Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dimulai dari bulan Agustus 2005 sampai Agustus 2006. Analisis histologis dan pengukuran nilai keempukan (Warner-Bratzler shear) daging masing-masing dilakukan di Laboratorium Patologi dan Laboratorium Kesehatan Masyarakat Veteriner Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Analisis nitrogen nonprotein (NPN) dan warna daging (CIE L* a* b*) masing- masing dilakukan di Laboratorium Ilmu Nutrisi Makanan Ternak Fakultas Peternakan dan Laboratorium Pengolahan Hasil Pertanian Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
Bahan dan Alat Penelitian
Penelitian ini menggunakan 30 sampel daging dada (M. pectoralis) dan 30 sampel daging paha (M. biceps femoris) ayam pedaging strain Hubbard Broiler yang sudah mencapai masa potong komersial, berumur 45 hari dengan berat karkas 1.5 sampai 1.8 kg. Kendatipun sampel diambil langsung dari tempat pemotongan ayam Pondok Rumput, Bogor, namun dua hari sebelum ayam tiba di tempat pemotongan dilakukan juga pengamatan langsung ke tempat pemeliharaan ayam potong yaitu di wilayah Kecamatan Ciampea, Bogor. Pada saat itu semua ayam memperlihatkan kondisi klinis yang sehat untuk disembelih.
Sampel daging ayam terdiri atas tiga kategori yang berbeda yaitu daging ayam normal yakni berasal dari ayam hidup sehat disembelih (AHS) secara halal, daging ayam bangkai yaitu berasal dari ayam mati disembelih (AMS) dan daging yang berasal dari ayam lemah disembelih (ALS). Ciri-ciri ayam AHS adalah kondisi umum terlihat sehat, mampu berdiri dan berjalan sempurna dengan gambaran mata dan selaput lendir normal. Sampel yang berasal dari AMS adalah bangkai ayam yang telah mati selama satu sampai dua jam. Waktu 1 sampai 2 jam setelah menjadi bangkai dianggap awal kematian atau satu jam postmortem. Sampel untuk waktu 5 dan 9 jam postmortem adalah berasal dari sampel tadi yang telah dibiarkan selama 5 dan 9 jam postmortem pada temperatur kamar. Sampel yang berasal dari ALS diambil dari ayam-ayam yang memperlihatkan kondisi
umum yang lemah yakni tidak mampu berdiri dan berjalan serta sayap terkulai lemah.
Beberapa bahan kimia yang digunakan seperti asam trikhloroasetat atau TCA (CCl3COOH, 807 Merck), asam sulphat (H2SO4, 731 Merck), larutan
formalin 10% dalam bufer normal yang terdiri dari Na2HPO4, NaH2PO4, formalin
absolut dan aquadest. Natrium Hidroksida (NaOH, 9957 Merck), methyl red 6076 Merck) dan Hematoksilin-Eosin.
Alat yang dipakai pada penelitian ini adalah peralatan mikroteknik jaringan yang dilengkapi dengan video mikrometer, peralatan penilaian keempukan daging Warner-Bratzler Shear (InstronTM 5542), Chroma meter CR-300 (Ramsey, NJ), peralatan Kjeldahl untuk analisis NPN, termometer saku (Taylor® N:VD03-6) dan alat ukur nilai impedansi dari digital multimeter modifikasi (DT-830B).
Rancangan Percobaan
Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah rancangan acak lengkap satu arah. Jenis sampel daging merupakan satu-satunya faktor tunggal sedangkan pengukuran setiap peubah dilakukan dalam interval waktu 1, 5 dan 9 jam postmortem (PM) yang berasal dari sampel pada karkas yang sama. Model matematis dari rancangan yang dipakai adalah :
ij
ε
i
τ
μ
ij
Y
=
+
+
Dimana : Yij = perubahan nilai biologis dan impendansi ke j karena perbedaan
daging ayam ke i (i = 1, 2, 3 sedangkan j = 1, 2, 3,……..,10). μ = rata- rata sebenarnya, ti = pengaruh perbedaan daging (AHS, AMS dan
ALS). eij = pengaruh terhadap nilai biologis dan impedansi ke j akibat
perbedaan jenis daging ayam ke i.
Pemeriksaan atau analisis mikroskopis dilakukan hanya terhadap beberapa sampel pada daging dada dan daging paha sesuai dengan waktu postmortem yaitu 1, 5 dan 9 jam pascamati. Dari sejumlah tiga puluh sampel daging dada dan daging paha ayam, maka untuk analisis mikroskopis masing-masing diambil sebanyak empat sampel dari daging dada dan paha AHS, AMS dan dari ALS. Akan tetapi analisis terhadap peubah keempukan (nilai Warner-Bratzler shear, warna (L* a* b*) dan nilai nitrogen nonprotein (NPN) dilakukan replikasi
sebanyak dua kali (duplo) dalam setiap pengujian. Hal ini ditujukan untuk mendapatkan validitas data yang lebih baik.
