 11,43a 17,20 ± 7,92b 65,20 ± 20,75a
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%
Kontrol (-) Kontrol (+) Perlakuan
Normal Degenerasi Hidropik Degenerasi Lemak Nekrosa
Gambar 5 Perbandingan persentase kerusakan hepatosit pada kelompok perlakuan dan kontrol
Hasil perhitungan jumlah sel yang menunjukan lesio, dianalisa dengan statistika menggunakan uji ANOVA untuk dapat mengetahui tingkat perbedaan antara ketiga kelompok. Persentase hepatosit normal pada kelompok perlakuan cenderung hampir sama jumlahnya dibandingkan dengan kelompok kontrol (-) tidak berbeda nyata (α>0.05). Tetapi persentase dengan kelompok kontrol (+) lebih
tinggi pada kelompok perlakuan hepatosit yang normal, didukung oleh hasil analisis statistik yang didapat berbeda nyata (α<0,05). Penghitungan persentase lesio hepatosit kelompok perlakuan menunjukan bahwa sari Buah Merah dapat memperkecil derajat nekrosa dan degenerasi hidropik dibandingkan kontrol (+) secara signifikan walaupun pada kelompok perlakuan, kejadian degenerasi lemak lebih tinggi daripada kontrol (+) (Tabel 3 dan Gambar 5).
Perubahan histopatologi organ hati yang berupa degenerasi hidropik dan lemak serta nekrosa terlihat pada semua kelompok (kontrol (-), kontrol (+) dan perlakuan) (Gambar 6). Degenerasi dan nekrosa yang terjadi pada kelompok kontrol (-) dapat disebabkan karena adanya gangguan non spesifik yang biasa ditemukan pada hewan non-Spesific Pathogen Free (SPF) yang dipelihara secara konvensional yang mungkin pernah terpapar beberapa agen eksogenous.
Rendahnya jumlah persentase hepatosit normal pada kontrol (+) hal ini membuktikan bahwa parasetamol bersifat toksik terhadap hati. Tingginya jumlah
sel hati normal pada perlakuan membuktikan ekstrak buah merah digunakan untuk memperbaiki hepatosit. Regenerasi hepatosit telah terjadi dibuktikan dengan jumlah persentase hepatosit normal kontrol (-) hampir sama dengan jumlah hepatosit normal kelompok perlakuan. Hal ini didukung data pada Gambar 5 dimana jumlah normal lebih banyak sedangkan kerusakan menurun dibandingkan kontrol.
Gambar 6 Gambaran histopatologi hepatosit kontrol (-) (A), kontrol (+) (B dan C) dan perlakuan (D). Normal hepatosit (panah biru), degenerasi hidropik (panah merah), degenerasi lemak (panah kuning) dan nekrosa (panah hijau).Pewarnaan HE. Pembesaran 400 X. Bar 2µm. Parasetamol akan diubah menjadi metabolit inaktif melalui jalur metabolisme fase II yang dikonjugasikan dengan sulfat dan glukuronida, yang akan beroksidasi dalam jumlah kecil melalui sistem enzim sitokrom P-450. Sitokrom P-450 akan mengkonversikan parasetamol menjadi metabolit reaktif
