Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan dari bulan Maret 2006 sampai dengan Desember 2008 di Laboratorium Kerjasama Bioteknologi Indonesia-Belanda (BIORIN) dan Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler Tanaman (BMST), Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) IPB.
Bahan Penelitian
Daun muda T. langsdorffiana digunakan sebagai bahan tanaman. Fage BlueSTAR-1 (Novagen) digunakan sebagai vektor pengklonan (Gambar 4).
Gambar 4 Vektor pengklonan fage BlueSTAR-1.
Fage ini telah dipotong dengan XhoI dan telah mengalami penyisipan (fill-in) dengan nukleotida dCTP dan dTTP sehingga menghasilkan potongan vektor dengan ujung menggantung (overhang) TC pada situs penyisipan (Gambar 5).
Gambar 5 BlueSTAR-1 (Novagen) yang dipotong dengan XhoI dan mengalami pengisian dengan dCTP dan dTTP pada situs pengklonan.
Kedua lengan dan pengisi tidak cocok
Pengisi lac Sal I S fi I lo x P No t I E a g I Sac II B a m H I S m a I E c o R I X h o I Sal I H in d III X b a I A v r I Sac I Sac I A v r II X b a I H in d III Sal I X h o I E c o R I S m a I B a m H I Sac II E a g I No t I Ap Ori lox P S fi I Sal I BlueSTAR-1
Pemotongan dengan Xho I
13
E. coli galur ER1647 digunakan sebagai inang untuk mengamplifikasi fage rekombinan. E. coli galur BM25.8 digunakan sebagai inang untuk memproses eksisi dari fage rekombinan menjadi plasmid rekombinan. E. coli galur DH5 digunakan sebagai inang untuk mendukung replikasi plasmid.
Metode Penelitian
Konstruksi pustaka genom dilakukan melalui beberapa tahapan yaitu: isolasi DNA total tanaman, pemotongan parsial DNA tanaman, penyisipan DNA T. langsdorffiana ke dalam fage , pengemasan DNA rekombinan, transveksi fage rekombinan ke E. coli dan analisis pustaka genom. Analisis pustaka genom meliputi eksisi dari fage menjadi plasmid, isolasi DNA plasmid, transformasi genetik dan pemotongan DNA plasmid dengan enzim restriksi. Tahapan penelitian ini disajikan pada Gambar 6.
Gambar 6 Tahapan konstruksi pustaka genom. Isolasi DNA total
T. langsdorffiana Pemotongan parsial DNA Fragmen DNA T. langsdorffiana Vektor fage terpotong
Penyisipan DNA T. langsdorffiana ke dalam fage
DNA fage rekombinan
Pengemasan fage rekombinan
Transveksi fage rekombinan ke E. coli
Analisis pustaka genom: Transformasi bakteri Isolasi DNA plasmid rekombinan
Isolasi DNA total tanaman
Isolasi DNA total tanaman dilakukan dengan mengikuti prosedur Chang et al. (1993) yang dimodifikasi yaitu dengan penggantian LiCl dengan isopropranol/etanol absolut. Sampel diambil dari daun segar yang masih muda. Daun muda tersebut dibuang bagian tulang daunnya, dipotong-potong, dan ditimbang sebanyak 2 g. Selanjutnya potongan daun tersebut ditambah nitrogen cair secukupnya, dan digerus dengan mortar hingga halus. Bubuk ini kemudian dilarutkan dalam 6 ml 2x larutan penyangga cetyltrimethyl-ammonium bromide (CTAB) (2% CTAB, 0.1 M Tris-HCl pH 9.5, 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl, 2% PVP) lalu ditambahkan 0.2% merkaptoetanol. Larutan dibolak-balik sampai rata, kemudian diinkubasikan dalam pemanas bergoyang pada suhu 65oC selama 60 menit. Ke dalam larutan tersebut ditambahkan 6 ml larutan kloroform:isoamilalkohol (CI) (24:1), dibolak-balik selama 1.5 menit, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 4000 rpm dengan swing-out rotor (Jouan, BR4i) pada suhu 4°C selama 10 menit. Setelah terpisah, cairan di bagian atas dipindahkan ke tabung baru dan ditambah isopropanol sebanyak 0.7x volume awal, kemudian campuran ini diinkubasi pada suhu -20 C selama 2 jam. Campuran disentrifugasi pada 4000 rpm, 4 C, selama 20 menit. Setelah sentrifugasi, endapan kemudian dibilas dengan alkohol 70% lalu disentrifugasi kembali pada kecepatan 3000 rpm, 4 C, 10 menit. Endapan yang diperoleh lalu dikeringkan dengan vakum dan disuspensikan dalam TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0). Suspensi DNA kemudian ditambah RNAse dengan konsentrasi akhir 100 g/ml dan diinkubasikan pada suhu 37oC selama minimal dua jam untuk menghilangkan RNA. Suspensi DNA dicampur secara merata dengan 1x volume fenol:kloroform:isoamilalkohol (PCI) (25:24:1), dan disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm dengan fix-angle rotor (Jouan, BR4i) pada suhu ruang selama 10 menit. Cairan bagian atas diendapkan dengan menambahkan 0.1x volume 3 M Na-asetat pH 5.2 dan 2x volume etanol absolut dingin, dibolak-balik pelan lalu diinkubasi pada suhu -20 C selama 2 jam. Setelah inkubasi lalu disentrifugasi kembali pada kecepatan 14000 rpm, suhu 4oC selama 10 menit. Endapan DNA dibilas dengan etanol 70% dingin dan disentrifugasi kembali pada
15
kecepatan 14000 rpm, 4 C, 30 menit. Endapan DNA tersebut dikeringkan, kemudian disuspensikan di dalam TE pH 8.
