Roma 8:28
Setitik usaha dan upaya kupersembahkan kepada...
Suamiku Herdamon Budianto dengan segenap pengorbanan waktu dan kesabarannya, Buah hatiku Dimas dan Michelle dengansegala keluguan dan kepolosannya, Papa dan Mama serta Dek’ Aris yang tidak lelah mendampingi dan memberiku semangat.
Segala jerih payahku takkan pernah terwujud tanpa andil karya Maha Agung Allah Bapa. Puji dan syukur ke Hadirat-Mu...Amin.
PRAKATA
Puji dan syukur penulis haturkan kepada „Bapa‟ oleh karena kasih dan
anugerah-Nya maka penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Judul yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Maret 2006 sampai Desember 2008 adalah Konstruksi Pustaka Genom Tibouchina langsdorffiana Baill. Penelitian ini bertempat di Laboratorium Pusat Kerjasama Bioteknologi Indonesia-Belanda (BIORIN) dan Laboratorium Genetika Molekuler dan Seluler Tanaman, Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) IPB, Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Ir. Suharsono, DEA selaku ketua komisi pembimbing dan Ibu Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si. selaku anggota komisi pembimbing yang telah banyak memberikan bimbingan dan saran selama pelaksanaan penelitian dan penyusunan karya ilmiah, serta Dr. Ir. Aris Tjahjoleksono, DEA selaku penguji yang telah banyak memberikan masukan yang berguna dalam penyelesaian penulisan karya ilmiah ini.
Terima kasih atas dana penelitian Proyek DIPA BIOTROP Tahun 2005
dengan judul “Construction of genomic Library and Isolation of Gene Involved in the Plant Tolerant to Low pH and High Solubility of Aluminium from Melastoma” dengan contract agreement No. 13.1/PSRP/SP-PEN/IV/2005 atas nama Dr. Ir. Suharsono, DEA. Terima kasih pula kepada rekan satu tim penulis yaitu Bapak Ir. Hadisunarso yang telah bersama-sama melakukan penelitian dari awal hingga berakhirnya penelitian ini. Terima kasih kepada Laboratorium BIORIN dan Laboratorium PPSHB IPB yang telah menyediakan tempat dan fasilitas dalam pelaksanaan penelitian. Terima kasih penulis sampaikan juga kepada Bapak Abdul Mulya dan Mbak Pepi Elvavina, serta Bapak Adi atas kerjasama dan bantuannya di laboratorium dan di rumah kaca.
Dalam kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih yang mendalam kepada suami tercinta Herdamon Budianto atas pengertian dan kesabarannya memperhatikan anak-anak saat penulis berada di laboratorium dan atas bantuannya dalam membantu mengedit tulisan karya ilmiah ini, Papa & Mama, Enpa & Enma atas dukungan semangat dan doanya, dek Aris yang telah memudahkan transportasi penulis pada masa-masa penulisan, serta seluruh keluarga dan kerabat atas doa, semangat dan kasih sayangnya, juga buat rekan- rekan yang berjuang bersama di Laboratorium BIORIN yaitu Ibu Sri Listyowati, Bu Ratna Yuniati, Pak Ulung, Pak Muzuni, Mbak Hanum, Bu Yohana, Niken, Pak Azis, Pak Neo, Rizky, Mbak Emma, Goto, dan Lulu.
Semoga Allah Bapa membalas kebaikan mereka dan semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat.
Bogor, Juli 2009
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jayapura pada tanggal 2 Januari 1981 dari ayah Drs. F.X. Soewarto Citrotaruno, M.S. dan ibu M.G. Soewarti Pujirahayu, S.E., M.M. Penulis merupakan putri pertama dari dua bersaudara. Pada tahun 2005, penulis menikah dengan Hugo Herdamon Budianto, SP. dan saat ini telah dikaruniai dua orang buah hati yaitu Alexander Dimas Raditya dan Brigita Michelle Radisti.
