Survei dan Gejala Penyakit Nematoda Puru Akar (NPA)
Agropolitan Cianjur terletak di Kabupaten Cianjur, Jawa Barat yang merupakan salah satu sentra produksi wortel Indonesia. Selain memproduksi wortel, daerah ini juga memproduksi tanaman sayuran lainnya, seperti bawang daun, lobak, brokoli, tomat, cabai rawit, cabai besar.
Gejala penyakit umbi bercabang pada wortel yang ditemukan di Agropolitan Cianjur antara lain: umbi pecah, umbi bercabang, umbi pendek membulat dan umbi berambut. Gejala ini memiliki kesamaan dengan gejala yang terdapat di pertanaman wortel Jawa Tengah (Taher et al. 2012) dan Jawa Timur (Hikmia et al. 2012). Pola penyebaran infeksi di lapang terjadi pada titik tertentu dan mengelompok.
Teknik budidaya wortel pada setiap ketinggian berbeda-beda. Ketinggian 1300 m dpl, petani menanam wortel lebih ke arah monokultur (Gambar 6d) sedangkan ketinggian 1500 m dpl dan 1600 m dpl petani melakukan rotasi tanam, salah satunya dengan tanaman brokoli. Petani wortel juga melakukan tumpang sari dengan bawang daun.
Dalam memelihara tanaman, petani menggunakan pupuk sintetik dan pupuk kandang (pukan). Pukan yang digunakan salah satunya adalah kotoran ayam.
Gambar 6 Gejala penyakit NPA pada pertanaman wortel Cianjur, Jawa Barat: a) umbi bercabang; b) ketinggian 1600 m dpl; c) ketinggian 1500 m dpl; d) ketinggian 1300 m dpl
a b
d c
17
Petani menilai bahwa selain menyuburkan tanah, pukan ayam juga dapat meningkatkan produksi wortel. Hasil penelitian Sudirman (2011); Akhtar dan Malik (2000) menyatakan bahwa pukan ayam mengandung senyawa amonia dan asam nitrit yang dikeluarkan secara langsung bersifat nematisidal sehingga mampu mengurangi jumlah penetrasi akar oleh M. javanica, menekan perkembangan nematoda dan meningkatkan pertumbuhan tanaman.
Tekstur tanah di lokasi pengambilan sampel adalah lempung berpasir. Tekstur tanah ini sesuai untuk pertumbuhan tanaman wortel juga sesuai untuk habitat spesies Meloidogyne.
Tipe Gejala NPA pada Umbi Wortel
Petani wortel di Agropolitan Cianjur mengalami kendala dalam peningkatan produksi wortel, salah satu penyebabnya adalah penyakit umbi bercabang. Penyakit ini disebabkan oleh nematoda puru akar. Di samping menyebabkan umbi bercabang, nematoda ini juga menyebabkan gejala lain seperti umbi pecah dan umbi pendek membulat (Gambar 7). Gejala tersebut lebih mengarah ke malformasi dari bentuk normal umbi.
Umbi bercabang ditandai dengan bentuk umbi yang abnormal, dimana terdapat satu atau lebih percabangan (Gambar 7a). Gejala berikutnya adalah umbi pecah, bagian stele umbi tampak jelas (Gambar 7b). Biasanya pada bagian permukaan umbi kasar, jika dibedah terdapat NPA betina di dalamnya dan terkadang terdapat rambut akar yang berpuru. Umbi pecah diduga karena rangsangan hormon IAA untuk terjadi hipertropi dan hiperplasia sehingga permukaan kulit umbi tidak bisa mengimbangi pertumbuhan dan perkembangan umbi wortel secara keseluruhan. Hal ini diperkuat dari bagian umbi yang pecah terdapat puru yang bentuknya seperti kudis.
Tipe gejala umbi lainnya adalah umbi pendek membulat (Gambar c). Umbi wortel tumbuh abnormal dengan bentuk yang nyaris bulat dan mengerdil. Bagian umbi yang membulat terkadang dipenuhi hairy root dengan puru kecil di sepanjang rambut akar dan membentuk puru dengan ukuran yang lebih besar.