Disain penelitian adalah seperti yang terdapat pada diagram Gambar 3 berikut ini.
Gambar 3 Disain penelitian penggunaan beberapa metode biologis dan nilai impedansi untuk deteksi daging ayam bangkai. AHS: Ayam hidup disembelih, AMS: Ayam mati disembelih, dan ALS: Ayam lemah disembelih.
Analisis Data
Data dianalisis dengan analisis sidik ragam (ANOVA) satu arah pada tingkat α=0.05 dan dilanjutkan dengan uji perbandingan berganda Duncan dengan menggunakan perangkat lunak SAS® (SAS Institute 1988; Mattjik dan Sumertajaya 2002). Analisis korelasi juga dilakukan untuk menentukan keeratan hubungan antar peubah yang diukur (SAS Institute 1988).
Peubah yang diamati pada penelitian ini adalah yang pertama peubah histologis yang terdiri atas persentase degenerasi dan nekrosa serabut otot, diameter serabut otot (μm), jarak antar serabut otot (μm), gambaran pembuluh darah arteri dan vena serta eksudasi. Peubah kedua adalah angka keempukan daging Warner-Bratzler shear (kgf/cm2), peubah ketiga adalah warna daging (CIE
L* a* b*), peubah keempat adalah angka NPN (%) dan peubah kelima yaitu nilai impedansi (ohm).
Metode Penelitian
Sampel daging dada (M. pectoralis dan daging paha (M. bicepsfemoris) pada 1, 5 dan
9 jam postmortem (n = 30)
AHS
Histologis Keempukan Warna NPN Impedansi
B
A
pe bf 1 1 2 2B
A
pe bf 1 1 2 2Ayam sehat dan yang kondisi lemah disembelih tanpa pemingsanan dengan cara pemotongan pada leher sehingga Arteri carotis communis, Vena jugularis,
trachea dan esophagus ikut terpotong sekaligus (Deptan 1996). Sedangkan penyembelihan pada ayam yang telah mati hanya bertujuan untuk keseragaman perlakuan dengan dua kelompok tadi. Sampel daging dada dan daging paha yang berasal dari ayam mati (AMS) di peroleh sesuai dengan jam kematian yakni 1, 5 dan 9 jam postmortem. Pencabutan bulu dilakukan setelah melewati proses perendaman dalam air panas (scalding) pada temperatur 52 0C (Sams dan Dzuik 1999; Sams 2001). Setelah selesai eviserasi maka bagian dada dan paha dipisahkan sebagai sampel penelitian. Sampel dalam kondisi segar (tanpa pembekuan dan pendinginan) segera dibawa ke laboratorium untuk dianalisis.
Histologi Otot Dada dan Otot Paha
Sampel daging diambil dari otot dada (M. pectoralis) dan otot paha (M. biceps femoris). Untuk pengamatan histologi maka masing-masing daging dada dan daging paha diambil pada bagian kanan atas dari otot dada dengan ukuran sayatan 1 x 1 x 2 cm (López 2004). Jumlah sampel disesuaikan dengan keperluan analisis dan disesuaikan juga dengan jam postmortem pengamatan. Secara anatomis posisi pengambilan sampel adalah seperti tertera pada Gambar 4.
Gambar 4 Sampel daging yang berasal dari otot dada M. pectoralis (pe) (A), dan yang berasal dari otot paha M. biceps femoris (bf) (B) ayam broiler. Otot bagian kanan (1) pada daging dada dan bagian atas pada daging paha untuk analisis mikroskopis dan uji nilai WB, sedangkan otot bagian kiri (2) pada daging dada dan bagian bawah pada daging paha untuk analisis warna, NPN dan nilai impedansi.
