Tempat dan Waktu Percobaan
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi Kehutanan PAU IPB, Laboratorium Mikologi Departemen Proteksi Tumbuhan IPB, dan Laboratorium LIPI Bioteknologi. Penelitian berlangsung dari Januari 2004 sampai Maret 2005.
Penyediaan Inokulum Fungi
Fungi patogen diperoleh melalui isolasi dari inang yang terinfeksi penyakit daun. Inang yang terinfeksi berasal dari persemaian Pokpolandak milik Perum Perhutani di Cianjur. Pengambilan sampel dilakukan sebanyak dua kali pengambilan sehingga didapat dua isolat patogen. Pengambilan pertama dilakukan pada bulan Maret 2003, sementara pengambilan kedua dilakukan pada bulan Mei 2004.
Patogen diisolasi dari jaringan daun benih suren yang menunjukkan gejala penyakit daun. Daun yang menunjukkan gejala penyakit dipotong persegi ukuran 0,5 x 0,5 cm meliputi bagian sakit dan sehat. Potongan tersebut dibersihkan dengan larutan natrium hipoklorit 1 % lalu dibilas tiga kali dengan air steril kemudian dikeringkan dengan kertas saring steril. Kemudian dibiakkan di dalam media PDA (Patato Dextrose Agar). Patogen yang telah tumbuh dalam beberapa hari dimurnikan kembali dengan media MA (Martin Agar). Patogen yang telah tumbuh dalam beberapa hari dimurnikan kembali di dalam media PDA.
Identifikasi Fungi
Fungi patogen yang telah tumbuh dalam beberapa hari dimurnikan kembali dan diidentifikasi. Identifikasi fisiologi fungi dilakukan dengan menggunakan buku kunci Barnet dan Ogoshi dan Sneh (1991). Proses identifikasi dilakukan dengan menggunakan mikroskop perbesaran 200x – 1000x. Sebelum diidentifikasi, fungi terlebih dahulu diwarnai dengan 2 jenis pewarna, yaitu larutan laktofenol blue dan Safranin O.
Aktivitas Selulolitik dan Pektolitik Fungi Patogen
Enzim merupakan salah satu senjata patogen untuk menyerang jaringan tumbuhan inang. Enzim penghidrolisis selulosa dan pektin diketahui penting perannya dalam patogenesis tumbuhan.
Pada penelitian ini dianalisis aktivitas enzim-enzim selulolitik, yang diwakili oleh aktivitas FP -ase (Filter Paper-ase) atau selulase-C1, dan pektolitik, yaitu aktivitas poligalakturonase, isolat patogen. Glukosa dan asam galakturonat monohidrat berturut-turut digunakan sebagai standar pada penentuan aktivitas selulase-C1 dan poligalakturonase. Prosedur ekstrasi dan pengukuran aktivitas enzim selulolitik dan pektolitik selengkapnya berturut-turut disajikan pada Tabel Lampiran 2 dan 3.
Uji lain untuk mendeteksi produksi pektinase fungi patogen dilakukan dengan menumbuhkan kedua jenis fungi tersebut pada media pektin (Atlas, 1993) dan diinkubasi selama 10 hari. Produksi pektinase ditandai antara lain oleh berubahnya warna media dari hijau kecoklatan menjadi merah.
Optimasi Enzim
Metode yang digunakan untuk mengetahui nilai optimal kerja enzim umumnya terdiri dari tahapan-tahapan : A) ekstraksi, B) pengendapan, C) karakterisasi enzim secara umum.
A. Ekstraksi
Patogen ditumbuhkan pada media cair yang terdiri dari unsur-unsur selulosa (CMC) dan pektin. Sebagai kontrol dan perbandingan digunakan media PDB dan MEB. Enzim yang diektraksi bersifat ekstraseluler sehingga setelah 10 hari, enzim diektraksi dengan cara memisahkan media dan patogen.
i. Presipitasi
Presipitasi atau pengendapan merupakan proses awal dalam pemurnian enzim. Proses ini selain bertujuan untuk memekatkan enzim juga bertujuan unt uk fraksinasi komponen protein enzim berdasarkan sifat-sifat ioniknya. Untuk memisahkan partikel non enzim (contoh : media) dengan enzim maka larutan tiap sampel ditambahkan dengan garam yang dalam percobaan ini menggunakan amonium sulfat. Setiap sampel ada kandungan 20%, 40%, 60% dan 80% amonium sulfat yang dilarutkan. Kemudian masing-masing sampel dengan berbagai tingkatan konsentrasi amonium sulfat disentrifugasi 12.000 rpm selama 15 menit. Setelah disentrifugasi, maka akan terlihat dua jenis zat yang terpisah dalam bentuk pelet (padat) dan supernatan (cair). Keduanya dipisahkan. Bentuk padat (pelet) dicampur dengan 10 mM buffer fosfat sebanyak 1 ml dalam eppendorf.
C. Karakterisasi Enzim
Karakterisasi dilakukan dengan memberikan perlakuan-perlakuan tertentu dari pekatan enzim. Perlakuan-perlakuan tersebut dilakukan supaya mengetahui sifat-sifat enzim yang akan dikarakterisasi. Perlakuan-perlakuan tersebut antara lain adalah pH dan suhu.