Tahun 1999 penulis lulus dari SMU Stella Duce I Yogyakarta dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur undangan seleksi masuk IPB (USMI). Penulis memilih Program Studi Biologi, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama menjadi mahasiswa IPB, penulis pernah menjadi panitia Biologi Interaktif dalam rangka Dies Natalis IPB ke-36, dan menjadi pengurus Organisasi Himpunan Mahasiswa Biologi (HIMABIO) periode 2001/2002 dan 2002/2003. Penulis juga menjadi asisten praktikum mata kuliah Biologi Dasar pada semester ganjil tahun ajaran 2002/2003 dan semester genap tahun ajaran 2002/2003, mata kuliah Taksonomi Tumbuhan Berpembuluh pada semester ganjil tahun ajaran 2002/2003, serta mata kuliah Fisiologi Tumbuhan pada semester genap tahun ajaran 2002/2003. Pada bulan Juni hingga Juli 2002, penulis melaksanakan praktik lapangan di Balai Penelitian Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian (BB-BIOGEN) Cimanggu, Bogor. Makalah penulis yang merupakan bagian dari skripsi yang berjudul Growth and Development of Plant Studies in Mango using Paclobutrazol and KNO3 Application menjadi Supporting Paper pada Seminar Nasional X PERSADA di Jakarta pada bulan Juli 2003. Pada tahun 2004, penulis melanjutkan pendidikan strata-2 pada Program Studi Biologi, Sub Program Studi Fisiologi, Genetika dan Biologi Molekuler Tanaman, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Selama menjadi mahasiswa pascasarjana, penulis juga aktif mengikuti simposium-simposium dan seminar-seminar yang berkaitan dengan bioteknologi.
x
DAFTAR ISI
Halaman DAFTAR GAMBAR... PENDAHULUAN Latar Belakang... Tujuan... KAJIAN PUSTAKA Karakter Tibouchina... Pustaka Genom... Bakteriofage Lambda... Vektor Pengklonan Bakteriofage Lambda ... Pengemasan DNA Lambda...BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian... 3 Bahan Penelitian... 3 Metode Penelitian...
Isolasi DNA total tanaman... 3 Pemotongan parsial DNA... 4 Penyisipan nukleotida pada ujung fragmen DNA... 4 Penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor... 4 Pengemasan fage rekombinan... 12 Transveksi fage ke dalam E. coli…………... 12 Eksisi plasmid dari fage ... Isolasi DNA plasmid rekombinan…... 12 Transformasi bakteri... 4 Pemotongan plasmid dengan enzim restriksi EcoRI... HASIL DAN PEMBAHASAN
Pemotongan Parsial dan Penyisipan Nukleotida pada Ujung Fragmen
DNA... 19 Konstruksi Fage Rekombinan... 20 Ukuran DNA Sisipan... 23 Ukuran Pustaka Genom... 25
SIMPULAN DAN SARAN... DAFTAR PUSTAKA... xi 1 2 3 6 7 9 11 12 12 13 14 15 15 15 16 16 16 17 17 18 27 28
xi
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Morfologi tanaman T. langsdorffiana……... 2 Peta genetik bakteriofage ... 3 Penyusunan virus bakteriofage λ... 4 Vektor pengklonan fage BlueSTAR-1... 5 BlueSTAR-1 (Novagen) yang dipotong dengan XhoI dan mengalami
pengisian dengan dCTP dan dTTP pada situs pengklonan…………... 6 Tahapan konstruksi pustaka genom... 7 Fragmen DNA T. langsdorffiana hasil pemotongan parsial dengan
Sau3AI... 8 Seleksi biru-putih terhadap plak... 9 DNA T. langsdorffiana menggantikan daerah lacZ, lambda, EMC, lambda,
EMC dari vektor fage ... 10 Plasmid rekombinan yang dipotong dengan EcoRI...
5 8 10 12 12 13 19 21 23 24
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tibouchina langsdorffiana Baill termasuk ke dalam famili Melastomataceae. Tumbuhan ini berbunga ungu cerah dan merupakan tumbuhan hutan hujan di Mexico, Hindia barat dan Amerika Selatan (Faravani & Bakar 2007).