Gambar 7 Gejala umbi wortel yang terinfeksi NPA: a) umbi bercabang, b) umbi pecah, c) pendek membulat
18
Letak puru akar yang ditemukan pada umbi wortel bervariasi, seperti puru yang ditemukan pada hairy root, puru bulat berukuran besar pada akar dan puru menempel pada permukaan umbi wortel. Pertama, puru menempel pada permukaan umbi wortel (Gambar 8a). Sejumlah puru bergabung membentuk puru dengan ukuran yang lebih besar menempel pada permukaan umbi wortel. Kedua, puru bulat berukuran besar (Gambar 8b).
Identifikasi spesies Meloidogyne Berdasarkan Morfologi
Puru berwarna krem hingga coklat kehitaman. Perubahan warna puru dipengaruhi oleh lamanya infeksi hingga jaringan puru mengalami nekrosis. Terakhir adalah puru terdapat pada hairy root (Gambar 8c). Jumlah akar yang tumbuh lebih banyak dan tidak seperti pada wortel yang tumbuh normal, kemudian di sepanjang hairy root terdapat puru dengan bentuk bulat kecil dan berwarna krem. Berdasarkan Eisenback et al. (1981) M. hapla cenderung membentuk puru lebih kecil dan memiliki banyak percabangan, dimana sistem perakaran lebih tebal dan menyusut.
Spesies Meloidogyne Berdasarkan Morfologi
Berdasarkan identifikasi morfologi (perineal pattern) ada empat spesies nematoda yang menginfeksi pertanaman wortel di Agropolitan Cianjur yaitu M. incognita, M. arenaria, M. javanica dan M. hapla. Keempat spesies ini juga ditemukan pada pertanaman wortel di Jawa Tengah (Taher et al. 2012) dan Jawa Timur (Hikmia et al. 2012).
Masing-masing spesies Meloidogyne spp. diidentifikasi berdasarkan ciri khas yang dimilikinya. M. javanica hampir mirip dengan M. arenaria yang membedakan adalah garis pemisah dan penghubung antara lengkung dorsal dan lengkung ventral. M. javanica terdapat garis lateral yang memisahkan antara lengkung dorsal dan lengkung ventral (Gambar 9a). M. arenaria memiliki ciri yaitu pertemuan lengkung dorsal dan ventral seperti bahu, ujung tonjolan kutikula bercabang seperti garpu (Gambar 9b). M. incognita memiliki ciri lengkung dorsal (arch dorsal) membentuk persegi (sudut ±90o) (Gambar 9c). M. hapla terdapat
Gambar 8 Letak puru pada perakaran wortel: a) puru menempel pada umbi wortel; b) puru bulat berukuran besar; c) hairy root
19
Gambar 9 Hasil identifikasi pola sidik pantat NPA: a) M. javanica; b) M. arenaria;
c) M. incognita; d) M. hapla
tonjolan seperti duri di atas anus dan sering membentuk sayap pada bagian lateral baik pada satu ujung atau pada kedua ujungnya (Gambar 9d).
Hasil identifikasi morfologi NPA betina dewasa menunjukkan ada empat spesies NPA yang menginfeksi pertanaman wortel di Agropolitan Cianjur dengan ketinggian 1300 m dpl dan 1500 m dpl, yakni M. incognita, M. javanica, M. arenaria dan M. hapla. Nematoda yang teridentifikasi pada ketinggian 1600 m dpl yaitu M. javanica, M. arenaria dan M. hapla (Tabel 3).
Prevalensi spesies Meloidogyne spp. berdasarkan ketinggian tempat menunjukkan spesies M. hapla dan M. javanica lebih dominan pada ketiga ketinggian.
Spesies Berdasarkan PCR dan Sekuen Nukleotida
PCR menggunakan primer spesifik spesies M. javanica terhadap sampel NPA dari Jawa Barat berhasil mengamplifikasi pita DNA berukuran 720 pb (Gambar 10) pada ketinggian 1300 m dpl dan 1500 m dpl. Hasil ini mengindikasi bahwa NPA yang telah diteliti merupakan salah satu isolat M. javanica.