yang tinggi yaitu, N-acetyl-p-benzo-quinone imine (NAPQI) (Mitchell et al. 1973; Hinson et al. 1974 & Anonimus 2006b). Pada parasetamol berdosis terapeutik, NAPQI akan berikatan dengan glutation sehingga metabolit ini tidak merusak hati. Namun saat dosisnya berlebihan pada daerah hepatoseluler, glutation yang mengikat metabolit parasetamol tidak mencukupi jumlahnya sehingga metabolit yang bebas akan berikatan dengan protein dan akhirnya terjadi kerusakan hepatosit dan menuju hepatik nekrosis akut (Mohapatra 1993 & Anonimus 2006b). Glutation (GSH) merupakan antioksidan endogenous yang dihasilkan oleh hati yang dapat mencegah kerusakan hepatosit akibat radikal bebas ataupun kerusakan akibat jenis toksikan lainnya. Konsentrasi normal glutation sekitar 20- 30%, mampu melindungi hepatosit dari kerusakan yang akan berakhir fatal. Dengan kosentrasi glutation yang semakin rendah maka potensi parasetamol untuk merusak hati semakin meningkat (Rzucidlo et al. 2000). Pada saat konsentrasi NAPQI yang berlebih tidak berikatan dengan glutation, terjadi katabolisme dari makromolekul dan kegagalan pemompaan sodium. Hal ini akan menyebabkan hepatosit kehilangan glikogen dan ribosom serta terjadinya peningkatan tekanan osmosis seluler sehingga mengakibatkan degenerasi hidropik. Degenerasi hidropik merupakan perubahan yang bersifat subletal yang ditandai dengan terbentuknya vakuol-vakuol halus yang tidak jernih di dalam sitoplasma. Degenerasi hidropik merupakan salah satu tanda awal terjadinya kerusakan hati akibat toksin (Maronpot 1999). Pada matriks sitosolik atau retikulum endoplasma terdapat akumulasi air menyebabkan ukuran hepatosit menjadi lebih besar (Cheville 1999). Sel membutuhkan ATP-ase untuk dapat mengatur keluar-masuknya ion. Infeksi yang akut dapat menyebabkan protein dan air tetap berada di dalam sitoplasma. Pompa lapisan membran akan memindahkan ion dan air dengan cepat keluar dari sitosol dan masuk ke dalam retikulum endoplasma.
Influks air yang berlanjut akan mengganggu membran sehingga hasil akhirnya membentuk daerah nekrosis koagulatif. Alasan lain terjadinya nekrosa dapat diakibatkan ketidakmampuan hepatosit memetabolisme lipid peroksidase (Mohapatra 1993). Akibat dari NAPQI reaktif yang merusak fungsi hepatosit, maka jalur metabolisme lipid intraseluler menjadi terganggu sehingga substrat
molukel akan berakumulasi (contoh: kolesterol, fosfolipid atau asam lemak). Hal inilah yang membuat jumlah trigliserida semakin banyak dan mendominasi perubahan degenerasi lemak (Cheville 1999).
Tingginya persentase hepatosit yang mengalami degenerasi lemak pada kelompok perlakuan, disebabkan oleh kandungan lemak ekstrak Buah Merah yang cukup tinggi. Sehingga pada saat hepatosit mengalami kerusakan atau gangguan akibat parasetamol, hepatosit tidak dapat secara optimum melakukan metabolisme lemak dihati. Akibatnya lemak akan tertimbun di dalam hepatosit dan menyebabkan timbulnya degenerasi lemak.
