Tempat dan Waktu Penelitian
Sampel berupa tanaman wortel bergejala umbi bercabang dikoleksi dari Agropolitan Cianjur, Jawa Barat. Daerah ini memiliki ketinggian 1300 m dpl, 1500 m dpl dan 1600 m dpl dan merupakan salah satu sentra produksi wortel di Jawa Barat. Identifikasi nematoda dilakukan di Laboratorium Nematologi Tumbuhan dan Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilakukan dari bulan Mei 2012 hingga April 2013.
Metode Penelitian Pengamatan Gejala Penyakit Tanaman Wortel
Pemilihan lahan dan pendataan. Lahan yang digunakan untuk pengambilan sampel wortel adalah sentra produksi wortel di Jawa Barat yaitu Agropolitan Cipanas mempunyai ketinggian antara 1300 m dpl dan 1600 m dpl. Pada saat pengambilan sampel dilakukan pendataan untuk mendapatkan informasi tentang lokasi kebun, luas kebun, ketinggian tempat, jenis tanah, varietas wortel yang ditanam dan teknik budidaya.
Pengambilan sampel. Sampel yang diambil berupa umbi wortel bercabang dan berpuru. Sampel umbi yang bergejala diusahakan dalam keadaan lembab dan disimpan dalam kantung plastik secara terpisah, kemudian dimasukkan ke dalam kantung plastik atau kertas yang dilapisi parafilm untuk menghindari sampel kering dan diberi label yang berisi keterangan tentang lokasi, ketinggian dan tanggal pengambilan sampel (Bezooijen 2006). Sampel diletakkan dalam box
untuk mencegah terjadinya kerusakan akibat fluktuasi suhu dan kelembapan selama perjalanan ke Laboratorium Nematologi Tumbuhan.
Pendataan. Pendataan dilakukan untuk memperoleh informasi awal mengenai lokasi kebun, ketinggian tempat, luas kebun, varietas wortel yang ditanam, produksi per hektar, tipe puru, keberadaan wortel bercabang, hairy root, teknik pengolahan tanah, kedalaman pengolahan tanah, jenis tanah, asal irigasi, serta penggunaan pupuk dan nematisida. Hasil pendataan dimaksudkan untuk dapat memberikan informasi tambahan tentang kondisi wilayah serta keberadaan gejala penyakit di lahan pengamatan.
Identifikasi gejala penyakit pada tanaman wortel. Identifikasi dilakukan terhadap gejala penyakit yang terjadi pada bagian tajuk dan perakaran tanaman. Gejala pada bagian tajuk yang amati berupa tinggi tanaman (kerdil), warna daun dan kelayuan pada siang hari, sedangkan gejala pada bagian perakaran/ umbi berupa bentuk, ukuran puru, dan hairy root.
13
Identifikasi Meloidogyne spp. Berdasarkan Morfologi
Identifikasi dilakukan dengan pengamatan pola sidik pantat (perineal pattern) nematoda betina dewasa. Pembuatan preparat nematoda betina sebanyak 150 slide menggunakan metode Eisenback et al. (1981). Prosedur pembuatan preparat sidik pantat nematoda betina dijelaskan gambar 5. Akar atau umbi yang terinfeksi Meloidogyne dicuci untuk menghilangkan partikel tanah yang menempel. Nematoda betina yang terdapat di dalam jaringan akar yang berpuru dicungkil dengan hati-hati. Bagian anterior dipotong dengan pisau khusus kemudian bagian posterior ditekan agar kandungan di dalamnya keluar. Potongan dipindahkan dalam laktafenol dingin (0.03% cotton blue). Bagian posterior
disayat dan disisihkan bagian sidik pantatnya kemudian jaringan di dalamnya dibuang secara hati-hati dengan sikat khusus. Sidik pantat kemudian dipindahkan ke gelas objek lain dengan ditetesi laktofenol 0.1% (cotton blue). Gelas objek direkatkan dengan Zut (Glycell) atau kutek kuku. Bagian perineal diamati di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 400x dan diidentifikasi berdasarkan kunci identifikasi Meloidogyne (Eisenback et al. 1981).