a b c d
Tabel 3 Prevalensi distribusi NPA berdasarkan ketinggian tempat di Agropolitan Cianjur, Jawa Barat
Spesies Meloidogyne Ketinggian tempat (m dpl)
1300 1500 1600
M. arenaria 14 14.3 24
M. javanica 36 28.5 34
M. incognita 22 14.3 0
20
Hasil amplifikasi PCR diperkuat oleh hasil analisis homologi sekuen nukleotida. Sekuen nukleotida NPA asal Cianjur, Jawa Barat memiliki tingkat kemiripan yang sangat tinggi (homologi 91.9%) dengan spesies M. javanica asal Cina, sedangkan dengan spesies lain (M. hapla, M. arenaria dan M. incognita) tingkat kemiripan hanya sebesar 35.7% hingga 40.1% (Tabel 4). Hal ini memperkuat hasil identifikasi, bahwa spesies Meloidogyne asal Cianjur, Jawa Barat adalah M. javanica.
M. javanica M. javanica M. hapla M. hapla
Tabel 4 Homologi sekuen nukleotida DNA M. javanica Cianjur, Jawa Barat dengan sekuen DNA yang ada di GenBank
Isolat No Aksesi Homologi M. javanica Cianjur (%)
M. javanica Cina JN005839.1 91.9
M. arenaria EF612714.1 35.7
M. incognita KF053036.1 35.7
M. hapla 40.1
Keterangan: Matriks identitas sekuen diperoleh dengan menggunakan software Bioedit 7.1.3
Gambar 10 Hasil amplifikasi DNA Meloidogyne isolat Cianjur, Jawa Barat menggunakan primer spesifik a) M. javanica; b) M. hapla. Sampel terdiri dari M: Marker 1 kb; K (-): Tanaman sehat; Sampel dari beberapa ketinggian tempat: 1.3, 1.5, 1.6 (km)
Gambar 11 Pohon filogenik spesies M. javanica yang menginfeksi pertanaman wortel di Cianjur, Jawa Barat
M javanica Spanyol2 M javanica Australia M javanica Spanyol M javanica Iran M javanica Brazil M javanica Brazil2 M javanica Amerika2 M javanica Amerika M javanica Cianjur M javanica Cina M javanica Cina2 M hapla 0.5 a b M. javanica M. javanica M. javanica M. javanica M. javanica M. javanica M. javanica M. javanica M. javanica M. javanica M. javanica M. javanica M. hapla
21
Berdasarkan analisis filogenetik M. javanica asal Cianjur, Jawa Barat menjadi satu kelompok dengan isolat M. javanica asal Cina dan terpisah dari kelompok M. javanica lainnya yang terdiri atas spesies M. javanica dari negara lain. Hal ini menunjukkan bahwa spesies M. javanica Cianjur, Jawa Barat memiliki tingkat kekerabatan lebih dekat dengan M. javanica asal Cina dibanding dengan spesies M. javanica asal negara lain (Gambar 11).
M. javanica merupakan spesies nematoda dengan sebaran yang sangat luas dari daerah tropis hingga subtropis, kisaran inang yang beragam dan menyebabkan kerusakan yang signifikan pada berbagai jenis tanaman sayuran. Secara ekologi M. javanica dapat hidup pada suhu antara 10–35 oC (Stephan 1982).
PCR yang telah dilakukan menggunakan primer multipleks yaitu JMV1, JMV2 dan JMV hapla untuk mendeteksi spesies M. fallax, M. chitwoodi dan M. hapla. Primer ini berhasil mengamplifikasi pita DNA berukuran 440 pb untuk M. hapla dan tidak berhasil mengamplifikasi pita DNA berukuran 540 pb untuk M. chitwoodi maupun 670 pb untuk M. fallax (Gambar 10). Hasil ini menunjukkan bahwa sampel DNA yang dideteksi hanya M. javanica dan M. hapla.
Keberadaan M. hapla ini juga diperkuat oleh analisis homologi sekuen nukleotida. Melalui analisis tersebut terlihat bahwa NPA asal Cianjur, Jawa Barat memiliki tingkat kemiripan yang sangat tinggi dengan spesies M. hapla asal Magelang, Jawa Tengah begitu juga dengan spesies M. hapla dari negara lain tingkat kemiripan antara 99.4% hingga 100% sedangkan dengan spesies lain (M. javanica, M. arenaria dan M. incognita) tingkat kemiripannya antara 42.3% dan 53% (Tabel 5).