Degenerasi lemak pada hati menunjukkan bahwa di dalam tubuh terdapat ketidakseimbangan proses metabolisme sehingga mempengaruhi kadar lemak di dalam dan luar jaringan hati. Degenerasi lemak dapat disebabkan oleh suatu keadaan anoksia, infeksi yang disertai dengan keracunan dan demam, penyakit metabolik, keadaan gizi yang buruk, alkoholisme, serta keracunan. Dalam kondisi anoksia, penyakit metabolik dan gizi buruk, metabolisme lemak menjadi terganggu. Hal ini dikarenakan tubuh kekurangan glukosa dan lemak, sehingga tubuh akan mengambil lemak pada depo-depo lemak. Depo lemak akan membebaskan asam lemak yang kemudian dibawa menuju hati dan dipecah menjadi asetil-KoA. Asetil-KoA yang dihasilkan akan dirubah menjadi benda-benda keton sehingga menyebabkan gangguan metabolisme lemak (Koolman 2001). Pada hati, degenerasi lemak tampak seperti bulatan yang kosong (jernih) dan bundar di dalam sitoplasma. Degenerasi lemak merupakan perubahan morfologi hepatosit dan penurunan fungsi organ hati yang dikarenakan akumulasi lemak sitoplasma dalam hepatosit (Darmawan 1979). Dalam kondisi normal, glukosa hati diubah menjadi asam lemak oleh asetil-KoA secara normal. Hati dapat juga mengambil asam lemak dari lemak yang didapatkan dari usus bersamaan dengan kilomikron melalui vena porta. Asam lemak akan diubah menjadi trigliserida dan fosfolipid. Apolipoprotein bersama-sama trigliserida dan fosfolipid membentuk kompleks lipoprotein (VLDL) yang akan disekresikan keluar hepatosit (Koolman 2001). Saat terjadi degenerasi lemak, trigliserida tidak mengalami perubahan menjadi lipoprotein sehingga digunakannya asam lemak untuk memproduksi energi di dalam mitokondria. Degenerasi lemak yang disebabkan oleh toksikan akan membentuk penyebaran, zona, dan perubahan difus. Menurut Maronpot
(1999) degenerasi lemak biasanya bersifat reversible tetapi dapat juga bersifat irreversible dan dapat menyebabkan kelainan fibrosis dan hyperplasia
regeneratif. Mekanisme degenerasi lemak hati sangat kompleks, akan
menyebabkan ketidakseimbangan antara absorbsi asam lemak dan sekresi very low density lipoproteins (VLDL). Perbedaan kimia toksik dapat saja
menyebabkan ketidak seimbangan dengan cara yang berbeda.
Hepatosit yang mengalami nekrosa menunjukkan perubahan pada inti dan sitoplasmanya. Inti hepatosit akan mengecil dan berwarna gelap akibat dari
penggumpalan kromatin inti. Proses ini disebut piknosis. Inti dapat juga mengalami kehancuran (karyorheksis) bahkan dapat juga menghilang
(karyolisis). Sedangkan pada sitoplasmanya akan terlihat asidofilik (Cotran et al. 1989 & Jubb et al. 1993).
Menurut Sidik (2005) dalam Anonimus (2005b) bahwa Buah Merah dapat berfungsi sebagai antioksidan karena mengandung antosian (senyawa berwarna merah). Buah Merah juga mengandung tokoferol sebesar 11.000 ppm yang dapat menangkap radikal bebas akibat metabolisme parasetamol. Buah Merah mengandung karotenoid yang cukup tinggi. Karotenoid merupakan jenis antioksidan yang mempunyai kemampuan tinggi dalam memproteksi oksidasi yang disebabkan oleh radikal bebas (Arnelia 2002). Buah Merah yang memiliki kandungan karotenoid yang tinggi akan memproteksi hepatosit dari radikal bebas sehingga dapat mencegah kerusakan hati. Buah Merah mengandung betakaroten, tokoferol dan vitamin C yang cukup tinggi. Senyawa-senyawa kimia yang dikandung Buah Merah dapat mengikat radikal bebas dan mencegah pembentukan (amplifikasi) radikal bebas sehingga kerusakan hepatosit lebih lanjut dapat dihindari dan merangsang regenerasi hepatosit. Buah Merah yang banyak mengandung vitamin dan mineral cukup lengkap dapat membantu dalam proses metabolisme. Membaiknya metabolisme tubuh sangat membantu hati untuk meregenerasi sel-sel hati yang rusak akibat toksik. Tubuh mendapatkan asupan protein yang cukup untuk meningkatkan daya tahan yang didapatkan dari buah merah. Apalagi Buah Merah mengandung tokoferol yang berfungsi dalam pembentukan sel-sel baru untuk mengganti sel-sel yang rusak atau mati (Anonimus 2005b).
Secara umum pada daerah vena porta dan vena sentralis seluruh kelompok mengalami lesio degenerasi hidropik, degenerasi lemak dan nekrosa walaupun tidak berbeda nyata. Pada kontrol (-) terdapat degenerasi hidropik (Tabel 4 dan Gambar 7), disebabkan pengaruh stress, pakan, ventilasi, kelembaban dan faktor- faktor lainnya sehingga mempengaruhi kondisi normal fisiologis mencit.