Identifikasi Meloidogyne spp. Berdasarkan Sekuen Nukleotida
Ekstraksi DNA. Puru akar direndam selama 24 jam kemudian puru akar dibedah dengan menggunakan jarum bedah dan diekstraksi menggunakan metode Hikmia et al. (2012) yang telah dimodifikasi. Dua puluh ekor nematoda betina dimasukkan ke dalam tabung mikro. Sampel tersebut ditambah buffer ekstrak (200 mM Tris HCl pH 8.0, 25 mM EDTA pH 8.0 dan 0.5% SDS) sebanyak 150 µl dan digerus hingga halus dengan cornical grinder steril. Selanjutnya, ditambah chloroform : isoamilalkohol (24:1) sebanyak 150 µl dan disentrifugasi dengan kecepatan 11 000 rpm selama 10 menit. Supernatan diambil 100 µl kemudian dimasukkan ke dalam tabung mikro baru, ditambah larutan Sodium Asetat (CH3COONa) 3M pH 5.2 sebanyak 50 µl dibolak-balik kemudian disimpan pada suhu -20 oC selama 10 menit. Setelah itu suspensi disentrifugasi dengan dengan kecepatan 12 000 rpm selama 20 menit. Supernatan diambil sebanyak 100 µl dan
a b c d
e f
Gambar 5 Prosedur pembuatan preparat sidik pantat Meloidogyne
14
dipindahkan ke dalam tabung mikro baru. Isopropanol ditambah 1 volume ke dalam tabung, dibolak-balik dan disimpan pada suhu ruang selama 30 menit kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 12 000 selama 20 menit. Supernatan dibuang dan ditambah ethanol 80% sebanyak 1 volume kemudian disentrifugasi pada kecepatan 12 000 selama 15 menit dan supernatan dibuang. Endapan DNA dikeringkan, ditambah buffer TE pH 8 sebanyak 30 µl hingga 100 µl sesuai dengan ketebalan endapan DNA dan disimpan pada suhu -20 oC hingga digunakan.
Polymerase Chain Reaction. Setiap reaksi PCR yang menggunakan primer
spesifik spesies terdiri dari 12.5 µl 2x Go Taq®Green Master mix (Promega), 1 µl primer Forward 10 µM, 1 µl primer Reverse 10 µM, 1 µl DNA template dan 9.5 µl air bebas nuklease sehingga volume menjadi 25 µl.
Reaksi PCR yang menggunakan primer multipleks spesies terdiri dari 12.5 µl 2x Go Taq®Green Master mix (Promega), 1 µl primer Forward JMV1 10 µM, 1 µl primer Reverse JMV2 10 µM, 1 µl primer Reverse JMV hapla 10 µM, 1 µl DNA template dan 8.5 µl air bebas nuklease sehingga volume menjadi 25 µl. JMV1 dan JMV hapla akan menghasilkan pita berukuran 440 pasang basa (pb) menunjukkan Meloidogyne hapla sedangkan JMV1 dan JMV2 akan menghasilkan pita berukuran 540 pb (M. chitwoodi) dan 670 pb (M. fallax).
Amplifikasi DNA menggunakan teknik PCR dengan primer spesifik spesies
M. javanica, M. incognita, M. arenaria, dan multipleks primer untuk M. hapla, M. chitwoodi, M. fallax (Tabel 1) (Adam et al. 2007).