Berdasarkan hasil analisis filogenetik sekuen nukleotida menunjukkan bahwa isolat M. hapla asal Cianjur, Magelang menjadi satu kelompok tersendiri dengan isolat M. hapla asal Inggris, Amerika, Cina, Australia dan Hawai dan terpisah dari kelompok M. hapla asal Swiss (Gambar 12).
Tabel 5 Homologi sekuen nukleotida DNA M. hapla Cianjur, Jawa Barat dengan sekuen DNA yang ada di GenBank
Isolat No Akses Homologi M. hapla Jawa Barat (%)
M. hapla Magelang - 100
M. hapla Cina GQ130136.1 100
M. hapla Inggris AJ421707.1 100
M. hapla Amerika AY528418.1 99.7
M. hapla Swiss GQ395563.1 99.4
M. javanica JN005834.1 42.3
M. arenaria EF612714.1 52.7
M. incognita KF053036.1 53.0
22
M. hapla adalah salah satu spesies Meloidogyne yang dapat bertahan pada suhu dingin dan menginfeksi tanaman sayuran dan dapat bertahan hidup pada
suhu 4 oC hingga 20 oC (Das et al. 2011). M. hapla juga termasuk organisme OPTK A2 (sudah ada di Indonesia dan terbatas), daerah sebarannya adalah Jawa.Hasil laporan sebelumnya, M. hapla telah menginfeksi pertanaman wortel di Jawa Timur (Hikmia et al. 2012) dan Jawa Tengah (Taher et al. 2013). Namun menurut www.plantwise.org, wilayah Indonesia yang sudah terinfeksi M. hapla adalah Makassar, Sulawesi Selatan dan Yogyakarta, Jawa Tengah.
Berdasarkan hasil penelitian ini, M. hapla juga ditemukan di Jawa Barat, di daerah Agropolitan Cianjur. Hasil runutan DNA menunjukkan isolat M. hapla
Cianjur, Jawa Barat memiliki tingkat homologi yang sangat dekat dengan M. hapla dari negara lain. Hasil analisis filogenetik menggambarkan M. hapla asal Cianjur, Jawa Barat dan Magelang, Jawa Tengah relatif tidak berbeda dengan M. hapla asal negara lain (Cina, Inggris, Hawai, Australia,Amerika dan Swiss). Diduga M. hapla telah lama masuk ke Indonesia dan terjadi perubahan genetik dalam rangka penyesuaian diri terhadap lingkungan di Indonesia. Data BPS (2005) menyebutkan bahwa Cina, Inggris, Amerika, dan Swiss merupakan beberapa negara pemasok wortel bagi Indonesia. Diduga umbi wortel merupakan media pembawa spesies M. hapla yang menginfeksi pertanaman wortel di Jawa Barat dan Jawa Tengah.
Amplifikasi PCR menggunakan primer Far/ Rar untuk spesies M. arenaria
dan primer Finc/ Rinc untuk spesies M. incognita tidak berhasil mengamplifikasi pita DNA. Diduga ketika melakukan ekstraksi DNA dari Meloidogyne betina, spesies M. incognita dan M. arenaria tidak ada.
Tingginya tingkat kemiripan sekuen nukleotida yang dimiliki, diduga spesies M. hapla berasal dari sumber yang sama dan terjadi variasi genetik. Agrios (2005) mengemukakan bahwa ada 3 faktor yang harus dimiliki oleh patogen untuk dapat menginfeksi tanaman yaitu kemampuan penetrasi dan menginfeksi tanaman, kemampuan untuk mengatasi ketahanan tanaman, dan terakhir kemampuan patogenesis. Sinaga (2003) juga menyatakan bahwa perubahan-perubahan yang terjadi pada patogen, dapat meningkatkan sifat patogenesisnya sehingga suatu saat dapat membentuk strain baru yang virulen dan dapat menginfeksi inang yang resisten.
Gambar 12 Pohon filogenik spesies M. hapla yang menginfeksi pertanaman wortel di Cianjur, Jawa Barat
M hapla Australia M hapla Swiss M hapla Magelang M hapla Cianjur M hapla Hawai M hapla Cina M hapla Inggris M hapla Amerika M javanica 0.1 M. hapla M. hapla M. hapla M. hapla M. hapla M. hapla M. hapla M. hapla M. javanica
23