T. langsdorffiana toleran terhadap pH rendah dan aluminium (Al) tinggi. Tumbuhan ini dapat tumbuh dengan baik pada pH 3. Tumbuhan ini juga toleran terhadap Al hingga konsentrasi 0.8 mM baik pada pH 4 maupun pada pH 3. Pada 1.6 mM Al atau lebih dalam lingkungan pH 4, pertumbuhan panjang akar T. langsdorffiana terhambat walaupun batang dan tunas tidak terhambat pertumbuhannya (Muhaemin 2008). Tumbuhan ini memiliki toleransi terhadap pH rendah dan Al tinggi sehingga tumbuhan ini dapat digunakan sebagai sumber gen toleransi tumbuhan terhadap pH rendah dan Al tinggi. Selain sebagai sumber gen, tumbuhan ini juga dapat digunakan sebagai model toleransi terhadap pH rendah dan Al tinggi. Gen yang diduga bertanggungjawab terhadap toleransi terhadap pH rendah dan Al tinggi dapat diuji di tumbuhan ini dengan metode gene silencing.
Analisis akumulasi Al menunjukkan bahwa tumbuhan ini mampu mengakumulasi 4.5 mg Al tiap gram bobot kering daun dan akar setelah mendapat perlakuan 3.2 mM Al selama dua bulan (Mutiasari 2008). Kemampuannya dalam mengakumulasi Al memungkinkan tumbuhan ini dapat digunakan sebagai fitoremediasi terutama pada lahan yang mempunyai kandungan Al tinggi.
Untuk memanfaatkan gen-gen yang mengendalikan toleransi T. langsdorffiana terhadap pH rendah dan Al tinggi dan kemampuannya dalam mengakumulasi Al, maka bahan genetik tumbuhan ini harus disimpan di dalam pustaka genom. Pustaka genom adalah sekumpulan klon yang mengandung DNA genom total dari suatu organisme. Pustaka genom seharusnya mengandung seluruh sekuen DNA dari suatu organisme (Lodish et al. 2000). Pustaka genom sangat penting untuk menyimpan seluruh informasi genetik yang dimiliki oleh suatu spesies. Selain sebagai penyimpan bahan genetik, pustaka genom juga
2
sangat bermanfaat untuk mengisolasi gen utuh yang mengandung promoter, terminator dan intron untuk mengetahui regulasi ekspresi gen. Peta fisik suatu genom juga membutuhkan pustaka genom, sehingga pustaka genom merupakan bagian yang sangat penting dalam perbaikan genetika tanaman, baik melalui teknologi DNA rekombinan maupun melalui pemuliaan konvensional (Suharsono 2002).
Pustaka genom manusia dan beberapa hewan mamalia, ikan, dan tumbuhan sudah dikonstruksi. Beberapa pustaka genom telah dikonstruksi, seperti pustaka genom kedelai kultivar Slamet yang toleran Al (Suharsono 2002) dan kultivar Lumut yang peka terhadap Al (Suharsono 2007) dalam rangka menyimpan seluruh informasi genetik yang dimiliki oleh kedelai lokal Indonesia. Dari pustaka genom kedelai kultivar Lumut, penapisan dengan pelacak gen penyandi peroksidase dari Arabidopsis telah dilakukan untuk mendapatkan gen utuh penyandi peroksidase dari kedelai (Suharsono et al. 2003). Miftahudin et al. (1998) telah mengkonstruksi pustaka cDNA dari kedelai (MLG3474) melalui mRNA yang diisolasi dari tanaman yang mendapat cekaman kekeringan. Elvawati (1999) telah mengkonstruksi pustaka cDNA tanaman kedelai yang diinduksi cekaman Al. Kurnia (2005) juga telah berhasil mengisolasi gen penyandi glutathione S-transferase dari pustaka genom kedelai kultivar Slamet. Dari pustaka genom varietas tanaman yang sama, fragmen DNA yang mengandung gen penyandi peroksidase juga telah berhasil diisolasi oleh Rachman (2005). Kurniawan (2005), telah berhasil mengisolasi fragmen DNA yang mengandung gen penyandi glutathione S-transferase dari pustaka genom kedelai kultivar Lumut. Dari pustaka genom varietas tanaman yang sama, fragmen DNA yang mengandung gen penyandi peroksidase juga telah berhasil diisolasi oleh Rahmawati (2005).