Mesin PCR (thermo cycle) diprogram sesuai dengan primer yang digunakan. Proses amplifikasi DNA nematoda dilakukan melalui lima tahap, yakni denaturasi, annealing, extension/ elongation, final elongation, dan final hold. Proses denaturasi pada suhu 94 oC selama 4 menit, extension/ elongation
pada suhu 72 oC selama 1 menit, final elongation pada suhu 72 oC selama 7 menit, dan final hold 4 oC untuk setiap DNA spesies Meloidogyne memerlukan suhu dan waktu yang sama, hanya proses annealing yang berbeda untuk setiap DNA spesies yang diuji. Proses annealing spesies M. javanica pada suhu 55 oC selama 45 detik, M. incognita pada suhu 57 oC selama 45 detik, M. arenaria pada suhu 55
Tabel 1 Primer yang digunakan untuk identifikasi spesies Meloidogyne asal Cianjur, Jawa Barat
Kode Sekuen (dari ujung -5’ ke -3’) Ukuran pita hasil PCR
Spesies NPA
Fjav GGTGCGCGATTGAACTGAGC 720 pb M. javanica
Rjav CAGGCCCTTCAGTGGAACTATAC
Finc CTGGCGATAGAGGTAAATGAC 999 pb M. incognita
Rinc TCGGCGATAGACACTACAAACT
Far TCGGCGATAGAGGTAAATGAC 420 pb M. arenaria
Rar CTGGCGATAGACACTACAAAACT JMV1 GGATGGCGTGCTTTCAAC 540 pb 670 pb 440 pb M. chitwoodi JMV2 TTCCCCCTTACGATGTTTACCC M. fallax JMV hapla AAAAATCCCCTCGAAAAATCCACC M. hapla
15
o
C selama 45 detik dan M. hapla pada suhu 50 oC selama 30 detik (Adam et al.
2007) (Tabel 2).
DNA nematoda hasil amplifikasi dianalisis dengan elektroforesis. Larutan agarosa 1% [0.4 g agarosa dimasukkan ke dalam 40 ml buffer TBE (Tris-HCl 45 mM, asam borat 45 mM, dan EDTA 1 mM) 0.5 x selanjutnya dipanaskan dengan
microwive oven selama ± 2 menit. Dalam keadaan hangat ditambah 2 µl Ethidium bromide kemudian larutan agarosa dituang ke dalam gel box yang dipasang sisir (comb) pada ujungnya untuk membuat sumuran. Gel agarosa dibiarkan dingin selama 1 jam pada suhu ruang. Setelah gel memadat, sisir dicabut sehingga terbentuk lubang-lubang kecil/ sumuran.
Pengukuran DNA menggunakan penanda TriDyeTM-Promage 100 pb
ladder untuk M. javanica, M. arenaria, dan M. hapla dan TriDyeTM-Promage 1000 pb ladder untuk M. incognita. Masing-masing sampel diisi pada sumuran gel sebanyak 10 µl menggunakan mikropipet dan marker sebanyak 8 µl.
Setelah DNA dan marker dimasukkan ke dalam sumur gel, gel box ditutup dan dialirkan arus listrik. Kutub yang sejajar dengan lubang sampel DNA berupa kutub negatif, sedangkan kutub yang lainnya positif. Elektroforesis dilakukan pada tegangan 50 Volt selama 60 menit kemudian dilanjutkan 100 Volt selama 5 menit. Hasil elektroforesis divisualisasi dengan UV transiluminator dan gambar pita-pita DNA difoto dengan kamera digital (Hikmia et al. 2012).
Perunutan DNA. Perunutan dilakukan oleh PT Macrogen Incorporation Seoul, Korea Selatan menggunakan pasangan primer spesifik M. javanica dan primer multipleks M. hapla. Hasil sekuensing dianalisis menggunakan program
Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) dengan program optimasi untuk mendapatkan urutan basa DNA yang terdapat dalam situs National Center for Biotechnology Information (NCBI). Sekuen identity didapatkan dengan menggunakan software Clustal W (Bioedit), sedangkan pohon filogenetik didapatkan dengan menggunakan software MEGA dan Neighbour Joining (NJ) 1000 bootstrap.
Tabel 2 Amplifikasi fragment ITS-rDNA spesies Meloidogyne menggunakan PCR
Spesies Denaturasi awal
Denaturasi Annealing Elongation Final elongation Jumlah siklus M. javanica 94 ºC (4’) 95 ºC (4’) 94 ºC (4’) 94 ºC (2’) 94 ºC (30’’) 55 ºC (45’’) 72 ºC (1’) 72 ºC (7’) 4 ºC 30 M. incognita 94 ºC (30’’) 57 ºC (45’’) 72 ºC (2’) 72 ºC (10’) 4 ºC 35 M. arenaria 94 ºC (30’’) 55 ºC (45’’) 72 ºC (1’) 72 ºC (7’) 4 ºC 35 M. hapla 94 ºC (30’’) 50 ºC (30’’) 72 ºC (1.5’) 72 ºC (7’) 4 ºC 45
16