Uji Mekanisme Infeksi Secara Umum
Percobaan disusun dalam rancanga n acak lengkap dengan ulangan masing-masing perlakuan sebanyak 4 kali. Satuan percobaannya adalah satu benih suren yang masing-masing ditanam pada satu wadah tanam. Jumlah dari keseluruhan satuan percobaan adalah 60 benih. Benih tersebut dibagi menjadi tig a kelompok perlakuan yaitu perlakuan dengan isolat I, perlakuan isolat II dan perlakuan tanpa isolat. Masing-masing kelompok tersebut dilakukan pengujian penyemprotan tanin dengan 5 taraf yaitu 0%, 0,5%, 1%, 2%, dan 3%. Fungsi tanin sebagai zat inhibitor dari enzim selulase dan pektinase. Langkah-langkah pengujian adalah sebagai berikut :
A. Pembiakan Inokulum.
Biakan murni fungi kembali dibiakkan di dalam media PDB (Patato Dextrose Broth). Selama 5 hari biakan diinkubasi pada suhu ruang dan dishaker dengan kecepatan 150 rpm.
B. Penghitungan Kepadatan Hifa.
Setelah 5 hari, kepadatan hifa fungi dihitung dengan metode Haemacytometer. Setelah nilai kepadatan didapat, biakan diencerkan sampai kepadatannya mencapai 106/ml biakan. Kemudian larutan siap dioleskan pada permukaan daun.
C. Inokulasi Biakan.
Fungi diinokulasi pada daun benih sehat dengan cara dioleskan dengan menggunakan kuas pada setiap daun pada pukul 20.00. Sebelum dioleskan biakan fungi, daun suren sehat disemprot terlebih dahulu dengan larutan tanin pada berbagai taraf. Penyemprotan ini terus dilakukan setelah dioleskan selama satu bulan setiap 2 hari sekali.
Unit perlakuan ditempatkan pada bedeng yang sama dengan ukuran 3 x 6 m dan diberi atap plastik yang dilapisi dengan paranet dengan intensitas cahaya 65%.
D. Pengamatan Gejala Penyakit.
Gejala serangan yang diamati meliputi beberapa peubah yaitu waktu awal terbentuknya hawar sebagai awal terjadinya infeksi dan jumlah daun yang terserang.
Perhitungan intensitas serangan penyakit dengan menggunakan kategori infeksi menurut Unterstenhfer (1976) yaitu seperti terlihat pada Tabel I. Tabel 1. Kategori Tingkat Infeksi (Unterstenhöfer, 1976)
Skoring Keterangan
0 Tidak ada infeksi
1 > 0 – 1/8 dari jumlah anak daun terserang penyakit hawar daun 2 > 1/8 – ¼ dari jumlah anak daun terserang penyakit hawar daun 3 > ¼ – ½ dari jumlah anak daun terserang penyakit hawar daun 4 > ½ – ¾ dari jumlah anak daun terserang penyakit hawar daun 5 > ¾ dari jumlah anak daun terserang penyakit hawar daun
%
100
.
)
.
(
×
=
∑
Z
N
v
n
P
Berdasarkan hasil pengelompokkan dengan cara di atas, dihitung intensitas serangan penyakit hawar daun menurut Townsend dan Heuberger (1943) dalam Unterstenhfer (1976) dengan rumus berikut :
P = Intensitas serangan (%)
n = Jumlah daun untuk setiap katagori v = Nilai numerik katagoris serangan N = Jumlah daun yang diamati
Z = Nilai numerik untuk kategori tertinggi
E. Pengukuran Suhu dan Kelembaban.
Pengukuran suhu dan kelembaban pada bedeng dilakukan setiap hari pada pagi hari (pukul 06.00 – 07.00 WIB), siang (pukul 12.00 – 13.00 WIB) dan sore (pukul 19.00 – 20.00 WIB) dengan menggunakan higrotermometer.
F. Analisis Data.
Analisis statistik untuk penelitian ini menggunakan rancangan faktorial dalam waktu dengan rancangan lingkungan rancangan acak lengkap. Menurut Mattjik dan Sumertajaya (2002), model yang digunakan adalah sebagai berikut:
Keterangan :
= Nilai respon (Intensitas serangan / daun yang mati) pada faktor Isolat taraf ke-i, faktor Tanin taraf ke-j, ulangan ke -k dan waktu pengamatan ke-l = Rataan Umum ijkl ijl jl il kl l ijk ij j i ijkl
Y =µ+α+β +αβ +δ +ω+γ +αω +βω +αβω +ε
ijkl Y µ= Pengaruh faktor Isolat taraf ke -i = Pengaruh faktor Tanin taraf ke -j
= Pengaruh interaksi faktor Isolat taraf ke-I dengan faktor Tanin taraf ke-j
= Komponen acak perlakuan = Pengaruh waktu pengamatan ke-l = Komponen acak waktu pengamatan
= Pengaruh interaksi faktor Isolat taraf ke -i dengan waktu pengamatan ke-l
= Pengaruh interaksi faktor Tanin taraf ke -j dengan waktu pengamatan ke-l
= Penga ruh interaksi faktor Isolat taraf ke -i, faktor Tanin taraf ke-j, dengan waktu pengamatan ke-l
= Komponen acak dari interaksi waktu dengan perlakuan
Selanjutnya dilakukan penghitungan dengan menggunakan sidik ragam dan kemudian dilanjutkan dengan uji jarak berganda Duncan.
Untuk memperjelas faktor pengaruh perlakuan baik isolat, tanin, dan waktu terhadap intensitas penyakit, data kemudian diolah dengan menggunakan metode penyesuaian kurva kuadrat terkecil (least square curve fitting method) dengan mempertiumbangkan koefisiensi determinasi (r2) terbesar (Mattjik and Sumertajaya, 2002).
i α j β ij αβ ijk δ l ω kl γ il αω jl βω ijl αβω ijkl ε