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk melakukan konstruksi pustaka genom T. langsdorffiana.
Karakter Tibouchina
Genus Tibouchina (sinonim dengan Chaetogastra, Hephestionia, Itatiaia, Lasiandra, Micranthella, Oreocosmus, Pleroma, Purpurella) terdiri dari 300 spesies (Faravani & Bakar 2007). Tibouchina biasa dikenal dengan nama
“princess flower”, “glory bushes” atau kadang-kadang “glory trees” (Judd et al. 2005; Faravani & Bakar 2007). Tanaman ini merupakan tanaman asli di hutan hujan Mexico, Hindia barat dan Amerika Selatan, terutama Brazil. Namanya berasal dari adaptasi tempat asalnya yaitu “Guiana” (Faravani & Bakar 2007).
Tibouchina merupakan anggota famili Melastomaceae (di dalam literatur biasa ditulis Melastomataceae), merupakan tanaman dikotil berbunga, berbiji tertutup (angiospermae). Famili melastomataceae terdiri dari 3000 spesies di neotropika, 1000 di Asia tropis, 240 di Afrika, 225 di Madagaskar (150-166 genus), dan 70 di Thailand (15 genus) (Renner et al. 2001). Melastomataceae kemudian menyebar di India, Australia, Sri Lanka, Asia Tenggara termasuk Filipina dan Taiwan, sampai Papua New Guinea, Pulau Pasifik, Mauritius, Jamaica, dan Amerika Serikat (Renner 1993).
T. langsdorffiana digunakan sebagai tanaman hias karena nilai estetikanya yaitu warna bunga ungu cerah yang sangat menarik. Sebagian besar Melastomataceae dan Memecylaceae memiliki warna bunga ungu, bervariasi dari merah muda sampai magenta. Sebagai contoh, warna bunga ungu umumnya ditemui pada Dichaetanthera, Meriania, Mouriri, Rhynchanthera dan Tibouchina, dimana kebanyakan merupakan akumulator Al (Jansen et al. 2002).
Tanaman ini tumbuh dengan baik pada tanah yang bersifat asam. Jika tanah tidak cukup asam, ujung daun akan seperti terbakar, kemudian menjadi coklat atau bahkan daun akan mati. Jika hal itu terjadi, keasaman tanah dibuat dengan menambahkan sulfur ke tanah di sekitar akar, atau menggunakan pupuk yang bersifat asam. Tanaman ini tidak perlu dipangkas, karena dapat tumbuh menjadi pohon besar (http://www.abc.net.au/gardening/stories/s2040246.htm).
Tibouchina yang berupa semak cantik yang banyak tumbuh di daerah tropis Amerika latin mirip sekali dengan Dissotis canescens yang masih sekerabat
4
yaitu memiliki ciri-ciri semak berkayu lembut, mencapai tinggi 1.5 m dengan lebar tajuk 1 m, bunganya yang besar dan berwarna magenta muncul di bulan Desember sampai April, bunganya unik karena memiliki dua set benang sari yang berbeda satu dengan yang lain, lima di antaranya panjang berwarna ungu dengan ujung melengkung sementara lima lainnya lebih pendek dan berwarna kuning (http://www.plantzafrica.com/plantcd/dissotiscanes.htm).