Sampel daging dada (M. pectoralis) dan daging paha (M. biceps femoris) sesuai dengan jam postmortem disayat dan langsung dimasukkan ke dalam larutan fiksasi yaitu larutan formalin 10% dalam bufer normal. Sampel daging selanjutnya diproses sesuai dengan prosedur mikroteknik dan diwarnai dengan memakai pewarnaan standar Hematoksilin-Eosin (Kiernan 1990; Witkiewicz et al. 2004). Dengan menggunakan perangkat video mikrometer, dilakukan pengamatan dan pengukuran pada potongan melintang otot dengan luas pandang 222 x 300 µm pada pembesaran 20x dan jumlah setiap pengamatan adalah 10 lapang pandang. Pengamatan dan pengukuran dibagi tiga bagian yaitu pada serabut otot (lesio degenerasi dan nekrosa, diameter serabut otot), jaringan penunjang (jarak antar serabut otot dan persentase eksudasi). Degenerasi otot hanya dibatasi pada serabut otot yang membengkak (swelling), membulat, dan hipereosinofil dan kehilangan striasi otot. Sedangkan nekrosis dibatasi pada serabut otot yang telah kehilangan sebagian atau seluruh sitoplasmanya dan terbentuk vakuola (Lopez 2004). Semua pengukuran dilaksanakan dengan menggunakan rumus sebagai berikut :
1. % 100% otot serabut otot serabut /nekrosa degenerasi /nekrosa degenerasi lesio × Σ Σ = ∑
2.Diameter serabut otot =Xdiameter serabut otot pada AHS,AMSdan ALS. 3. Jarak antar serabut otot = Xjarak antar serabut otot padaAHS, AMS dan ALS
Sedangkan terhadap jaringan penunjang dihitung persentase eksudasi dan jarak antar serabut otot (muscle fiber intertitials). Setiap satu lapang pandang terdapat 10 sisi yang diukur (Gambar 5).
Gambar 5 Pengukuran jarak antar serabut otot ditandai oleh garis dengan ujung tanda panah (a) dan diameter serabut otot yang ditandai oleh garis dengan ujung bulat (b).
a
Pengamatan secara deskriptif juga dilakukan terhadap besar kecilnya kongesti di dalam pembuluh darah arteri dan vena.
Penilaian Angka Keempukan Daging (Warner-Bratzler Shear atau nilai WB) Uji nilai keempukan daging dada dan daging pahadilakukan sesuai dengan metode Warner-Bratzler shear dari InstronTM. Persiapan uji keempukan daging adalah sebagai berikut: sampel daging dada dan daging paha dimasak di dalam panci aluminium pada temperatur internal daging 80 oC selama 20 menit. Pemasakan dilakukan dengan cara daging ditempatkan di dalam plastik tahan panas sehingga daging tidak bercampur dengan air. Setelah dibiarkan dingin pada temperatur kamar, dengan menggunakan selongsong khusus dari InstronTM (sample coring tool) ukuran 12.5 mm (Instron 2003), maka pengambilan sampel dilakukan searah dengan panjang serabut otot baik pada otot dada maupun pada otot paha, sehingga berbentuk bulat homogen. Pemotongan dilakukan pada temperatur kamar 25 oC dan pada kecepatan 250 mm/menit dengan ulangan dua kali. Hasil pengukuran adalah nilai Warner-Bratzler shear (WB) yaitu kgf/cm2 seperti tertera pada Gambar 6 (Fletcher 1999; Kerth et al. 2003). Angka yang digunakan sebagai nilai keempukan daging adalah kekuatan terbesar yang dibutuhkan untuk memotong sampel daging ayam (Instron 2003). Nilai tertinggi terlihat pada tampilan hasil berupa grafik atau kurva seperti terlihat pada layar monitor komputer.
Gambar 6 Contoh hasil pengukuran nilai keempukan daging dengan menggunakan metode Warner-Bratzler shear yang ditandai oleh tampilan grafik hasil pemotongan sampel daging.
Pengukuran Warna Daging (CIE L* a* b*)
Daging dada (M. pectoralis) yang terdapat pada sisi kiri anterior dan daging paha (M. biceps femoris) disayat dengan ukuran 3x3x0.5 cm. Pemilihan ketebalan 0.5 cm adalah untuk menghindari refleksi yang tinggi dari latar belakang standar yang digunakan, sehingga akan merefleksikan nilai sebenarnya dari sampel (Sandusky dan Heath 1996). Pengukuran warna dilakukan pada kondisi segar (fresh raw meat) tanpa pemanasan, penyimpanan dingin ataupun pembekuan sebelumnya. Area atau bidang yang dipilih untuk penilaian warna adalah area yang bebas dari berbagai kelainan seperti hemorhagi dan pembuluh darah. Penilaian dilakukan dengan ulangan dua kali dari sisi medial. Dipilih dari sisi medial untuk menghindari adanya perubahan warna yang mungkin dapat disebabkan oleh proses skalding. Kalibrasi peralatan sebelumnya dilakukan dengan menggunakan ubin keramik standar putih (Y = 93.7, x = 0.3139, dan y = 0.3197). Warna daging diukur secara objektif dengan menggunakan Minolta Reflectance Chroma Meter (CR-300) sebanyak dua kali ulangan dan kemudian dilaporkan sebagai sistem CIE L* (kecerahan atau lightness), a* (kemerahan atau
redness) dan b* (kekuningan atau yellowness) (Fletcher 1999; Petracci dan Fletcher 2002).