Pemotongan parsial DNA
DNA total tanaman dipotong dengan enzim Sau3AI (Takara) pada suhu 37ºC selama 30 menit dengan berbagai konsentrasi yaitu: 0.01, 0.015, 0.02 dan 0.04 unit tiap µg DNA.
Penyisipan nukleotida pada ujung fragmen DNA
Setelah dipotong secara parsial kedua ujung fragmen DNA disisipi terlebih dahulu dengan dua nukleotida untuk mencegah terjadinya penyambungan kembali di antara fragmen-fragmen tersebut sesuai dengan prosedur Novagen (1997). Sebanyak 20 g fragmen DNA dicampur dengan larutan penyangga yang mengandung 50 mM Tris-HCl pH 7.3, 10 mM MgCl2, 50 g/ml bovin serum
albumin (BSA), 1 mM deoksiadenosina trifosfat (dATP), 1 mM deoksiguanosina trifosfat (dGTP) (Novagen), 4 µ l 100 mM ditiotreitol (DTT), dan 20 unit Klenow DNA polimerase (Takara) dalam volume total 400 l. Campuran tersebut diinkubasikan pada suhu 30oC selama 30 menit. Campuran dipanaskan pada 70oC selama 10 menit untuk menghentikan reaksi tersebut. Fragmen DNA yang berukuran 7-20 kb diisolasi dengan menggunakan kolom Chroma Spin 1000 (Clontech 1999).
Penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor
Fragmen DNA hasil isolasi disisipkan ke dalam vektor fage dengan cara mencampur 0.5 g fragmen DNA yang ujungnya telah disisipi (fill-in) nukleotida dengan 0.5 g BlueSTAR-1 (Novagen), 4.5 unit T4 DNA ligase (Takara), dan bufer ligasi (30 mM Tris-HCl pH 7.8, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP,
5% polietilen glikol (PEG) 8000), dalam volume total 10 l. Campuran diinkubasi pada suhu 4oC selama 24 jam.
Pengemasan fage rekombinan
Setelah ligasi, DNA fage rekombinan yang dihasilkan selanjutnya dikemas dalam protein mantel. Sebanyak 10 l hasil reaksi ligasi dicampur dengan 50 l protein ekstrak pengemas (Gigapack III, Stratagene) sesuai prosedur Stratagene (2003). Campuran diinkubasikan pada suhu 22oC selama dua jam. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 440 l bufer SM (5.8 g/l NaCl, 2 g/l MgSO47H2O, 0.01% gelatin, dan 50 mM Tris-HCl, pH 7.5). Jumlah titer
ditentukan dengan melakukan transveksi ke E. coli galur ER1647.
Transveksi fage ke dalam E. coli
Transveksi fage ke dalam E. coli dilakukan mengikuti prosedur Suharsono (2002). Fage hasil pengemasan diencerkan 100 kali dan 1000 kali agar memudahkan penghitungan. Sebanyak 100 l E. coli galur ER1647 (OD600=1) dicampur dengan 100 l fage . Campuran diinkubasi dalam balok
pemanas (heat block) pada suhu 37oC selama 30 menit, kemudian ditambah 4 ml molten top agarose (10 g/l bacto-tryptone, 5 g/l NaCl, 6 g/l agarosa) bersuhu 47oC dan telah ditambah X-gal dengan konsentrasi akhir 500 ppm untuk mengidentifikasi rekombinan. Campuran tersebut disebar dalam cawan petri yang mengandung 15 ml media luria bertani (LB) padat (10 g/l bacto-tryptone, 5 g/l ekstrak khamir, 10 g/l NaCl, 15 g/l bacto-agar) sesuai prosedur Novagen (1997). Setelah agarosa yang berada di atas media LB padat tersebut membeku, cawan ditutup, kemudian diinkubasikan pada suhu 37oC selama satu malam.
Eksisi plasmid dari fage
Transveksi fage juga dilakukan ke dalam E. coli galur BM25.8 (OD600=1) untuk melakukan eksisi dari bentuk fage rekombinan menjadi plasmid
rekombinan. Eksisi dilakukan dengan mencampurkan 100 l E. coli galur BM25.8 (OD600=1) dengan 100 l fage . Campuran diinkubasikan di dalam
balok pemanas pada suhu 37oC selama 30 menit. Sebanyak 100 l campuran disebar di atas media LB padat yang mengandung ampisilin 100 ppm dengan menggunakan batang kaca bengkok.