Perbanyakan T. langsdorffiana ini melalui stek secara vegetatif karena tanaman ini tidak menghasilkan biji. Berbunga melimpah antara bulan Mei sampai Januari. Spesies T. langsdorffiana biasanya memiliki daun yang berbulu halus dengan tulang daun yang menonjol dan memperlihatkan warna bunga ungu menarik sehingga ditanam sebagai hiasan. Nama lokal tanaman ini di kalangan penjual tanaman hias, dikenal dengan nama violet, tibocina/tebocina (Sunda). Kedudukan T. langsdorffiana dalam taksonomi adalah sebagai berikut:
Domain : Eukariota Kingdom : Plantae Subkingdom : Viridaeplantae Filum : Magnoliophyta Kelas : Magnoliopsida Subkelas : Rosidae Ordo : Myrtales Famili : Melastomataceae Genus : Tibouchina
Spesies : Tibouchina langsdorffiana Baill
T. langsdorffiana merupakan tanaman perennial, termasuk herba, semak, atau pohon, tegak, dengan tinggi 0.5 m sampai 25 m (Gambar 1a), daun tunggal (Gambar 1b), bertangkai, duduk daun berhadapan, pertulangan daun menyirip, ujung runcing, pangkal tumpul, tepi rata, bentuk lanset, permukaan bersisik. Bunga T. langsdorffiana merupakan bunga terbatas tipe malai rata (corymbiform cyme) dengan jumlah bunga 5-25 kuntum bunga (Gambar 1c), kelopak (sepal) berjumlah 5 saling bebas, mahkota (petal) berjumlah 5 saling bebas (Gambar 1d), simetri bunga beraturan (actinomorph), benang sari berjumlah 10 saling bebas
(polyandrous) dengan panjang sama, tipe perlekatan tangkai sari dengan kepala sari yaitu versatile, tipe putik syncarp karena memiliki 5 buah karpel yang dipisahkan oleh sekat (septum), tipe kepala putik clavate, sedangkan tipe tangkai putik geneculate (Gambar 1e). Tipe plasentasi bakal buah axial (Gambar 1f), dan merupakan bakal buah tenggelam (inferior), tetapi dalam perkembangannya, bakal buah beserta biji di dalamnya akan gugur sehingga tanaman ini tidak menghasilkan buah dan biji.
Gambar 1 Morfologi tanaman T. langsdorffiana: a. tanaman berupa semak berkayu; b. daun tunggal; c. tipe malai cabang bunga; d. tipe kelopak dan mahkota bunga; e. tipe benang sari dan putik bunga; f. plasentasi bakal buah.
d 2 cm e 1 mm f 1 mm
6
Pustaka Genom
Suatu pustaka gen dapat diartikan sebagai sekumpulan sekuen (urutan) DNA dari suatu organisme yang masing-masing telah di klon ke dalam vektor tertentu untuk memudahkan pemurnian, penyimpanan dan analisisnya. Pada dasarnya terdapat dua macam pustaka gen yang dapat dikonstruksi, tergantung sumber DNA yang digunakan. Jika DNA yang digunakan adalah DNA genomik/kromosom, maka perpustakaan yang dihasilkan disebut pustaka genom. Sementara itu, jika DNA yang digunakan merupakan hasil transkripsi balik suatu populasi mRNA, maka pustaka yang diperoleh dinamakan pustaka complementary DNA (cDNA).
Hasil pengklonan seluruh DNA total dari spesies tertentu disebut dengan pustaka genom. Pustaka genom sangat bermanfaat dalam usaha isolasi dan karakterisasi suatu gen (Cross et al. 1999; Suharsono et al. 2003), dan juga untuk pemetaan gen secara fisik.
Pustaka genom dapat dibuat melalui sintesis cDNA dari mRNA atau DNA genom. Vektor yang diperlukan dalam pembuatan pustaka genom dapat berupa bakteriofage, P1 artificial chromosome (PAC), yeast artificial chromosome (YAC), bacterial artificial chromosome (BAC), atau kosmid, bergantung pada ukuran panjang fragmen DNA (Wahyudi 2001). Pada penelitian ini dipakai vektor pengklonan yaitu fage lambda ( BlueSTAR-1 (Novagen 1997). Fage BlueSTAR-1 adalah vektor yang didesain untuk membuat pustaka genom DNA dengan efisiensi kloning fragmen DNA berukuran 7-20 kb. Vektor mengandung gen untuk seleksi biru/putih yang unik dan cre-loxP yang digunakan untuk autosubkloning (Novagen 1997).