Pengukuran Nitrogen Nonprotein (NPN)
Penentuan nilai nitrogen nonprotein (NPN) sampel daging dilakukan sesuai dengan metode Kjeldahl (Sasaki et al. 1983). Sampel daging dapat disimpan pada -20 oC menunggu waktu analisis, atau dapat langsung dianalisis seperti pada penelitian ini. Prosedurnya adalah sejumlah 5 g jaringan otot yang telah dihancurkan ditambah 25 ml aquades, disaring dan suspensi dikocok dan didiamkan selama 20 menit. Ditambahkan 10 ml asam trikhloroasetat (trikhloroacetic acid) (TCA) 10% sebagai deproteinizing agent, dikocok selama 10 menit dan dibiarkan selama 3 jam pada temperatur kamar. Supernatan disaring dengan kertas Whatman 41 dan dipisahkan.
Proses selanjutnya adalah destruksi yaitu pemecahan supernatan tadi oleh H2SO4 pekat panas dengan bantuan katalis campuran selen. Senyawa N yang
terdapat dalam sampel akan terikat sebagai senyawa amonium sulfat (NH4)2SO4
yang berwarna kuning kehijauan jernih.
Tahap selanjutnya adalah destilasi dengan cara hasil destruksi dimasukkan ke dalam labu destilasi yang telah diisi dengan batu didih, diencerkan dengan aquades, tambahkan lagi NaOH 33% untuk kemudian dihubungkan lagi dengan cepat ke pipa destilasi. Hasil destilasi berupa NH3 dan air ditangkap dengan
Erlenmeyer yang telah diisi dengan H2SO4 0.3 N dan indikator Metil Red dan
Metil Blue 1:1. Proses destilasi dilakukan hingga semua N yang ada di dalam labu destilasi telah tertangkap oleh H2SO4 yang ada dalam Erlenmeyer. Proses ini
berakhir setelah terjadi letupan-letupan pada labu destilasi.
Tahap terakhir adalah titrasi yaitu kelebihan asam yang tertangkap dititer dengan larutan NaOH standar dengan cara labu Erlenmeyer yang berisi hasil sulingan diambil dan kelebihan H2SO4 0.1 N dititer kembali dengan larutan NaOH
0.1 N. Proses titrasi berhenti setelah perubahan warna dari biru ke warna kehijauan yang menandakan titik akhir titrasi. Dengan titrasi maka persentase dapat dihitung dengan menggunakan rumus berikut ini :
% 100 x gram ) X ( 14 x NaOH N x ) Z Y ( NPN % = −
Keterangan : Y = volume blanko, dan Z = volume NaOH yang dibutuhkan untuk mentitrasi contoh.
Pengukuran Nilai Impedansi
Pengukuran nilai impedansi sampel daging dilakukan dengan menggunakan alat ukur yang dinamakan impedansi meter. Alat impedansi meter ini merupakan hasil modifikasi Budianto (2004) dari Bagian Geofisika dan Meteorologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor (Gambar 7).
Alat ini merupakan modifikasi dari sebuah Multimeter standar berbasis arus bolak balik. Setelah mengalami modifikasi pada akhirnya dapat mengalirkan arus listrik searah (alternating current) dan dengan menggunakan tenaga dari 2 batere kering berbentuk kotak tipe S-006P(SG)6F22, masing-masing memiliki daya 9 Volt yang bertujuan supaya energi dari salah satu batere dapat membangkitkan medan magnit pada jaringan otot atau daging yang diukur, sedangkan batere yang
ke dua berguna untuk menghidupkan layar pada alat multimeter, sehingga angka impedansi yang terukur dapat dibaca pada layar monitor alat tersebut. Untuk kalibrasi peralatan dapat dilakukan pengukuran pada resistor dengan hambatan 1 atau 2 ohm.
Gambar 7 Contoh alat ukur impedansi meter hasil modifikasi dari multimeter standar. Layar monitor (a) dan sensor elektroda (b).
Nilai impedansi dihasilkan setelah alat impedansi meter diaplikasikan dengan cara ditusuk ke dalam otot atau ke dalam daging ayam dengan jarak antara ke dua ujung elektroda dijaga tetap konstan yaitu 2.5 cm dengan kedalaman elektroda yang masuk adalah 2 cm. Nilai impedansi (Z) yang terukur dinyatakan dalam satuan ohm (Ω).
.