17
Isolasi DNA plasmid rekombinan
Isolasi DNA plasmid dilakukan dengan menumbuhkan satu koloni bakteri E. coli galur BM25.8 dan DH5 di dalam 2 ml media LB cair yang mengandung 100 mg/l ampisilin yang diletakkan dalam inkubator bergoyang dengan kecepatan 250 rpm, pada suhu 37oC selama semalam. Bakteri diendapkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 14000 rpm (Jouan, BR4i), pada suhu 4oC selama 10 menit. Endapan bakteri selanjutnya disuspensikan dalam 300 l larutan penyangga suspensi sel (10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 7.5), kemudian ditambah 300 l larutan penyangga lisis (0.2 M NaOH, 1% SDS). Setelah bakteri tersebut mengalami lisis, ditambah 300 l larutan penyangga netralisasi (1.32 M Na-asetat pH 4.8). Campuran tersebut disentrifugasi pada kecepatan 14000 rpm pada suhu 4oC selama 20 menit. Cairan yang mengandung DNA plasmid diekstraksi dengan larutan PCI, kemudian divorteks dan disentrifugasi pada kecepatan 14000 rpm pada suhu 4ºC selama 20 menit. Supernatan diambil dan diperlakukan dengan RNAse (100 µg/ml) pada suhu 37oC selama semalam. Protein RNAse dipisahkan dari DNA plasmid dengan menambahkan larutan PCI. Cairan kemudian dipresipitasikan dengan penambahan 0.1x volume 3 M Na- asetat pH 5.2 dan 2x volume etanol absolut, diinkubasikan pada suhu -20oC selama dua jam. DNA plasmid selanjutnya diendapkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 14000 rpm pada suhu 4oC selama 20 menit. Endapan DNA plasmid dibilas dengan etanol 70% dan dikeringkan dengan vakum. DNA plasmid tersebut disuspensikan di dalam H2O.
Transformasi bakteri
Bakteri kompeten dibuat dengan mengikuti prosedur Nakayama dan Nishikata (1995) dalam Suharsono (2002). Satu koloni bakteri E. coli galur DH5 dikulturkan dalam 2 ml media LB cair pada inkubator bergoyang dengan kecepatan 250 rpm, pada suhu 37oC selama semalam. Kemudian bakteri tersebut disubkultur dalam 100 ml media LB cair dengan kondisi yang sama hingga OD600=0.6. Bakteri diendapkan dengan disentrifugasikan pada kecepatan 4000
rpm pada suhu 4oC selama 10 menit. Endapan bakteri disuspensikan dalam 3.3 ml larutan penyangga transformasi (TFB) (10 mM MES pH 6.3, 45 mM
MnCl2.4H2O, 10 mM CaCl2.2H2O, 3 mM [Co(NH3)6]Cl3, 100 mM KCl, gliserol
10%, pH 7.5) dan diinkubasikan di dalam es selama 10 menit. Kemudian suspensi tersebut disentrifugasi pada kecepatan 4000 rpm. Endapan bakteri disuspensikan dalam 0.83 ml TFB dan ditambah 58.1 µ l DMSO 99.9%, lalu diinkubasikan di dalam es selama 10 menit sehingga didapat bakteri kompeten. Sebanyak 50 l bakteri kompeten dicampur dengan 10 l (50-100 ng) DNA plasmid dan diinkubasikan di dalam es selama 25 menit. Campuran ini kemudian diinkubasi pada suhu 42oC selama 45 detik, dimasukkan kembali ke dalam es selama 5 menit. Campuran ini ditambah 100 l media 2x YT (16 g/l tripton, 10 g/l ekstrak khamir, 5 g/l NaCl, pH 7.0) dan diinkubasikan pada inkubator bergoyang 250 rpm, 37oC selama 20 menit. Selanjutnya bakteri disebar pada media LB padat yang mengandung ampisilin 100 ppm dan diinkubasikan pada suhu 37oC selama semalam.
Pemotongan plasmid dengan enzim restriksi EcoRI
Plasmid hasil isolasi dipotong menggunakan enzim restriksi EcoRI pada suhu 37ºC selama semalam. Komponen restriksi dengan EcoRI adalah 0.5 µ l (5 unit) enzim EcoRI (Fermentas), 1.0 µl (50 ng) DNA, 2.0 µl (10x) bufer EcoRI (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.02% Triton
X-100, 0.1 mg/ml BSA), 16.5 µl ddH2O sehingga total volume menjadi 20 µ l.
Plasmid yang sudah dipotong dengan enzim restriksi dimigrasikan pada gel agarosa 1% dalam 1x TAE (40 mM Tris-asetat, 1 mM EDTA pH 8.0) bersama dengan penanda 1 kb ladder (Promega).
1500 2000 2000 3000 2000 3000 5000 5000 5000 4000 3000 5000 4000 3000 2000