Konstruksi pustaka genom diawali dengan isolasi DNA total. DNA total biasanya dipotong secara parsial menggunakan enzim restriksi Sau3AI atau enzim lain disesuaikan dengan situs yang terdapat pada vektor yang akan digunakan dalam konstruksi pustaka agar mendapatkan fragmen DNA yang berukuran besar. Pemotongan parsial ini menghasilkan fragmen berukuran besar karena tidak semua situs pengenalan suatu enzim restriksi dalam rantai DNA genom terpotong oleh enzim restriksi yang bersangkutan. Fragmen DNA berukuran besar ini kemudian disisipkan ke dalam vektor yang telah dipotong dengan enzim restriksi
tertentu sehingga hasil potongannya cocok dengan fragmen DNA. Untuk menghindari adanya penyatuan kembali (religasi) ujung-ujung potongan biasanya dimodifikasi dengan penambahan nukleotida tertentu (fill-in).
Dalam mengkonstruksi pustaka genom DNA, DNA umumnya dipotong dengan enzim restriksi yang mengenali situs yang terdiri dari 4 pasang basa (pb) (contohnya Sau3AI). Pengenalan dan pemotongan sekuen 4 pb yang spesifik ini akan terjadi rata-rata sekali setiap 44 = 256 pb. Untuk meningkatkan kemungkinan semua daerah genom berhasil diklonkan dan terkandung dalam pustaka genom, DNA genom biasanya dipotong secara parsial untuk menghasilkan fragmen restriksi yang saling tumpang tindih (overlapping) yang berukuran besar, sekitar 20 kb. Vektor fage dapat menampung sekitar 20 kb.
Bakteriofage Lambda
Bakteriofage (atau fage) adalah virus yang menginfeksi bakteri. Satuan dasar virus disebut virion. Virion fage memiliki kepala, yang mengandung genom DNA virus, dan sebuah ekor, yang berfungsi menginfeksi sel inang Escherichia coli (E. coli). Virus hanya dapat memperbanyak diri jika berada di dalam suatu sel inang yang sesuai. Jika berada di luar suatu sistem selular, virus tidak mampu memperbanyak diri karena tidak mempunyai sistem enzim yang dapat digunakan untuk mensintesis partikel virus baru. Diameter virus bervariasi dari 20-300 nm sehingga ukurannya lebih kecil dari sel prokariot yang paling kecil (Yuwono 2008). Bahan genetik virus ada yang berupa molekul DNA dan ada yang berupa RNA. Molekul DNA dan RNA tersebut ada yang berupa molekul untai tunggal dan ada yang berupa molekul untai ganda. Ekspresi genetik virus dilakukan dengan menggunakan sistem enzim yang ada di dalam sel inang. Salah satu jenis bakteriofage yang biasa digunakan sebagai vektor pengklonan adalah bakteriofage . Bakteriofage merupakan virus bakterial yang telah banyak diteliti, dan telah diketahui secara luas mengenai genetika dan biologi molekulernya. Urutan lengkap basa nukleotida bakteriofage ini sudah diketahui. Genom bakteriofage berupa DNA untai ganda linier yang terdiri atas 48502 pb (Chauthaiwale et al. 1992). Molekul DNA bakteriofage ini mempunyai
8
struktur yang unik karena pada kedua ujungnya terdapat 12 basa tambahan berupa molekul DNA untai tunggal. Kedua ujung molekul DNA tersebut dapat membentuk ikatan komplementer jika terjadi pelingkaran DNA, sehingga ujung- ujung DNA tersebut disebut sebagai ujung kohesif (cohesive ends, disingkat COS) (Chauthaiwale et al. 1992).
Fage mempunyai gen-gen penyandi protein yang diperlukan dalam penyusunan kepala dan ekor dan gen-gen yang menyandikan protein yang diperlukan dalam siklus litik yang terdapat di bagian kedua ujung genomnya (Gambar 2). Beberapa daerah di bagian tengah dari genom dapat digantikan oleh DNA eksogen atau dihilangkan tanpa mempengaruhi kemampuan fage λ dalam menginfeksi sel inang dan menyusun virus baru. DNA eksogen yang menyisip diantara gen J dan N bisa berukuran lebih dari 25 kb. Terdapat sekitar 60 gen yang ada di dalam genom λ (Lodish et al. 2000).
Gambar 2 Peta genetik bakteriofage (Lodish et al. 2000).