Asupan darah yang berasal dari saluran cerna mengandung banyak radikal bebas, sehingga menyebabkan persentase degenerasi hidropik pada vena porta lebih banyak dibandingkan vena sentralis. Persentase jumlah nekrosa vena porta lebih rendah dibandingkan vena sentralis (Gambar 7), walaupun perhitungan
secara statistik menunjukkan hasil yang tidak berbeda nyata (α >0.05) pada daerah sentralis maupun porta disemua kelompok (Tabel 4).
Degenerasi hepatosit umumnya dimulai dari daerah portal yang meluas menuju vena sentralis. Hal ini disebabkan karena suplai darah dari usus menuju ke hati melalui vena porta. Jika darah yang berasal dari usus mengandung toksin maka kerusakan awal akan ditemukan pada hepatosit daerah vena porta. Selanjutnya aliran darah akan melewati sinusoid menuju vena sentralis. Terdapat beberapa zat toksin akan dimetabolisme oleh hati. Hasil metabolisme akan dibawa oleh aliran darah sinusoid menuju vena sentralis. Dalam hal ini maka, kerusakan hepatosit akan banyak dijumpai pada daerah vena sentralis (Mac Farlene et al. 2000).
Tabel 4 Persentase lesio hepatosit daerah vena sentralis (VS) dan vena porta (VP) Kelompok Daerah Normal Deg hidropik Deg Lemak Nekrosa VS 60.80±15.12a 22.20±13.01a 5.80±4.44a 8.60±2.41a Kontrol (-) VP 67.40±6.02a 23.60±7.73a 3.40±2.07a 5.60±0.89a VS 33.20±26.28a 42.40±17.21a 8.00±5.61a 16.80±5.07a Kontrol (+) VP 38.00±26.28a 38.40±20.90a 6.20±3.56a 14.80±3.83a VS 66.20±17.96a 20.60±10.09a 9.40±7.13a 5.00±3.67a Perlakuan VP 66.60±19.27a 10.40±9.61a 14.00±17.99a 7.00±3.67a
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% % ke ru sa ka n he pa tosit Vena Porta Vena Se ntra lis Vena Porta Vena Se ntra lis Vena Porta Vena Se ntra lis K(-) K(+) Perlakuan Kelompok Nekrosa Degenerasi Lemak Degenerasi Hidrops Normal
Gambar 7 Perbandingan persentase kerusakan hati pada vena porta dan vena sentralis
Hasil perbandingan persentase lesio hepatosit di sekitar vena sentralis dan vena porta kelompok kontrol (+) dan perlakuan tidak berbeda nyata (Tabel 4), menunjukkan bahwa tingkat toksisitas zat-zat asal usus sebelum dan setelah dimetabolisme oleh hepatosit sama. Degenerasi hidropik kelompok perlakuan lebih banyak terjadi di daerah vena sentralis, karena perubahan ini menunjukkan bahwa ekstrak Buah Merah dari usus dapat mengurangi efek radikal bebas yang terdapat di usus. Sedangkan degenerasi lemak (Gambar 7) lebih banyak terjadi pada daerah vena porta, dikarenakan Buah Merah yang banyak mengandung asam lemak menyebabkan akumulasi asam lemak di hepatosit pada daerah porta, sehingga menghasilkan banyak trigliserida dan terjadi degenerasi lemak (Cheville 1999). Sama halnya dengan degenerasi lemak, nekrosa lebih banyak terjadi pada daerah porta, membuktikan bahwa metabolit ekstrak Buah Merah dapat meningkatkan regenerasi sel hati pada daerah vena sentralis. Tetapi ekstrak Buah Merah tidak merusak hepatosit di daerah vena porta karena terjadi penurunan degenerasi hidropik dan nekrosa (Gambar 7).