Bakteriofage menginfeksi E. coli dengan cara menempel pada suatu reseptor spesifik yang terdapat pada permukaan sel E. coli, kemudian menginjeksikan DNAnya (Dale 1994). DNA linier utas ganda diubah menjadi bentuk sirkuler segera setelah terjadi infeksi. Setelah memasuki sel bakteri, ujung kohesif mengalami perpasangan basa membentuk molekul DNA sirkuler, dimana masih terdapat 2 buah nick pada tempat perpasangan basa tersebut. Kedua nick ini ditutup oleh DNA ligase inang sehingga dihasilkan molekul DNA sirkuler seutuhnya. DNA sirkuler ini berfungsi sebagai cetakan dalam proses transkripsi selama fase infeksi awal (Sambrook et al. 1989).
Ketika DNA memasuki sitoplasma sel inang setelah menginfeksi, selanjutnya DNA fage akan mengalami pertumbuhan siklus litik atau lisogenik. Siklus litik menyebabkan lisisnya sel inang dan menghasilkan partikel fage baru, sedangkan siklus lisogenik terjadi karena genom bakteriofage terintegrasi dengan
genom sel inang sebagai profage. Dalam kondisi cekaman nutrisi dan lingkungan, DNA yang terintegrasi dapat dikeluarkan dari kromosom inang dan selanjutnya memasuki siklus litik (Glick & Pasternak 1994). Ketika bakteriofage digunakan sebagai vektor pengklonan, dia mampu mengalami pertumbuhan litik, tetapi fungsi virus lainnya menjadi tidak relevan. Sebagai akibatnya, gen-gen yang terlibat dalam jalur lisogenik dan gen-gen virus lainnya yang tidak penting bagi jalur litik akan dihilangkan dari DNA virus dan digantikan dengan DNA yang akan diklonkan. Bakteriofage ini memiliki efisiensi pengemasan sebesar 78- 108% dari ukuran DNA lambda tipe liar (Chauthaiwale et al. 1992). DNA asing yang berukuran di atas 25 kb dapat disisipkan ke dalam genom , menghasilkan DNA rekombinan yang dapat dikemas secara in vitro untuk membentuk virus- virus yang mampu bereplikasi dan membentuk plak di dalam sel inang E. coli (Lodish et al. 2000).
Vektor Pengklonan Bakteriofage Lambda
Bakteriofage merupakan salah satu vektor untuk konstruksi pustaka genom. Replikasi DNA di dalam sel inang menghasilkan molekul DNA multimerik, yang disebut concatomers, yang terdiri dari kopi-kopi ganda genom virus yang bersambungan dari ujung hingga ujung yang dibatasi oleh sekuen nukleotida spesifik yang disebut situs COS. Dua protein , yaitu Nu 1 dan A, terikat dengan situs COS dan menyisip secara langsung ke DNA di antara dua situs COS yang berdekatan kemudian masuk ke dalam kepala yang akan disusun (Lodish et al. 2000).
Setiap kepala fage mengemas genom tunggal sebesar 50 kb dari concatomers multimerik. DNA kromosom sel inang tidak menyisip ke dalam kepala karena tidak mengandung kopi dari sekuen COS. Kepala dan ekor yang kosong disusun dari kopi-kopi ganda dari beberapa protein λ yang berbeda. Selama fase akhir, membentuk molekul DNA yang panjang yang disebut concatomers. Molekul multimerik ini terdiri dari kopi-kopi genom yang bersambungan dari ujung ke ujung dan dipisahkan oleh situs COS yang merupakan sebuah sekuen nukleotida yang dapat mengikat protein. Setiap kopi
10
dari genom λ mengandung COS. Protein λ Nu1 dan A yang menempel pada situs COS memicu penyisipan DNA diantara dua situs COS yang berdekatan ke dalam kepala yang kosong. Setelah kepala-kepala terisi DNA, ekor yang siap disusun akan menempel, menghasilkan virus λ lengkap yang mampu menginfeksi sel-sel E. coli (Gambar 3).
Gambar 3 Penyusunan virus bakteriofage λ (Lodish et al. 2000).